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Neuroscience

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

doi: 10.3791/56911 Published: February 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von genetisch codierte Ca2 + Reporter Datensatzänderungen in neuronale Aktivität im Verhalten Caenorhabditis Elegans Würmer.

Abstract

Es wurde immer deutlicher, dass neuronale Schaltkreis Aktivität im Verhalten der Tiere deutlich gesehen bei narkotisierten oder immobilisiert Tieren unterscheidet. Hochsensiblen, genetisch codierte fluoreszierende Reporter von Ca2 + revolutionierten die Aufzeichnung von Zelle und synaptische Aktivität mit nicht-invasiven optischen Ansätzen im Verhalten der Tiere. In Kombination mit genetischen und optogenetische Techniken, die molekularen Mechanismen zu modulieren, die Zelle und Schaltung Tätigkeit während unterschiedliches Verhalten Staaten identifiziert werden können.

Hier beschreiben wir Methoden für die ratiometrischen Ca2 + Bildgebung von einzelnen Neuronen im frei Verhalten Caenorhabditis Elegans Würmer. Wir zeigen eine einfache Montage-Technik, die sanft Überlagerungen Würmer wachsen auf einem standard Nematoden Wachstum Medien (NGM)-Agar mit einem Deckgläschen Glas block erlaubt Tiere bei erfasst werden hochauflösende während uneingeschränkte Bewegungsfreiheit und Verhalten. Mit dieser Technik verwenden wir die sensiblen Ca2 + Reporter GCaMP5 Änderungen in intrazellulären Ca2 + in den serotonergen Zwitter bestimmte Neuronen (HSNs) aufzeichnen, wie sie eierlegende Verhalten fahren. Zusammenarbeit zum Ausdruck bringen, mCherry, Ca2 +-unempfindlich fluoreszierenden Proteins, verfolgen wir die Position der HSN innerhalb von ~ 1 µm und korrekte Schwankungen der Fluoreszenz durch Veränderungen im Fokus oder Bewegung verursacht. Gleichzeitige, Infrarot-Hellfeld-Bildgebung ermöglicht Verhalten Aufnahme und Tier-Tracking mit einem motorisierten Stadium. Durch die Integration dieser mikroskopischen Techniken und Daten-Streams, können wir Ca2 + Aktivität in C. Elegans eierlegende Schaltung aufnehmen, wie sie zwischen inaktiven und aktiven Verhalten mehr als zehn Minuten fortschreitet.

Introduction

Ein zentrales Ziel der Neurowissenschaften ist zu verstehen, wie Nervenzellen kommunizieren bei Leitungen in Laufwerk Tierverhalten. Neuronale Schaltkreise integrieren, eine Reihe von unterschiedlichen sensorischen Signale um Schaltung Tätigkeit, damit fahren Verhaltensänderungen notwendig für Tiere reagieren auf ihre Umgebungen zu ändern. Der Fadenwurm C. Elegans hat ein einfaches Nervensystem mit 302 Neuronen deren synaptischen Verbindungen vollständig zugeordneten1gewesen sein. Darüber hinaus sind Gene, die kodieren für Proteine, die in Neurotransmission zwischen C. Elegans und Säugetiere2hoch konserviert. Trotz der anatomischen Einfachheit des nervösen Systems zeigt es ein komplexes Repertoire an konservierten Verhaltensweisen, die eine fruchtbare Plattform um zu verstehen, wie Neuronen Verhalten3regulieren.

C. Elegans ist offen für die Anwendung einer Vielzahl von Ansätzen wie Genmanipulation, Zelle Laserablation, elektrophysiologische Techniken, sowie in Vivo optische Bildgebung4,5. Jüngste Studien haben detaillierte Karten des wichtigen Neurotransmitters Signaltechnik in C. Elegans einschließlich der cholinergen und GABAerge neuronale Netze hergestellt. Diese Studien zusammen mit laufenden Studien den Ausdruck alle neuronalen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zuordnen legen Sie dieses Modell in einer einzigartigen Position zu nutzen, sehr detaillierte strukturelle und funktionelle neuronale Verknüpfung Karten, um vollständig zu verstehen wie diese verschiedene Neurotransmitter Signal durch verschiedene Rezeptoren und Fristen zu fahren verschiedene Aspekte des Tierverhaltens.

Um dynamische neuronale Aktivitätsmuster in jedem System zu studieren, ist eine wesentliche Voraussetzung, robuste Methoden zum Aufzeichnen der Aktivität in einzelnen Neuronen oder ganze Schaltungen während Verhaltensweisen zu entwickeln. Besonders wichtig ist die Bereitschaft solche optischen Ansätze zur präsynaptischen Aktivität zu visualisieren, die Fusion der synaptischen Vesikel antreibt. Schnell und hochsensiblen fluoreszierende Reporter der intrazellulären Ca2 +, sowie die zunehmende Verfügbarkeit von empfindliche Photodetektoren, revolutionierten die Aufzeichnung von Zelle und synaptische Aktivität bei wach, lebendigen Tieren während Verhalten. Weil ein wichtiges Ergebnis der synaptischen elektrische Aktivität Ca2 + -Kanälen zu Regeln ist, werden Änderungen in intrazellulären Ca2 + treu verhaltensrelevanten relevante Änderungen in Zell-Aktivität gedacht.

In dieser Studie stellen wir einen Ansatz zur ratiometrischen Ca2 + Bildgebung in der serotonergen HSN Motoneuronen durchführen, die Eiablage Verhalten in C. Elegans6,7zu fördern. Dieser Ansatz stützt sich auf frühere Bemühungen, Ca2 + Aktivität in C. Elegans und die Eiablage Schaltung während Verhalten5,8,9,10,11 visualisieren . Die Methode erlaubt es, gleichzeitig die beobachteten Veränderungen der Zelle/Schaltung Tätigkeit mit Eiablage Veranstaltungen sowie Zustandsänderungen tierischen Bewegungsapparat korrelieren. Obwohl wir diesen Ansatz verwenden, um Aktivität in adulten Würmern zu studieren, zeigt unveröffentlichtes Werk aus unserem Labor, dass dieser Ansatz bei der vierten (L4) Larvenstadium sowie auf juvenile Tiere ausgedehnt werden kann. Es ist wahrscheinlich, dass die Aktivität von anderen C. Elegans Neuronen, die in verschiedene Schaltungen und Verhaltensweisen funktionieren mit dieser Technik gleichermaßen zugänglich sein sollten. Andere Industrieländer vor kurzem schnellere Ca2 + Indikatoren mit nicht überlappenden Emissionsspektren12,13,14,15,16, optogenetische Werkzeuge17 , und genetisch codiert optische Indikatoren der Membran Spannung18, sollte uns erlauben, durchdringende rein optischen Untersuchungen wie Veränderungen der neuronalen Schaltung Tätigkeit unterschiedliche Verhalten Staaten fahren durchführen.

