Denne protokol beskriver brugen af genetisk kodet Ca2 + journalister til at registrere ændringer i neurale aktivitet i opfører sig Caenorhabditis elegans orme.
Det er blevet stadig mere klart, at neurale kredsløb aktivitet i opfører dyr afviger betydeligt fra den, set i bedøvede eller immobiliseret dyr. Meget følsom, genetisk kodet fluorescerende indberettere af Ca2 + har revolutioneret optagelse af celle og synaptic aktivitet ved hjælp af ikke-invasive optisk tilgange i opfører dyr. Når det kombineres med genetiske og optogenetic teknikker, de molekylære mekanismer der modulere celle og kredsløb aktivitet under forskellige adfærd stater kan identificeres.
Her beskriver vi metoder for ratiometric Ca2 + billeddannelse af enkelt neuroner i frit opfører Caenorhabditis elegans orme. Vi demonstrere en enkel montering teknik, der forsigtigt overlays orme vokser på en standard Nematode vækst medier (NGM) agar blokere med et glas coverslip, tillader dyr registreres på høj opløsning under ubegrænset bevægelighed og adfærd. Med denne teknik bruger vi den følsomme Ca2 + reporter GCaMP5 til at registrere ændringer i intracellulære Ca2 + i den serotonerge hermafrodit specifikke neuroner (HSNs), som de kører æglægning adfærd. Co udtrykke mCherry, en Ca2 +-ufølsom fluorescerende proteiner, kan vi spore placeringen af HSN inden for ~ 1 µm og korrekt for udsving i fluorescens forårsaget af ændringer i fokus eller bevægelse. Samtidige, infrarød brightfield imaging giver mulighed for opførsel optagelse og animalske sporing ved hjælp af en motoriseret fase. Ved at integrere disse mikroskopiske teknikker og data-streams, kan vi registrere Ca2 + aktivitet i C. elegans æglægning kredsløb som det udvikler sig mellem inaktive og aktive adfærd stater over snese minutter.
Et centralt mål i neurovidenskab er at forstå, hvordan neuroner kommunikerer i kredsløb til at drive dyrs adfærd. Neurale kredsløb integrere en række forskellige sensoriske signaler for at ændre kredsløb aktivitet, dermed kørsel adfærdsmæssige ændringer nødvendige for dyr til at reagere på deres omgivelser. Fyrretræsnematoden, C. elegans, har en simpel nervesystemet med 302 neuroner hvis synaptiske forbindelser har været helt kortlagt1. Gener, der koder for proteiner involveret i neurotransmission bevares desuden meget mellem C. elegans og pattedyr2. Trods den anatomiske enkelheden i sit nervesystem viser det en kompleks repertoire af opbevaret adfærd giver en frugtbar platform for at forstå hvordan neuroner regulere adfærd3.
C. elegans er åbne over for anvendelsen af en bred vifte af tilgange såsom genmanipulation, laser celle ablation, elektrofysiologiske teknikker, såvel som i vivo optisk tænkelig4,5. Nylige undersøgelser har udarbejdet detaljerede kort over den store neurotransmitter signalering systemer i C. elegans herunder den kolinerge og GABAergic neuronal netværk. Disse undersøgelser, sammen med igangværende undersøgelser for at kortlægge udtryk for alle neuronal G-protein koblede receptorer placerer denne model i en unik position til at udnytte meget detaljerede strukturelle og funktionelle neuronal connectivity kort for fuldt ud at forstå, hvordan disse forskellige neurotransmittere signal gennem forskellige receptorer og tidshorisonter til at drive forskellige aspekter af dyrs adfærd.
For at studere dynamisk neuronal aktivitet mønstre i ethvert system, er en forudsætning at udvikle robuste metoder for at registrere aktivitet i individuelle neuroner eller hele kredsløb under opførsel. Særlig vigtigt er imødekommenhed af sådanne optiske tilgange til at visualisere præsynaptiske aktivitet, der driver synaptic vesikel fusion. Hurtig og meget følsomme fluorescerende indberettere af intracellulære Ca2 +, sammen med den øgede tilgængelighed af følsomme fotodetektor, har revolutioneret optagelse af celle og synaptic aktivitet i vågen, levende dyr under opførsel. Fordi et stort resultat af synaptic elektriske aktivitet er at regulere Ca2 + -kanaler, er ændringer i intracellulære Ca2 + tænkte trofast rapport behaviorally relevante ændringer i celleaktivitet.