Protocol

(1) Stämme, Kultur, Medien und Montage von Tieren

  1. Wachsen Sie C. Elegans Würmer bei 20 ° C auf standard 60 mm Nematoden Wachstum Medium (NGM) Agarplatten mit OP50 E. Coli Bakterien Nahrung19ausgesät.
  2. Bereiten Sie zwei Plasmide für jedes zellspezifische Promoter von Interesse: einerseits der Ausdruck GCaMP5, Rekord intrazellulären Ca2 +und der zweite Ausdruck der mCherry für ratiometrischen Quantifizierung von GCaMP5 Fluoreszenz Änderungen ermöglichen fahren fahren und vereinfachen Sie Objekt Feststellung und Messung.
    Hinweis: GCaMP5:mCherry ratiometrischen Bildgebung für Schwankungen im GCaMP5 Fluoreszenz, die Folge von Veränderungen im Fokus und Tier Bewegung, nicht die tatsächlichen Änderungen in intrazellulären Ca2 +korrigiert.
  3. GCaMP5 und mCherry-exprimierenden Plasmiden zusammen mit der pL15EK sichtbar Rettung Marker Plasmid in den Gonaden LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X mutierte Tiere injizieren und nicht-Muv lin-15(+) Tiere mit dem Ausdruck GCaMP5 zu erholen und mCherry aus einem hoch-Kopie Transgen20,21,22. Verwenden Sie die lite-1 mutant Hintergrund um Blaulicht-Vermeidung Verhalten23,24zu reduzieren.
  4. Transgene auf Chromosomen Mosaikbildung reduzieren und vereinfachen die Generation der zusammengesetzten mutierte Stämme25zu integrieren.
    Hinweis: Die hier beschriebenen LX2004 Stamm trägt eine integrierte High-Kopie-Transgen, die GCaMP5 und mCherry in der HSNs aus dem Nlp-3 -Promotor ausdrückt (siehe Tabelle der Materialien)26,27, 28 , 29. der Nlp-3 Projektträger wurde festgestellt, dass Laufwerk starken Ausdruck in der HSNs des späten L4 und adulte Tiere ohne verursacht erhebliche Mängel in der Entwicklung von HSN oder eierlegende Verhalten im Vergleich zu anderen Veranstaltern (e.g.,tph-1 getestet, EGL-6und Unc-86). Diese Sorte und andere, die GCaMP5 und mCherry in der ventralen Schnur (VC) Motoneuronen Vulvaregion Muskeln und uv1 neuroendokrine Zellen Ausdrücken gibt es vom Caenorhabditis Genetik Zentrum und Einzelheiten ihrer Konstruktion sind beschrieben worden 27.
  5. Gelten OP50 bakterielle Essen aus einer kernigen NGM-Agar-Platte an der Unterseite des Platin-Wurm zu holen, und verwenden Sie es übertragen ~ 20 späten L4 LX2004 Tiere, die GCaMP5 und mCherry in der HSNs aus dem Nlp-3 -Promotor ausdrücken. Sicherstellen Sie, dass die Entwicklung Vulva in einem Stereomikroskop als einen klaren dunklen Fleck, umgeben von einem weißen Halbmond erscheint. Inkubieren Sie Tiere bei 20 ° C für 24-40 h.
  6. Nach der Inkubation OP50 gelten für die Abholung und Transfer ~ 3 der Würmer auf eine ungesetzte NGM-Platte, so dass eine kleine Menge an Nahrung hinter die Würmer auf während der Bildgebung zu füttern. Achten Sie darauf ausreichend Nahrung, zu wenig bakterielle Nahrung fördert die Würmer, Weg von der Mitte der Platte zu wandern, während zu viel Nahrung Hintergrundfluoreszenz erhöht und Hypoxie verursachen.
  7. Mit einem Spatel flach gerundete schneiden ein ~ 20 x 20 mm Brocken aus der Platte tragen die Würmer und übertragen den Brocken verdeckt in die Mitte von einem sauberen 24 x 60 mm #1.5 Deckgläschen (Abbildung 1). Starten Sie die Anwendung von einer Seite zur Bläschen verhindern gefangen unter dem Deckglas und störende mit Bildgebung. Gelten Sie ein 22 x 22 mm #1-Deckglas auf den Gipfel des Brocken, kleben und Verdunstung zu reduzieren.

2. Hardware und Instrumentierung Setup

  1. Legen Sie die inszenierten, transgenen Würmer auf der Bühne von einem inversen Mikroskop mit einem ≥ 0,7 numerische Apertur Plan-Apochromat 20 x Objektiv, motorisierten Kreuztisch steuerbar mit einem Joystick, eine Bild-Splitter und Fluoreszenz Filter für gleichzeitige GCaMP5 und mCherry Anregung und Emission, Kameras für Fluoreszenz und Infrarot Hellfeld imaging und einem triggerbare Light Emitting Diode (LED)-Beleuchtungssystem (Abb. 2A).
    Hinweis: Eine 80/20-Strahlteiler sendet das Bildsignal zur Fluoreszenz Kamera 80 % und 20 % auf die Hellfeld-Kamera. Eine aufrechte Mikroskop kann auch verwendet werden, aber der NGM Klumpen in diesem Fall zwischen einem Objektträger und große Deckglas gelegt werden sollte.
    1. Verwenden Sie die binokularen Okulare um ein Wurm für die Bildgebung auszuwählen. Wenn ein Tier ausgewählt ist, schieben Sie den Infrarot-Filter im Ort über den Kondensator.
  2. Transistor-Transistor-Logik (TTL)-Triggern
    1. Befestigen Sie Koaxialkabel aus jeder der drei TTL Trigger Ausgangsleitungen auf der Fluoreszenz Kamera. Die erste Ausgabe an den BNC-Eingang #3 des LED-Beleuchtungssystems anschließen.
    2. Verbinden Sie den zweiten Ausgang an einen BNC-'Banane'-Adapter mit grünen und braunen Drähte aus der 8-Pin GPIO Anschluss ausgeführt, GPIO Eingang #3 (Pin 4) und Masse (Pin 5) der Infrarot-Kamera, beziehungsweise.
    3. Verbinden Sie den dritten Ausgang an einen BNC-'Banane'-Adapter mit Jumper Kabel an den digitalen Eingang #8 und Boden in der digitalen Erfassungsgerät (Abbildung 2B).
  3. Digitalen Erfassungsgerät (DAQ)
    1. Der DAQ-Mikrocontroller-Board zu verbinden (siehe Tabelle der Materialien) über ein USB-Kabel mit dem PC. Aktualisieren Sie die Firmware mit dem Standard Firmata Protokoll (siehe Tabelle der Materialien) und konfigurieren Sie den USB-Port kommunizieren mit 57600 Baud.
  4. LED
    1. Die LED-Controller-Software ausführen (siehe Tabelle der Materialien). Schalten Sie den Trigger-Modus von "Fortlaufend,"Gated"und wählen Sie Triggerkanal 3" für die 470 und 590 nm-LEDs.
    2. Schalten Sie ein und geben Sie LED-Power für jede LED (z. B. Satz der 470 nm LED auf 20 % und die 590 nm-LED auf 40 %).
  5. Laufen Sie die Serien-Bühne Kommunikation Skript "XY-Bühne-Final" in Bonsai (siehe Tabelle der Materialien)30. Klicken Sie auf das graue "CsvWriter" Knoten, und wählen Sie einen Ordner zum Speichern der aufgezeichneten Informationen (Abbildung 3) X und Y zu inszenieren. Drücken Sie die grüne Pfeilspitze in der Symbolleiste, um die DAQ zu initialisieren.
    Hinweis: Das Skript startet die Aufnahme der X und Y Tischposition wenn die Fluoreszenz-Kamera ein TTL-Signal sendet. Dieses Skript gibt vier Spalten mit Daten: frame-Anzahl, X-Position (µm), Y-Position (µm) und des Intervalls zwischen den Frames (s).
  6. In der Infrarot-Kamera, die recording-Software (siehe Tabelle der Materialien) unter "Custom-Video-Modus" wählen Sie "Mode 1" (2 x 2 binning, 1.024 x 1.024 Pixel), und "Pixel-Format Raw 8". Unter "Trigger / Strobe", "3", die Polarität auf "High", "Mode" auf "14" Trigger-Eingabezeile (GPIO) gesetzt. Schalten Sie "Enable", Frame-Akquisition zu stoppen, bis ein TTL-Trigger-Signal empfangen wird.
    1. Das Fenster bleibt geöffnet, klicken Sie auf die rote "Record" Taste auf der Symbolleiste des Haupt-Kamera-Ansicht. Wählen Sie den Ordner für Bildsequenzen gespeichert werden. Wählen Sie "Buffered" Aufnahmemodus, und speichern Sie "Bilder" im JPEG-Format. Klicken Sie auf "Aufzeichnung starten", um die Übernahme zu initialisieren.
  7. Fluoreszenz-Kamera- und Bild-splitter
    Hinweis: GCaMP5 und mCherry-Fluoreszenz-Kanäle müssen gleichzeitig gesammelt werden, um korrekte Bild-Registrierung für ratiometrischen Quantifizierung zu gewährleisten. Ein Bild-Splitter erlaubt Zweikanal-Erwerb der GCaMP5 und mCherry Fluoreszenz auf einem Sensor.
    1. Im Register 'Capture' von der Bild-Datenerfassungs-Software (siehe Tabelle der Materialien), eingestellte Belichtungszeit bis 10 ms, binning, 4 X und Bildtiefe, 16-Bit. Wählen Sie eine zentrierte Kamera Unterarray von 512 x 256 Pixel hoch. Klicken Sie auf "Show Ausgabe Trigger-Optionen" und legen Sie alle Trigger auf "Positiv".
      Hinweis: Der DAQ kann gelegentlich TTL Trigger verpassen, wenn sie 10 ms oder weniger.
    2. Sicherstellen Sie, dass "Trigger 1" und "Trigger 2" auf "Exposition" festgelegt sind, während "Trigger 3" auf "Programmierbar" festgelegt ist mit einer Frist von 25 Ms. "Sequenz" auf der Registerkarte, wählen Sie "Zeitraffer" mit "Feld Delay1" von 50 ms, sammeln Bilder auf "Save 20 Hz. Select zu temporären Puffer."
  8. PMT gewinnen und laser-Intensität während der drei Kanal konfokale Bildgebung
    1. Stellen Sie PMT Gain, so ist die Hintergrundfluoreszenz auf einer Ebene nur über dem Minimum (Schwarzwert). 561 nm (grün) Laser-Energie zu erhöhen, bis ein einzelnes gesättigtes 12-Bit- oder 16-Bit-Pixel an der präsynaptischen Endstation im mCherry Kanal beobachtet wird.
    2. Einstellen Sie 488 nm (blau) Laserintensität so, dass GCaMP5 Fluoreszenz gerade an der präsynaptischen Endstation über Hintergrund sichtbar ist. Diese Einstellung "niedrig" wird verhindert, dass die Sättigung der GCaMP5 Pixel steigt die Fluoreszenz als Reaktion auf starke Ca2 + Transienten. Öffnen Sie die konfokale Lochblende bis hin zu leichten Gefangennahme zu maximieren.