I denne undersøgelse præsenterer vi en tilgang til at udføre ratiometric Ca2 + imaging i serotonerge HSN motoriske neuroner, der fremmer æglægning adfærd i C. elegans6,7. Denne tilgang bygger på tidligere bestræbelser på at visualisere Ca2 + aktivitet i C. elegans og æglægning kredsløbet under opførsel5,8,9,10,11 . Metoden giver mulighed for samtidig korrelere observerede ændringer i celle/kredsløb aktivitet med æglægning begivenheder, samt ændringer i animalsk bevægeapparatet tilstand. Selv om vi bruger denne fremgangsmåde til at undersøge aktivitet i voksne orme, viser upubliceret arbejde fra vores laboratorium denne tilgang kan udvides til at omfatte unge dyr på den fjerde larve (L4) fase samt. Det er sandsynligt, at aktiviteten af andre C. elegans neuroner, der fungerer i forskellige kredsløb og opførsel ligeledes tilgængelige med denne teknik. Anden nylig udviklet hurtigt Ca2 + indikatorer med ikke-overlappende emission spectra12,13,14,15,16, optogenetic værktøjer17 , og genetisk kodet optiske indikatorer membran spænding18, bør gøre det muligt for os at udføre gennemtrængende ‘all-optisk’ undersøgelser af hvordan ændringer i neurale kredsløb aktivitet drive forskellige adfærd stater.
Transgener:
Fordi mCherry udtryk er blevet forbedret gennem codon-optimering og intron indsættelse (og mest tilgængelige GCaMP journalister har ikke), injicere ~ 4 x mængden af GCaMP5-udtrykker plasmid at sikre sammenlignelige niveauer af GCaMP5 fluorescens under stærk Ca 2 + transienter. Redning af lin-15(n765ts) -mutationen giver mulighed for facile inddrivelse af transgene dyr med minimal effekt på ægproduktion og andre adfærd35. Transgener skal integreres for at sikre ensartet udtryk og imaging forhold mellem forskellige dyr25. Valgbare markører herunder antibiotikaresistens36,37 og redning af temperatur-følsomme lethals38 bør også arbejde, men fordi ikke-transgene dyr er døde, bekræftelse af transgenet integration og homozygocitet er vanskeligere i forhold til markører, der præsenterer en synlig fænotype25. Dominerende markører, at forstyrre normale bevægelse og mindske fitness, såsom rol-6(dm), bør undgås39. Imaging i lite-1 er mutant baggrund vigtigt at reducere blå lys undslippe svar under imaging23,40,41. Yderligere mutation af gur-3, som fungerer parallelt til lite-1, kan yderligere minimere resterende adfærd og fysiologiske ændringer forårsaget af blå lys42. Bekvemt, gur-3, lite-1og lin-15 er alle beliggende på den højre halvdel af kromosom X, som bør forenkle opbygningen af nye stammer til Ca2 + billedbehandling og optogenetic eksperimenter.
Fordi eksponeringstider er kort og billeder er indsamlet på 20 Hz, skal GCaMP5 og mCherry signaler være lyse. Den mest sandsynlige forklaring for støjende Ca2 + optagelser er dim fluorescens forårsaget af svage reporter udtryk. Projektlederne bør også være rimeligt specifikke for regionen at blive afbildet. Fordi HSN cellen kroppen og synapser på vulval musklerne er i midten af kroppen, yderligere udtryk fra nlp-3 initiativtageren i hoved og hale er typisk uden for synsfeltet og kan udelukkes ved hjælp af ekstra filtre i den Ratiometric kvantitering software. For at sikre, at observeret ændringer i GCaMP5 fluorescens resultatet fra egentlige ændringer i intracellulære Ca2 +, kontrol transgener udtryk for normal god landbrugspraksis i stedet for GCaMP5 bør udarbejdes selvstændigt og analyseret26. Nyere Ca2 + journalister med forskellige Ca-2 + følsomheder, kinetik og farver har udvidet valg af billedbehandling værktøjer til rådighed, men hver ny reporter skal valideres ved hjælp af Ca2 +-ufølsom fluorescerende variant14 ,16.
Medier:
NGM plader til billeddannelse udarbejdes med høj kvalitet agar. Lavere kvalitet agar vil ikke opløses fuldstændigt ved autoklavering, forlader små partikler at scatter lys under imaging, og øge baggrunden fluorescens. Molekylær biologi klasse Agarosen kan bruges i stedet, men tilsatte mængde bør reduceres for at opretholde tilsvarende plade fasthed.