(3) ratiometrischen Ca2 + Bildgebung und Verhalten Aufnahme

  1. Auf der Registerkarte "Sequenz" in der Fluoreszenz-Datenerfassungs-Software klicken Sie auf "Start", um die Aufnahme zu starten. Den Wurm mit dem Joystick, halten die Zellen und Synapsen von Interesse im Fokus und in der Mitte des das Sichtfeld (FOV) zu verfolgen. Klicken Sie auf 'Stats', im Fenster "Histogramm" Pixel-Statistiken der einzelnen Kanäle zeigen.
  2. Passen Sie die LED Power um eine maximale einzelne Pixel mCherry Fluoreszenz im präsynaptischen Terminus von ≥ 8.000 zählt sicherzustellen (~ 4.000 Photoelektronen), geben ein ~ 12-Bit Dynamikumfang über Hintergrund (~ 100 Photoelektronen). GCaMP5 Signale an der präsynaptischen Endstation bei ruhenden (niedrig) Ca2 + um sollte ~ 2.500 zählt - nur sichtbar über dem Hintergrund.
  3. Rekord bis eine eierlegende aktiven Zustand erreicht ist; Dies geschieht in der Regel alle 20-30 min in einem Wildtyp Wurm-7. Eine 10-min-Teilmenge (12.001 Bilder), 6.000 Bilder vor und nach der ersten Eiablage Veranstaltung (Frame 6.001) speichern. Achten Sie darauf, die gleiche Teilmenge von Hellfeld Bilder des Wurms Verhalten und Zeitpunkte der XY Tischposition zu halten, oder die präzise Synchronisation von Daten-Streams werden verloren gehen.
  4. ImageJ und das BioFormats-Plugin verwenden (siehe Tabelle der Materialien), Bildsequenzen in Image Cytometry Standard (.ics) Format zu konvertieren, so dass es in der ratiometrischen Quantifizierung-Software importiert werden kann.

4. Bild Segmentierung und Quantitative Analyse

  1. Die ratiometrischen Quantifizierung Software Bildsequenzen importieren (siehe Tabelle der Materialien). Klicken Sie auf "Auto-Kontrast" im Menü "Extras", und Kontrast der einzelnen Kanäle, geeignete schwarz zu etablieren (~ 1.800) und weiße Ebenen (10.000). Wählen Sie "Farben ändern..." im Menü "Extras" zu bestätigen, dass mCherry und GCaMP5 Kanal Farbzuweisungen korrekt (Abbildung 4A - C).
    1. Rechtsklick auf die Zeitreihen im Register "Sequenz" und setzen Sie ihn auf 20 Bilder/s und 1,25 µm/Pixel.
  2. Wählen Sie 'Ratio' aus dem Menü "Extras" und wählen Sie "GCaMP5" für "Kanal A" und "mCherry" für "Kanal B". Klicken Sie auf "Berechnen" neben "Schwellenwert" Hintergrund aus jedem Bildsequenz zu subtrahieren. Wählen Sie "Einen Regenbogen LUT der Verhältnis-Kanal zuweisen".
    Hinweis: Für eine Aufnahme mit einem mittleren Baseline Verhältnis von 0,3 (niedrige Ca2 +) und einen emax-Verhältnis von 2-3 (hohe Ca2 +), eine geeignete Lookup-Tabelle von 0 (blau), 1 (rot) wäre.
  3. Generieren Sie einen Intensität moduliert Verhältnis-Kanal mit dem mCherry-Kanal (Abbildung 4D). Der Intensitätsverhältnis moduliert-Kanal ist ein Millionen von Farben Bild wo die Verhältnis-Farbe auf die Helligkeit des mCherry Kanals abgebildet.
  4. Auf der Registerkarte "Messungen" erstellen Sie ein Objekt-Suche-Protokolls durch ziehen das Tool "Finden Sie Objekte mithilfe Intensität" zum Bereich "Protokoll". Klicken Sie auf das "Zahnrad" um das Fenster des mCherry Intensitätswerte und Objekte zu finden.
    1. Wählen Sie Intensität Werte ≥ 2 Standardabweichungen (SD) über Hintergrund (z. B. Untergrenze des ~ 2.500, Obergrenze von 65.535). Stellen Sie sicher das präsynaptischen Terminus wird erkannt und das "automatisch Rückmeldungen aktualisieren" aus dem Menü "Messungen" ausgewählt ist.
      Hinweis: Die Software kann auch Objekte durch ihre Standardabweichung vom Hintergrund mit einem entsprechenden Protokoll "SD Intensität." identifizieren Allerdings tritt ein besonders helles Objekt die FOV, kann es dramatisch verändern die mittlere Intensität während dieser Zeitpunkte, beeinflussen die Intensität Cutoffs verwendet, um die HSN finden. Diese Variabilität wird nicht auftreten, wenn roh Intensitätswerte verwendet werden, um Objekte zu finden.
  5. Fügen Sie zusätzliche Filter gezielt nur auf den mCherry Kanal (Max Intensität, Größe, etc.), ggf. unerwünschte Objekte wie Kopf, ausschließen tail und Darm Fluoreszenz. Wählen Sie "Machen Messung Element" aus dem Menü "Messungen" und wählen Sie "Alle Zeitpunkte."
    Hinweis: Dies führt das Protokoll schreiben alle Messungen in einer durch Kommas getrennten Wert (CSV) Datei, die mit dem Befehl "export" im Menü "Datei" exportiert werden sollen.
  6. Öffnen Sie exported.csv Datei und kopieren Sie Timepoint, Bereich (µm2) bedeuten (Verhältnis Kanal), Schwerpunkt X (µm) und Schwerpunkt Y (µm) Daten in ein neues Blatt. Export-a.csv-Datei ohne Spaltenüberschriften. Die ratiometrischen Quantifizierung Software kann eine Zelle von Interesse als ein oder mehrere Objekte pro Timepoint klassifizieren.
    1. Um diese Objekte zu rekombinieren, verwenden Sie ein benutzerdefiniertes Skript "AnalzyeGCaMP_2017.m".
      Hinweis: Das Skript auch Ca2 + (Verhältnis) Gipfeln in den Daten identifiziert, und speichert a.csv Datei ihrer Zeitpunkte, Peak Amplituden und breiten Gipfel. Es erzeugt auch PostScript-Dateien für das Verhältnis zwischen roh und kommentierten Spuren. Mit diesen Informationen sollte Ca2 + transiente Amplitude und Inter vorübergehende Intervall festgelegt werden.
  7. Hinzufügen der Ausgang X und Y Zentroid Werte aus jedem Fluoreszenz-Objekt die X und Y Werte vom Kreuztisch Skript von Bonsai. Verwenden Sie die Nettoposition XY spurlos Wurm Fortbewegung zu generieren und berechnen Zelle Hubraum und Geschwindigkeit, die unterschiedliches Verhalten Staaten31zu begleiten.
  8. Importieren Sie die aufgezeichneten Hellfeld-Bilder in ImageJ als virtuellen Stapel. Eiablage Veranstaltungen und andere Verhaltensweisen mit Anmerkungen versehen. Vergleichen Sie das Timing dieser Ereignisse mit Ca2 + Spitzen aus der Verhältnis-Ablaufverfolgung.