Sammenligninger med andre montering metoder:
Tidligere tilgange til billede aktivitet i æglægning adfærd kredsløb har brugt orme immobiliseret med lim til en Agarosen pad. Under disse betingelser, kredsløb aktivitet og æglægning adfærd er ikke stillede uden en reduktion i dyrkningsmedier osmolaritet8,10,44,45. Seneste tyder på, at flere orm adfærd er moduleret af locomotion stat, rejser spørgsmål om forholdet af celleaktivitet observeret i immobiliseret dyr til den, set i frit opfører dyr. Vi har for nylig vist, at æg-æglæggende kredsløb aktivitet uventet gradvis med locomotion26,27. På samme måde, opdelte Ca2 + signalering i RIA interneuron integrerer aktivitet fra sensoriske neuroner og hoved motoriske neuroner under fouragering bevægelser46. Defækation adfærd er også ledsaget af en præcis og stereotype ændring i bevægelse, der giver mulighed for dyr til at bevæge sig væk fra deres fouragering stedet før udvisning affald47. Sammen, tyder disse resultater på, at korte optagelser af kredsløb aktivitet fra immobiliseret dyr kan være fundamentalt forskellige fra dem, der opnås i frit opfører dyr.
Trods direkte under en coverslip, ligner den orm adfærd, set på standard NGM plader. Lagt æg vil gå at klække, og den lille mængde af mad deponeret tillader L1 larver til at vokse op til voksne (data ikke vist). Store agar bid størrelse giver mulighed for rimelige gasudveksling og modstår dehydrering, selv om alt for meget mad vil øge baggrunden fluorescens. Mens denne metode fungerer bedst for voksne, kan teknikken også bruges til billede L4 dyr. Tykkelsen af den vandige lag mellem luns og coverslip er imidlertid sådan, at mindre larver har svært ved at kravle, og ofte bliver fanget i kølvandet på en bevægende voksen.
En begrænsning af denne montering teknik er, at direkte mekaniske eller kemiske stimulation til præcise regioner af kroppen er vanskeligt. Den seneste udvikling i mønstrede belysning teknikker mulighed for separate excitation af hoved eller hale-udtrykt mikrobielle opsins med separat belysning og påvisning af GCaMP/mCherry fluorescens i midbody48,49. Som et resultat, kan det være muligt at løse problemet ved hjælp af optogenetic tilgange.
Sammenligninger til andre Ca 2 + Imaging tilgange:
Denne metode fungerer meget godt for registrering af ændringer i cytoplasmatisk Ca2 + fra enkelt, løst celler og deres synaptic regioner. Real-time, volumetriske billeddannelse af neuroner i hovedet har for nylig opnået ved hjælp af placeringen af cellekerner til celle identifikation og kvantificere ændringer i nucleoplasmic calcium50,51,52. Forholdet mellem nuklear og synaptic Ca2 + er fortsat uklart. Vores data tyder på den mest iøjnefaldende i HSN intracellulære Ca2 + sker ændringer på de præsynaptiske termini fra celle soma (figur 4D). De præsynaptiske termini HSN og VC neuroner er indlejret i det postsynaptiske vulval muskler26. Det er ikke klart, om der ville være tilstrækkelig opløsning i dimensionen Z engang med spinning disk eller lys ark teknikker til at tilskrive præsynaptiske Ca2 + signaler til bestemte celler uden at påberåbe på nogle måde somatiske calcium til celle identifikation . Ved hjælp af teknikkerne, der beskrives her, hver 10 min, to-kanals optagelse med 12,001 256 x 256 16-bit pixel TIFF billeder er ~ 4 GB. Forholdet og intensitet moduleret forholdet kanaler dobbelt filstørrelse til ~ 8 GB. En typisk eksperiment optagelse 10 dyr fra hver af to genotyper (wild-type og eksperimentel) genererer næsten 150 GB af primære data og kræver 20 h til at indsamle og analysere. Volumetrisk analyser med 10 Z skiver pr. tidspunkt ville kræve en størrelsesorden mere data og analytiske tid, forklarer, hvorfor så få sådanne undersøgelser er blevet gennemført.
Hardware:
Vi registrere og analysere billedsekvenser på dual processor arbejdsstationer med høj ydeevne (fx gaming) grafikkort, 64 GB RAM, og højtydende solid state drev (Se Tabel af materialer). Data skal lagres på netværksbaserede redundant array af uafhængige diske (RAID) og bakkes op i skyen på en off-site datacenter.