Representative Results

Die einfache Montage-Technik hier beschrieben (Abbildung 1) bewirkt, dass nur minimale Änderungen an der Kultur Umwelt L4 und Erwachsenen C. Elegans und ermöglicht hochauflösende Aufnahme im Verhalten der Tiere durch eine Glas-Deckglas (Abbildung 4). Synchronisierung von LED-Lichtquellen, Bühne-Controller und Kamera Aufnahmen ermöglicht für die Datenerfassung von mehreren Streams bei 20 Bilder/s bietet bis zu 1 h Intermediate Vergrößerung (20 X) mit hoher numerischer Apertur Ziele (0,7-0,8) gut räumliche Auflösung der synaptischen Region in der Eiablage Verhalten Schaltung, auch mit 4 x 4 Pixel binning (1,25 µm/Pixel). Simultane Erfassung von GCaMP5 und mCherry Fluoreszenz-Signalen (Abbildung 4A, B) wird verwendet, um einen Pixel für Pixel-Verhältnis-Kanal erzeugen, der Veränderungen in der Tierbewegungen und Fokus (Abbildung 4D) ausgleicht. Die HSN präsynaptischen Endstation ist so groß, wie viele neuronale Zellkörper in C. Elegansund Veränderungen im präsynaptischen HSN Ca2 + übersichtlich visualisiert werden können. Die großen FOV der Infrarot-Hellfeld-Kamera ermöglicht den Wurm zu manuell erfasst werden, während der Aufnahme (Abbildung 4E). Für jedes Tier können Änderungen im intrazellulären Ca2 + mit Verhaltensweisen im Hellfeld Bildgebung einschließlich Eisprung und Änderungen in Fortbewegung (Abbildung 4E) korreliert werden.

Quantifizierung von HSN Ca2 + und Geschwindigkeit bestätigt, dass die Würmer ihre Fortbewegung ändern, da sie zur Eiablage Verhalten Übergang. Es gibt erhebliche Unterschiede in der Geschwindigkeit der Wurm vor, während und nach der Eiablage Status "aktiv" (Abb. 5A). Dies wird nicht durch Lärm in der Bildgebung oder tracking-System verursacht. Zoomen in eine eierlegende Ereignis, wir beobachten eine starke Veränderung in GCaMP5 Fluoreszenz (ΔF/F) vor der Eiablage Veranstaltung während mCherry Fluoreszenz relativ ist unverändert (Abb. 5B). Gemessene Veränderungen im GCaMP5:mCherry Verhältnis (ΔR/R) zeigen deutlich eine HSN Ca2 + transiente ~ 4 s vor dem Eisprung (Abb. 5B). Deckungsgleich mit Vulvaregion Muskelkontraktion, tritt eine deutliche Verlangsamung der Wurm Fortbewegung, dass enden mit Ei freizugeben. Bisherigen Ergebnisse haben gezeigt, dass die cholinerge VC motorischen Neuronen, die durch die HSNs innerviert sind, während starker Vulvaregion Muskelkontraktionen und Ei Release 8,10,27Spitzenaktivität zeigen. Wir haben auch gezeigt, dass optogenetische Aktivierung der Neuronen VC treibt einen unmittelbaren Verlangsamung der Fortbewegung, was darauf hindeutet, dass die VC-Neuronen durch Vulvaregion Muskelkontraktion aktiviert werden können, dadurch langsamer Fortbewegung bis Rückmeldungen der Eisprung27 .

Die Bildgebung und tracking-System beschrieben ermöglicht die Visualisierung der räumlichen Organisation der Eiablage Verhalten (Abbildung 5C). Wie bereits gezeigt, Würmer geben Sie nachhaltige läuft vorwärts Fortbewegungsmittel kurz vor den Status "aktiv"32. Würmer verbringen den Großteil ihrer Zeit auf Futtersuche auf Bakterien in der Mitte der Agar-Chunks. Vor dem Eintritt in den aktiven Zustand bewegen Würmer aus der Nahrung, die deckungsgleich mit dem Auftreten von unregelmäßigen HSN Ca2 + Transienten ist. HSN Aktivität geht dann in Burst feuern, mit mehreren eng beieinander liegenden HSN Ca2 + Transienten, die Eiablage Veranstaltungen erhalten. Die Würmer dann oft umdrehen, fortgesetzt vorwärts Fortbewegung und Eiern auf den Weg zurück in ihre Ausgangsposition in der Nähe von OP50 Bakterien legen. Wir gehen davon aus, dass Veränderungen in lokalen O 2/CO2 -Konzentration oder wo die Würmer entscheiden, legen von Eiern33,34beeinflusst werden können.