Vi anbefaler brug af high-power kollimeret lysdioder for pulserende fluorescens excitation over metalhalogen eller kviksølv-baseret lyskilder. Flere kommercielt tilgængelige multi-farve LED-systemer er tilgængelig. Mens nogle af disse LED-systemer har en højere upfront omkostninger, kan de har en lang levetid (> 20.000 h), samtidig excite fire eller flere forskellige fluorophores og tilbyde præcis tidsmæssige kontrol bruge en seriel og/eller TTL interface med lav latency (10-300 µs skifte tid). Udløser sikrer, at prøven er kun belyst når data er faktisk opkræves. Vi bruger typisk en 10 ms eksponering hver 50 ms (20% sats). Dette reducerer fototoksicitet og Bevægelsessløring under billedoptagelse, som tidligere rapporteret43.
Vi bruger sCMOS kameraer for deres hastighed og bred vifte af små, følsomme pixels. En EM-CCD kamera er en dyrere alternativ, men ‘flor’ effekter kan resultere i erobrede photoelectrons breder i tilstødende pixel. Ny back-belyste sCMOS kameraer har lignende lysfølsomhed af EM-CCD’er ved betydeligt reduceret pris. Uanset skal hvilken sensor bruges, GCaMP5 og mCherry kanalerne indhentes samtidig. Sekventiel opsamling i flytter orme vil føre til dårligt registreret billeder uegnet for ratiometric kvantificering. Dual channel imaging kan udføres på et enkelt kamera efter opdeling af kanaler ved hjælp af et image splitter (figur 2) eller ved hjælp af to identiske kameraer. Det dynamiske område af 16-bit-billeder anbefales over 8-bit billeder for nøjagtig ratiometric kvantitering. For brightfield billeder af ormen adfærd fange vi ved hjælp af en 1 i. 4.1 MP nær-infrarødt USB3 kamera til at indfange store 2 x 2 arkiveret lodret 1.024 x 1.024 8-bit billedsekvenser efter JPEG-komprimering. Den større FOV tilgængelig på nyere mikroskop modeller tillader en voksne orm til visualiseres på 20 x efter 0.63 x demagnification med kun let vignettering (figur 4E).
Vi anbefaler at bruge standard TTL spænding signaler til at synkronisere belysning og ramme fange. På grund af potentielle ventetid i forskellige softwareprogrammer anbefaler vi brugere konfigurere fluorescens kamera med udløser udgange som master med TTL udgange køre alle andre enheder. På denne måde, vil blive indsamlet brightfield og fase positionsoplysninger for hver Ca2 + måling.
Slids- eller resonant punkt-scanning Konfokal mikroskoper typisk findes i Konfokal fællesfaciliteter også giver fremragende ydeevne under ratiometric Ca2 + billeddannelse. Sådanne instrumenter kan bruges til at fange to eller flere fluorescens kanaler sammen med brightfield24. I dette tilfælde Konfokal pinhole bør åbnes til sin maksimale diameter, og en spektral detektor skal anvendes til at adskille GCaMP5, mCherry og infrarød brightfield signaler. Dette maksimerer lys indsamling fra en tyk (~ 20 µm) skive mens det stadig tillader afvisning af out-of-fokus fluorescens. En ulempe er den mindre FOV og flere begrænsninger for tilpasning af hardware og software.
Software:
De fleste producenter leverer og installerer deres kameraer og mikroskoper med leverandørejet software, herunder konfiguration af udløser input og output. Funktioner og ydeevne af denne software under optagelsen kan variere. Fordi hurtigt flytte orme kan være udfordrende for at spore, image display under optagelse skal være jævn og stabil på 20 Hz. For at forbedre ydeevnen, kan billedsekvenser blive midlertidigt gemt i RAM med behaviorally relevante delmængder gemt i slutningen af forsøget. Disse to-kanals sekvens billedfiler kan konverteres til det åbne billedet flowcytometri Standard format (.ics) importeres til Ratiometric kvantitering software. OME-TIFF er en nyere open source billedformat, selv om forskellige installationer kan være afskåret fra opspare TIFF billedsekvenser større end 4 GB.