Figure 1
Abbildung 1. C. Elegans Montage Technik für hochauflösende Bildgebung der Eiablage Schaltung Tätigkeit und Verhalten. Oben, der letzte Berg von der Seite. Unten, der letzte Berg Sicht durch den Boden des großen Deckglas. Pfeile zeigen OP50 bakterielle Nahrung, C. Elegans Würmer und Eiern, eingeklemmt zwischen der NGM Agar Klumpen und die großen 24 mm x 60 mm-Deckglas. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Weitfeld ratiometrischen Ca2 + Bildgebung und Verhalten, die Aufnahme auf einem umgekehrten Epifluoreszenz Mikroskop. (A) Wurm Position und Verhalten ist gefangen im Hellfeld über eine 20 x (NA 0,8) Plan-Apochromat Ziel mit Infrarot (750-790 nm) Licht (lila Pfeil) von einer Halogenlampe durch die NGM-Brocken. Ein Joystick und motorisierte Bühne Controller wird verwendet, um den Wurm in das Sichtfeld während der Aufnahme zu erhalten. Tischposition (Δx, Δy) ist an den PC durch den seriellen Anschluss gesendet. GCaMP5 und mCherry Proteine in der Wurm sind begeistert mit 470 nm (blaue Pfeile) und 590 nm (gelbe Pfeile) Licht emittierende Dioden (LED). GCaMP5 abgegeben (grüne Pfeile) und mCherry (orange Pfeile) Fluoreszenz zusammen mit dem Infrarot-Licht durchläuft ein Multiband dichroitische Spiegel (siehe Tabelle der Materialien). Eine 80/20-Strahlteiler schickt 20 % des einfallenden Lichtes durch einen 0.63 X Demagnifer für die Aufnahme auf eine Infrarot-empfindlichen CMOS-Kamera (lila Pfeil). Die restliche 80 % des Lichts wird durch die Seitenanschluss des Mikroskops gesendet, um ein Bild-Splitter, der die GCaMP5 trennt und mCherry Fluoreszenz auf getrennte Hälften einer sCMOS Kamera beim Entfernen von Infrarot-Hellfeld-Licht. Daten von beiden Kameras werden über USB3 Kabel an einen PC übertragen. Die Trigger-Ports von der Fluoreszenz sCMOS Kamera (blau) werden verwendet, um senden + 5V TTL löst das LED-Beleuchtungssystem, Infrarot-Hellfeld-CMOS-Kamera und den digitalen Erwerb Gerät (DAQ). (B) Trigger 3 Ausgabe TTL-Signale durch den DAQ an digital Pin #8 erkannt und an den PC über eine USB-Verbindung gesendet. Diese digitale Eingänge Auslösen einer "wo XY" seriellen Befehl aus einem Bonsai-Software-Skript (XY-Bühne-Final) liest die X und Y inszenieren Position für jedes GCaMP5/mCherry-Fluoreszenz/Infrarot-Bild eingefangen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Layout der Bonsai seriell-Bühne Kommunikation Skript XY-Bühne-Final. Oben DigitalInput Knoten (rosa) liest TTL Auslöser kommen in Pin #8 von den DAQ. Für jede positive TTL-Spannung (grün) den DAQ macht einen Zeitstempel (blau) und schreibt einen 'Wo XY?'-String (pink) auf der Bühne-Steuerung über die serielle Schnittstelle (grau). Der SerialStringRead Knoten (rosa) liest die X- und Y-Koordinate Antwort von der Bühne-Controller. Diese Zeichenfolge dann in Mikrometer umgewandelt und getrennt in X und Y Koordinaten zu inszenieren. Schließlich, diese vier Streams werden kombiniert mit einem Zip-Knoten (blau) und vier column.csv-Datei wird geschrieben: Frameanzahl der TTL-Signale empfangen (Bereich Knoten, rosa), die X- und Y-Koordinaten und das Intervall zwischen den nachfolgenden Zeitpunkte (in der Regel ~ 50 ms bei Aufnahme bei 20 Hz). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Repräsentative Mikrographen HSN Fluoreszenz und ganze Tier Hellfeld während der Eiablage Verhalten. (AD) Gleichzeitige ratiometrischen Bildgebung von GCaMP5 und mCherry Fluoreszenz in der HSNs vor dem Eisprung. HSN präsynaptischen Termini sind mit Pfeilspitzen gekennzeichnet. (C) zusammenführen von GCaMP5 und mCherry Fluoreszenz. (D) Intensität-modulierte GCaMP5:mCherry Verhältnis; ein hoher Anteil (rot) zeigt hohe intrazelluläre Ca2 + am präsynaptischen Terminus. (E) Hellfeld Bild der gesamten Wurm kurz nach der Eiablage haben. Pfeilspitzen zeigen die vorderen und hinteren Hälften der Vulva von der Eiablage. Maßstab für alle Bilder ist 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Aufzeichnung von HSN Ca2 + und Fortbewegung Geschwindigkeit während der Eiablage Verhalten. (A) Spuren von GCaMP5:mCherry Verhältnis ändert sich entsprechend intrazellulären Ca2 + Transienten (ΔR/R; Rot) zusammen mit der momentanen Wurm Geschwindigkeit (µm/s, blau). Eiablage Veranstaltungen werden durch Pfeilspitzen angezeigt. (B) Spuren von HSN GCaMP5 Fluoreszenz (grün; ΔF/F), mCherry Fluoreszenz (rot; ΔF/F), GCaMP5:mCherry-Fluoreszenz-Verhältnis (schwarz, ΔR/R) und Wurm Geschwindigkeit rund um den Moment der Eisprung (blau). (C) räumliche Organisation der Eiablage und Fortbewegung Verhaltensweisen während der gesamten 10-min-Aufnahme. Die Wurm-Strecke wurde aus den XY-Bühne-Informationen gewonnen, die die Zentroid Position von der HSN gewonnenen mCherry Fluoreszenz Aufnahme hinzugefügt wurde. Das Timing der HSN Transienten (rote Kreise), eierlegende Ereignisse (schwarze Pfeilspitzen), und die Beginn und Ende der Aufnahme (grüne und blaue Diamanten) sind angegeben. Maßstabsleiste beträgt 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Transgene:

Weil mCherry Ausdruck durch Codon-Optimierung und Intron einfügen verbessert wurde (und die meisten verfügbaren GCaMP Reporter nicht haben), injizieren ~ 4 x die Höhe der GCaMP5 exprimierenden Plasmid zu vergleichbaren GCaMP5 Fluoreszenz während starker Ca zu gewährleisten 2 + Transienten. Rettung der lin-15(n765ts) Mutation ermöglicht die einfache Wiederherstellung transgener Tiere mit minimalen Auswirkungen auf die Eiablage und andere Verhaltensweisen35. Transgene sollten integriert werden, um einheitliche Ausdruck und imaging-Bedingungen zwischen verschiedenen Tieren25zu gewährleisten. Wählbare Marker Antibiotikaresistenzen36,einschließlich37 und Rettung von temperaturempfindlichen Lethals38 sollte auch funktionieren, aber, weil nicht-transgenen Tiere tot sind, Bestätigung der Transgen-Integration und Population ist schwieriger im Vergleich zu Markern, die einen sichtbaren Phänotyp25präsentieren. Dominierende Marker, die normale Fortbewegung stören und Fitness, wie rol-6(dm), verringern sollte vermieden werden39. Bildgebung in der lite-1 unbedingt mutierten Hintergrund Blau leichte Flucht Antworten während der Bildgebung23,40,41zu reduzieren. Zusätzliche Mutation von Gur-3, die parallel zur lite-1wirkt, kann weiter minimieren, passives Verhalten und physiologischen Veränderungen durch blaues Licht42. Bequem, Gur-3, lite-1und Lin-15 auf der rechten Hälfte des Chromosom X, befinden sich alle, die den Bau neuer Stämme für Ca2 + Bildgebung und optogenetische Experimente vereinfachen soll.