Et centralt element i kvantitering rørledningen er generation af forholdet kanal og derefter en upartisk billede segmentering procedure ved hjælp af mCherry fluorescens for at finde celler af interesse. Fra hver fundne objekt, objektstørrelse, XY barycentrum position og minimum, mener og maksimale fluorescens intensitetsværdierne for hver kanal (herunder forholdet kanal) beregnes. Sammen, bruges disse værdier til at kvantificere ændringer i intracellulære Ca2 + på hvert tidspunkt i optagelsen. Objektet målinger for hvert tidspunkt eksporteres derefter som a.csv fil for efterfølgende analyser.
En stor begrænsning af protokollen beskrevet her er afhængigheden af omflytning data i forskellige former gennem et kludetæppe af softwareprodukter. En ekstra irritation er, at nogle af software er open source og gratis, mens andre er lukkede, dyre og ulige opdateret. En væsentlig forbedring ville være at bruge eller udvikle et stykke software (ideelt åbne-kilde), som giver tilsvarende niveauer af ydeevne og lethed i brug fra erhvervelse til analyse. Som nævnt ovenfor, fordobler ratiometric analyse både filstørrelse og tid kræves for at fuldføre et eksperiment. Generation af kamera-drivere, der kan integreres i brugerdefinerbare rammer som Bonsai ville tillade billeder og andre datastreams skal indsamles og analyseres i realtid, væsentligt forbedre overførselshastighed.
Fremtidsudsigter:
Mens vi typisk spore orm bevægelser manuelt, sporing af ormen barycentrum opdaget i infrarød lyse eller mørke felter optagelser bør give mulighed for yderligere billed oparbejdelse noder, der leverer lukket kredsløb justering fase holdning og automatiseret tracking (figur 3 og data ikke vist). Fleste af fluorescens optagelserne indhentet med denne metode er mørke og blottet for biologisk interessante data. På sensor eller real-time efter købet billedbehandling teknikker, beskære billedsekvenser til relevante objekter ville give mulighed for øget rumlige opløsning og fremskynde data analyse pipeline, især hvis yderligere Z-skiver er indsamlet for hver tidspunkt at visualisere aktivitet inden for alle præ- og postsynaptiske celler i kredsløbet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra NINDS til KMC (R01 NS086932). LMN blev støttet af en bevilling fra NIGMS IMSD program (R25 GM076419). Stammer, der anvendes i denne undersøgelse C. elegans genetik Center, som er finansieret af NIH Office for forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Vi takke James Baker og Mason Klein til nyttige diskussioner.
C. elegans growth, cultivation, and mounting | |||
Escherichia coli bacterial strain, OP50 | Caenorhabditis Genetic Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1 |
HSN GCaMP5+mCherry worm strain | Caenorhabditis Genetic Center | LX2004 | Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN. Full genotype: vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X |
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation | author | LX1832 | Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request |
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid | author | pL15EK | Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request |
pKMC299 plasmid | author | pKMC299 | Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region |
pKMC300 plasmid | author | pKMC300 | Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P8281 | For preparation of NGM plates |
Potassium Phosphate Dibasic | Sigma | P5655 | For preparation of NGM plates |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 0662 | For preparation of NGM plates |
Calcium Chloride Dihydrate | Alfa Aesar | 12312 | For preparation of NGM plates |
Peptone | Becton Dickinson | 211820 | For preparation of NGM plates |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | For preparation of NGM plates |
Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | For preparation of NGM plates |
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure | Affymetrix | 10906 | For preparation of NGM plates |
60 mm Petri dishes | VWR | 25384-164 | For preparation of NGM plates |
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 | VWR | 48393-251 | Cover glass through which worms are imaged |
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 | VWR | 48366-067 | Cover glass that covers the top of the agar chunk |
Stereomicroscope with transmitted light base | Leica | M50 | Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting |
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm | ALFA AESAR | AA39526-BW | For worm transfer |
Calcium imaging microscope | |||
Anti-vibration air table | TMC | 63-544 | Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top |
Inverted compound microscope | Zeiss | 431007-9902-000 | Axio Observer.Z1 inverted microscope |
Sideport L80/R100 (3 position) | Zeiss | 425165-0000-000 | To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera |
Tilt Back Illumination Carrier | Zeiss | 423920-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Lamphousing 12V/100W w/ Collector | Zeiss | 423000-9901-000 | For infrared/behavior imaging |
Halogen lamp 12V/100W | Zeiss | 380059-1660-000 | For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter |
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp | Zeiss | 447958-9000-000 | BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior |
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized | Zeiss | 424244-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Condenser & Shutter | Zeiss | 423921-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera | Zeiss | 425536-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Eyepiece 10x, 23mm | Zeiss | 444036-9000-000 | For worm localization on the agar chunk |
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier | Zeiss | 426113-0000-000 | Mount for infrared CMOS camera |
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) | FLIR (formerly Point Grey Research) | GS3-U3-41C6NIR-C | Camera for brightfield imaging |
USB 3.0 Host Controller Card | FLIR (formerly Point Grey Research) | ACC-01-1202 | Fresco FL1100, 4 Ports |
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector | FLIR (formerly Point Grey Research) | ACC-01-3000 | Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5 |
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 | Zeiss | 420650-9901-000 | Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance |
6-cube Reflector Turret, Motorized | Zeiss | 424947-0000-000 | For fluorescence imaging |
Fluorescence Light Train, Motorized | Zeiss | 423607-0000-000 | For fluorescence imaging |
Fluorescence Shutter | Zeiss | 423625-0000-000 | For fluorescence imaging |
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) | Zeiss | 489062-9901-000 | FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging |
LED illumination system | Zeiss | 423052-9501-000 | Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination |
GFP LED module (470 nm) | Zeiss | 423052-9052-000 | Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation |
mCherry LED module (590 nm) | Zeiss | 423052-9082-000 | Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation |
Iris stop slider for incident-light equipment | Zeiss | 000000-1062-360 | Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view |
C-Mount Adapter 1" 1.0x | Zeiss | 426114-0000-000 | Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera |
Image splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras |
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) | Semrock | Di02-R594-25×36 | Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals |
GFP emission filter (image splitter) | Semrock | FF01-525/30-25 | Capturing GCaMP5 fluorescence |
mCherry/ emission filter (image splitter) | Semrock | FF01-647/57-25 | This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging |
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) | Hamamatsu | A12802-01 / C11440-22CU | Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter |
Motorized XY Stage | Märzhäuser | SCAN IM 130 x 100 | Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step |
XY Stage controller with joystick | LUDL | MAC6000, XY joystick | Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud |
Digital Acquisition board (DAQ) | Arduino | Uno | Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud |
BNC Male to BNC Male Cable – 6 ft | Hosa Technology | HOBB6 | BNC connectors for TTL triggering |
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") | uxcell | 608641773651 | To connect the fluorescence camera trigger outputs |
BNC turn head adapter | Hantek | RRBNCTH21 | BNC to Banana Plug Adapter (4mm) |
BNC female to female connector | Diageng | 20130530009 | Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug |
Solderless flexible breadboard jumper wires | Z&T | GK1212827 | To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ. Male to male. |
High performace workstation | HP | Z820 | Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives |
M.2 Solid state drive | Samsung | MZ-V5P512BW | High-speed streaming and analysis of image data |
M.2 Solid state drive adapter for workstations | Lycom | DT-120 | M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter |
Network attached storage | Synology | DS-2415+ | Imaging data storage and analysis |
Hard disk drives | Western Digital | WD80EFZX | RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy) |
Software | |||
Fluorescence Acquisition | Hamamatsu | HCImage DIA | Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps |
Brightfield Acquisition | FLIR (formerly Point Grey Research) | Flycapture | Recording of brightfield JPEG image sequences |
Stage Serial Port Reader | Bonsai | https://bitbucket.org/horizongir/bonsai | Facilitates tracking of worms during behavior |
LED controller software | Zeiss | Micro Toolbox Test 2011 | To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit |
ImageJ | NIH | https://imagej.net/Fiji/Downloads | Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software |
Excel | Microsoft | 2002984-001-000001 | For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis |
Peak Finding | MATLAB | R2017a | Script used for Ratio peak feature calculations |
Ratiometric Quantitation | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects |
Scripts | |||
AnalyzeGCaMP_2017.m | MATLAB | Mean Ratio and XY centroid script | Analyzes a ratiometric output in .csv format, consolidating objects and centroid positions, calculating ratio changes (∆R/R), identifying peaks and peak features, and writing plots (with and without annotated peaks) in postscript format. For matrix file import, the script will output data into three folders: analyzed, peaks, and traces. 'Analyzed' output is a matrix file of the consolidated objects with six columns (units): time (s), area (square microns), ratio, X centroid (microns), Y centroid (microns), and ∆R/R. 'Peaks' output is a matrix file of the timepoints of found peaks, the amplitude (in ∆R/R), the peak width (s), and the prominance of the peak. 'Traces' output are postscript files of calcium traces. |
XY-stage-final.bonsai | Bonsai | TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader | Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps). X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. |