Da Belichtungszeiten kurz sind und Bilder sind bei 20 Hz gesammelt, müssen GCaMP5 und mCherry Signale hell sein. Die wahrscheinlichste Erklärung für laut Ca2 + Aufnahmen ist dim Fluoreszenz durch schwache Reporter Ausdruck verursacht. Promotoren sollte auch relativ spezifisch für die Region abgebildet werden. Da die HSN Zellkörper und Synapsen auf die Vulva Muskeln in der Mitte des Körpers sind, zusätzlicher Ausdruck aus dem Nlp-3 -Promotor in den Kopf und Schweif ist in der Regel außerhalb des Sichtfeldes und kann ausgeschlossen werden, zusätzliche Filter in der Ratiometrischen Quantifizierung Software. Um sicherzustellen dass die beobachteten Veränderungen in GCaMP5 Fluoreszenz ergeben sich aus tatsächlichen Änderungen in intrazellulären Ca2 +,Kontrolle transgene Ausdruck GFP statt GCaMP5 sollte eigenständig vorbereitet und26analysiert. Neuere Ca2 + Reporter mit verschiedenen Ca2 + Empfindlichkeiten, Kinetik und Farben erweitert die Wahl von imaging-Tools zur Verfügung, aber jede neue Reporter sollte überprüft werden, mit der Ca2 +-unempfindlich fluoreszierende Variante14 ,16.

Medien:

NGM-Platten für die Bildgebung sollte mit hochwertigen Agar vorbereitet werden. Niedrigere Qualität Agar wird beim Autoklavieren, so dass kleine Partikel streuen Licht während imaging und Erhöhung der Hintergrundfluoreszenz nicht vollständig auflösen. Molekulare Biologie Klasse Agarose kann stattdessen verwendet werden, aber der Betrag addiert sollte reduziert werden, um entsprechende Platte Festigkeit zu erhalten.

Vergleiche zu anderen Befestigungsarten:

Bisherige Ansätze zur Bild-Aktivität in der Eiablage Verhalten Schaltung haben Würmer immobilisiert mit Kleber auf einem Agarose-Pad verwendet. Unter diesen Bedingungen, Schaltung Tätigkeit und Eiablage Verhalten ist nicht ohne eine Reduzierung der Nährmedien Osmolarität8,10,44,45bevorzugt. Den letzten Beweis schlägt vor, dass mehrere Wurm Verhaltensweisen durch Fortbewegung Staat Fragen über die Beziehung von Zell-Aktivität beobachtet bei immobilisierten Tieren moduliert werden in frei Verhalten Tiere gesehen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass eierlegende Schaltung Tätigkeit unerwartet mit Fortbewegung26,27abgewickelt wird. In ähnlicher Weise integriert unterteilte Ca2 + Signalisierung in der RIA Interneuron Aktivität von sensorischen Neuronen und Kopf Motoneuronen bei der Nahrungssuche Bewegungen46. Stuhlgang Verhalten wird auch durch eine präzise und Stereotype Fortbewegung begleitet, die Tiere auf ihrer Futtersuche Ort wegbewegen, vor Ausweisung Abfall47erlaubt. Zusammen, diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass kurze Aufnahmen der Schaltung Tätigkeit von immobilisierten Tieren grundlegend von denen, die in frei Verhalten Tiere sein können.

Trotz des Seins direkt unter einem Deckgläschen, ähnelt der Wurm Verhalten auf NGM Standardteller gesehen. Gelegte Eiern schlüpfen weitergehen werden, und die kleine Menge von Lebensmitteln hinterlegte ermöglicht die L1-Larven wachsen zu Erwachsenen (Daten nicht gezeigt). Die große Agar-Chunk-Größe ermöglicht eine angemessene Gasaustausch und widersteht Dehydrierung, obwohl zuviel Essen Hintergrundfluoreszenz zunehmen wird. Während diese Methode am besten für Erwachsene funktioniert, kann die Technik auch Bild L4 Tiere verwendet werden. Die Dicke der wässrigen Schicht zwischen den Brocken und das Deckglas ist jedoch so, dass kleinere Larven haben Schwierigkeiten, die kriechen, und können oft im Zuge eines beweglichen Erwachsenen gefangen.

Eine Einschränkung dieser Montage-Technik ist, dass direkte mechanische oder chemische Stimulation auf präzise Regionen des Körpers schwierig ist. Neuentwicklungen in der gemusterten Beleuchtungstechniken ermöglichen die Fremderregung von Kopf oder Rute ausgedrückt mikrobielle Opsins mit separater Beleuchtung und Detektion der Fluoreszenz-GCaMP/mCherry in der midbody48,49. Infolgedessen kann es möglich, dieses Problem mit optogenetische Ansätzen zu überwinden sein.

Vergleiche mit anderen Ca 2 + Imaging Ansätze:

Diese Methode funktioniert sehr gut für die Aufzeichnung von Änderungen im zytoplasmatischen Ca2 + von Einzel-, Zellen und ihrer synaptischen Region gelöst. In Echtzeit, volumetrische Darstellung der Neuronen im Kopf wurde vor kurzem mit der Position der Zellkerne für Zelle Identifikation und Änderungen in nucleoplasmic Kalzium50,51,52quantitate erreicht. Die Beziehung zwischen Kern- und synaptischen Ca2 + bleibt unklar. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die auffälligsten Veränderungen in HSN intrazellulären Ca2 + an der präsynaptischen Termini Weg von der Zelle Soma (Abbildung 4) auftreten. Die präsynaptischen Termini von der HSN und der VC-Neuronen sind eingebettet in die postsynaptischen Vulvaregion Muskeln26. Es ist nicht klar, ob gäbe es genügender Auflösung in der Z-Dimension sogar mit spinning-Disk oder leichte Blatt Techniken präsynaptischen Ca2 + Signale auf bestimmte Zellen zuzuschreiben, ohne in irgendeiner Weise auf somatische Calcium für Zelle Identifikation . Mit den Techniken beschrieben hier, jeweils 10 min, 2-Kanal-Aufnahme mit 12.001 256 x 256 Pixel 16-Bit TIFF-Bildern ist ~ 4 GB. Das Verhältnis und Intensität modulierbare Verhältnis Kanäle doppelt die Dateigröße ~ 8 GB. Ein typisches Experiment Aufnahme 10 Tiere aus jedem der beiden Genotypen (Wildtyp und experimentellen) erzeugt fast 150 GB von Primärdaten und erfordert 20 h zu sammeln und zu analysieren. Volumetrische Analyse mit 10 Z-Scheiben pro Timepoint würde einer Größenordnung erfordern, mehr Daten und analytische Zeit, zu erklären, warum so wenige solcher Studien abgeschlossen haben.

Hardware:

Wir erfassen und analysieren von Bildsequenzen auf dual-Prozessor Workstations mit hoher Leistung (z. B. Gaming) Grafikkarten, 64 GB RAM, und high-Performance-Solid-State-Laufwerke (siehe Tabelle der Materialien). Daten sollten auf vernetzten redundant Array der unabhängige Festplatten (RAID) gespeichert und in die Cloud in einem externen Rechenzentrum gesichert werden.

Wir empfehlen, mit Hochleistungs-kollimierten LEDs für gepulste Fluoreszenzanregung über Halogen-Metalldampflampen oder Quecksilber-basierte Lichtquellen. Mehreren im Handel erhältlichen Multi-Color-LED-Systeme stehen zur Verfügung. Während einige dieser LED-Systeme eine höhere Kosten im Voraus haben, können sie haben eine lange Lebensdauer (> 20.000 h) gleichzeitig vier oder mehr verschiedene Fluorophore begeistern und bieten präzise zeitliche Steuerung mit einer Seriennummer und/oder TTL Schnittstelle mit niedriger Latenz (10-300 µs wechseln (Zeit). Auslösung wird sichergestellt, dass die Probe nur beleuchtet wird, wenn tatsächlich Daten gesammelt werden. Wir verwenden in der Regel eine 10 ms Exposition alle 50 ms (20 % Zollsatz). Dies reduziert die Phototoxizität und Bewegungsunschärfe während der Bildaufnahme, wie bereits berichtet43.

Wir verwenden sCMOS Kameras für ihre Schnelligkeit und große Auswahl an kleinen, sensiblen Pixel. Eine EM-CCD-Kamera ist eine teurere Alternative, aber "Blüte" Effekte können dazu führen, dass aufgenommene Photoelektronen Verschütten in benachbarte Pixel. Neue Rückseite beleuchtet sCMOS Kameras haben ähnliche Lichtempfindlichkeit des EM-CCDs zu deutlich reduzierten Kosten. Egal ist welcher Sensor verwendet wird, die GCaMP5 und mCherry Kanäle gleichzeitig einzuholen. Sequentielle Erfassung in bewegten Würmer führt zu schlecht registrierten Bilder für ratiometrischen Quantifizierung ungeeignet. Dual-Channel-Bildgebung kann auf eine einzelne Kamera erreicht werden, nach der Trennung der Kanäle mithilfe eines Bild-Splitters (Abbildung 2) oder zwei identische Kameras. Der Dynamikbereich von 16-Bit-Bildern wird über 8-Bit-Bildern für genaue ratiometrischen Quantifizierung empfohlen. Für Hellfeld Bilder der Wurm Verhalten erfassen wir mit einem 1 Zoll 4,1 MP Nahinfrarot-USB3 Kamera, um große 2 x 2 gebinnten 1.024 x 1.024 8-Bit-Bild-Sequenzen nach JPEG-Komprimierung zu erfassen. Die größeren FOV auf neuere Mikroskop Modelle kann einen Erwachsenen Wurm bei 20 X nach 0,63 X Demagnification mit nur leichten Vignettierung (Abb. 4E) visualisiert werden.

Es wird empfohlen, mit standard-TTL-Spannung-Signale, um Beleuchtung und Frame Capture zu synchronisieren. Wegen möglichen Latenzen in verschiedenen Software-Programmen empfehlen wir, dass Benutzer die Fluoreszenz-Kamera mit Trigger-Ausgänge als Master mit TTL-Ausgänge fahren alle anderen Geräte konfigurieren. Auf diese Weise werden Positionsinformationen Hellfeld und Bühne für jede Ca2 + Messung erhoben.

Schlitz oder resonanten Punkt Scannen konfokale Mikroskope in der Regel gefunden in Gemeinschaftseinrichtungen konfokale geben auch hervorragende Leistung während der ratiometrischen Ca2 + Bildgebung. Solche Instrumente können verwendet werden, um zwei oder mehr Fluoreszenz-Kanäle zusammen mit Hellfeld24zu erfassen. In diesem Fall die konfokale Lochkamera zu seinem maximalen Durchmesser geöffnet werden soll, und ein spektrale Detektor sollte verwendet werden, um GCaMP5, mCherry und Infrarot-Hellfeld-Signale zu trennen. Dies maximiert die light Kollektion aus einem dicken (~ 20 µm) Scheibe gleichzeitig Ablehnung der Out-of-Focus Fluoreszenz. Ein Nachteil ist die kleinere FOV und weitere Einschränkungen für Hard- und Software-Anpassung.

Software:

Die meisten Hersteller liefern und installieren ihre Kameras und Mikroskope mit proprietärer Software, einschließlich der Konfiguration der Auslösung ein- und Ausgänge. Die Funktionen und die Leistung dieser Software während der Aufnahme können variieren. Denn schnell bewegenden Würmer eine Herausforderung sein kann, um zu verfolgen, Bildanzeige während der Aufnahme muss glatt und stabil bei 20 Hz. Zur Verbesserung der Leistung können Bildsequenzen vorübergehend mit verhaltensrelevanten relevanten Teilmengen gespeichert am Ende des Experiments im RAM gespeichert werden. Diese Sequenz-Zweikanal-Image-Dateien können in der open Image Cytometry Standard Format (.ics) für den Import in die ratiometrischen Quantifizierung Software konvertiert werden. OME-TIFF ist eine neuere OpenSource-Bildformat, obwohl verschiedene Installationen möglicherweise nicht auf TIFF-Bild-Sequenzen größer als 4 GB speichern.

Ein wesentliches Merkmal der Quantifizierung Pipeline ist die Generation der Verhältnis-Kanal und dann eine unvoreingenommene Bild Segmentierung Verfahren mit mCherry Fluoreszenz, um Zellen von Interesse zu finden. Aus jedem Fundstück bedeuten die Objektgröße, XY Zentroid Position und die minimale und maximale Fluoreszenz Intensitätswerte für jeden Kanal (einschließlich des Verhältnis-Kanals) berechnet. Zusammen, sind diese Werte verwendet, um Änderungen in intrazellulären Ca2 + bei jeder Timepoint in der Aufnahme quantitate. Objekt-Messungen für jedes Timepoint werden dann als a.csv-Datei für spätere Analysen exportiert.

Eine große Einschränkung des hier beschriebenen Protokolls ist die Abhängigkeit verschieben der Daten in verschiedenen Formen durch ein Patchwork von Software-Produkten. Eine zusätzliche Reizung ist, dass einige der Software ist Open Source und kostenlos während andere geschlossen sind, teuer und ungleichmäßig aktualisierte. Eine wesentliche Verbesserung wäre, nutzen oder entwickeln Sie ein Stück Software (idealerweise Open-Source), das ähnliche Niveaus der Leistung und der Benutzerfreundlichkeit von Akquisition Analyse bietet. Wie bereits erwähnt, verdoppelt ratiometrischen Analyse sich die Dateigröße und der benötigten Zeit für ein Experiment. Generation von Kameratreiber, die in benutzerdefinierbare Frameworks integriert werden können, wie Bonsai erlauben würde, Bilder und andere Daten-Streams gesammelt und analysiert werden in Echtzeit deutlich verbesserten Durchsatz.

Zukunftsperspektiven:

Während wir in der Regel manuell Wurm Bewegungen verfolgen, dürfte Verfolgung von der Wurm Zentroid erkannt in Infrarot-hell-dunkel-Feld oder Aufnahmen zusätzliche Bildverarbeitungs-Knoten, die geschlossene Anpassung der Tischposition und automatisiert Tracking (Abbildung 3 und Daten nicht gezeigt). Die Mehrheit der Fluoreszenz-Aufnahmen, die mit dieser Methode erhalten ist dunkel und frei von biologisch interessante Daten. Am Sensor oder in Echtzeit nach der Übernahme Bildverarbeitungs-Techniken, die Bildsequenzen zu relevanten Objekten auftauchen würde ermöglichen höhere räumliche Auflösung und die Daten-Analyse-Pipeline zu beschleunigen, insbesondere dann, wenn zusätzliche Z-Scheiben für jeden gesammelt werden TimePoint Aktivität in allen Prä- und postsynaptischen Zellen in der Schaltung zu visualisieren.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von NINDS an KMC (R01 NS086932) finanziert. LMN wurde durch einen Zuschuss aus dem Programm NIGMS IMSD (R25 GM076419) unterstützt. In dieser Studie verwendeten Stämme C. Elegans Genetik Zentrum, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Wir danken James Baker und Mason Klein für hilfreiche Diskussionen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans growth, cultivation, and mounting
Escherichia coli bacterial strain, OP50 Caenorhabditis Genetic Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1
HSN GCaMP5+mCherry worm strain Caenorhabditis Genetic Center LX2004 Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN.  Full genotype:  vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation author LX1832 Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid author pL15EK Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request
pKMC299 plasmid author pKMC299 Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
pKMC300 plasmid author pKMC300 Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
Potassium Phosphate Monobasic Sigma P8281 For preparation of NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Sigma P5655 For preparation of NGM plates
Magnesium Sulfate Heptahydrate Amresco 0662 For preparation of NGM plates
Calcium Chloride Dihydrate Alfa Aesar 12312 For preparation of NGM plates
Peptone Becton Dickinson 211820 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Amresco 0241 For preparation of NGM plates
Cholesterol Alfa Aesar A11470 For preparation of NGM plates
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure Affymetrix 10906 For preparation of NGM plates
60 mm Petri dishes VWR 25384-164  For preparation of NGM plates
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 VWR 48393-251 Cover glass through which worms are imaged
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 VWR 48366-067 Cover glass that covers the top of the agar chunk
Stereomicroscope with transmitted light base Leica M50 Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm ALFA AESAR AA39526-BW For worm transfer
Calcium imaging microscope
Anti-vibration air table TMC 63-544 Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top
Inverted compound microscope Zeiss 431007-9902-000 Axio Observer.Z1 inverted microscope
Sideport L80/R100 (3 position) Zeiss 425165-0000-000 To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera
Tilt Back Illumination Carrier Zeiss 423920-0000-000 For infrared/behavior imaging
Lamphousing 12V/100W w/ Collector Zeiss 423000-9901-000 For infrared/behavior imaging
Halogen lamp 12V/100W Zeiss 380059-1660-000 For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp Zeiss 447958-9000-000 BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized Zeiss 424244-0000-000 For infrared/behavior imaging
Condenser & Shutter Zeiss 423921-0000-000 For infrared/behavior imaging
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera Zeiss 425536-0000-000 For infrared/behavior imaging
Eyepiece 10x, 23mm Zeiss 444036-9000-000 For worm localization on the agar chunk
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier Zeiss 426113-0000-000 Mount for infrared CMOS camera
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) FLIR (formerly Point Grey Research) GS3-U3-41C6NIR-C Camera for brightfield imaging
USB 3.0 Host Controller Card FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-1202 Fresco FL1100, 4 Ports
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector  FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-3000 Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 Zeiss 420650-9901-000 Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance
6-cube Reflector Turret, Motorized Zeiss 424947-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Light Train, Motorized Zeiss 423607-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Shutter Zeiss 423625-0000-000 For fluorescence imaging
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) Zeiss 489062-9901-000 FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging
LED illumination system Zeiss 423052-9501-000 Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination
GFP LED module (470 nm) Zeiss 423052-9052-000 Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation
mCherry LED module (590 nm) Zeiss 423052-9082-000 Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation
Iris stop slider for incident-light equipment Zeiss 000000-1062-360 Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view
C-Mount Adapter 1" 1.0x Zeiss 426114-0000-000 Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera
Image splitter Hamamatsu A12801-01 Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) Semrock Di02-R594-25x36 Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals
GFP emission filter (image splitter) Semrock FF01-525/30-25 Capturing GCaMP5 fluorescence
mCherry/ emission filter (image splitter) Semrock FF01-647/57-25 This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) Hamamatsu A12802-01 / C11440-22CU Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter
Motorized XY Stage Märzhäuser SCAN IM 130 x 100 Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step 
XY Stage controller with joystick LUDL MAC6000, XY joystick Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud
Digital Acquisition board (DAQ) Arduino Uno Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud
BNC Male to BNC Male Cable - 6 ft Hosa Technology HOBB6 BNC connectors for TTL triggering
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") uxcell 608641773651 To connect the fluorescence camera trigger outputs
BNC turn head adapter Hantek RRBNCTH21 BNC to Banana Plug Adapter (4mm)
BNC female to female connector Diageng 20130530009 Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug
Solderless flexible breadboard jumper wires Z&T GK1212827 To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ.  Male to male.
High performace workstation HP Z820 Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives
M.2 Solid state drive Samsung MZ-V5P512BW High-speed streaming and analysis of image data
M.2 Solid state drive adapter for workstations Lycom DT-120 M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter
Network attached storage Synology DS-2415+ Imaging data storage and analysis
Hard disk drives Western Digital WD80EFZX RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy)
Software
Fluorescence Acquisition Hamamatsu HCImage DIA Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps
Brightfield Acquisition FLIR (formerly Point Grey Research) Flycapture Recording of brightfield JPEG image sequences
Stage Serial Port Reader Bonsai https://bitbucket.org/horizongir/bonsai Facilitates tracking of worms during behavior
LED controller software Zeiss Micro Toolbox Test 2011 To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit
ImageJ  NIH https://imagej.net/Fiji/Downloads Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software
Excel Microsoft  2002984-001-000001 For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis
Peak Finding MATLAB R2017a Script used for Ratio peak feature calculations
Ratiometric Quantitation Perkin Elmer Volocity 6.3 Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects
Scripts
XY-stage-final.bonsai Bonsai TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps).  X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. 

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References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans R. Soc. 314, 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science. 282, 2028-2033 (1998).
  3. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147, 922-933 (2011).
  4. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo neuronal calcium imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. JoVE. (2013).
  5. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  6. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Zhang, M., et al. A self-regulating feed-forward circuit controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 18, 1445-1455 (2008).
  9. Shyn, S. I., Kerr, R., Schafer, W. R. Serotonin and Go modulate functional states of neurons and muscles controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 13, 1910-1915 (2003).
  10. Zhang, M., Schafer, W. R., Breitling, R. A circuit model of the temporal pattern generator of Caenorhabditis egg-laying behavior. BMC Syst. Biol. 4, 81 (2010).
  11. Kerr, R. A., Schafer, W. R. Intracellular Ca2+ imaging in C. elegans. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 351, 253-264 (2006).
  12. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  13. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
  14. Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nat. Methods. 12, 64-70 (2015).
  15. Oheim, M., et al. New red-fluorescent calcium indicators for optogenetics, photoactivation and multi-color imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 2284-2306 (2014).
  16. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  17. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 18, 222-235 (2017).
  18. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends Neurosci. 39, 277-289 (2016).
  19. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  20. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  21. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. JoVE. (2008).
  22. Clark, S. G., Lu, X., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans locus lin-15, a negative regulator of a tyrosine kinase signaling pathway, encodes two different proteins. Genetics. 137, 987-997 (1994).
  23. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 198 (2008).
  24. Thapaliya, E. R., et al. Bioimaging with Macromolecular Probes Incorporating Multiple BODIPY Fluorophores. Bioconjug. Chem. 28, 1519-1528 (2017).
  25. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J. Vis. Exp. JoVE. e50773 (2013).
  26. Collins, K. M., Koelle, M. R. Postsynaptic ERG Potassium Channels Limit Muscle Excitability to Allow Distinct Egg-Laying Behavior States in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 33, 761-775 (2013).
  27. Collins, K. M., et al. Activity of the C. elegans egg-laying behavior circuit is controlled by competing activation and feedback inhibition. eLife. 5, e21126 (2016).
  28. Li, P., Collins, K. M., Koelle, M. R., Shen, K. LIN-12/Notch signaling instructs postsynaptic muscle arm development by regulating UNC-40/DCC and MADD-2 in Caenorhabditis elegans. eLife. 2, 00378 (2013).
  29. Banerjee, N., Bhattacharya, R., Gorczyca, M., Collins, K. M., Francis, M. M. Local neuropeptide signaling modulates serotonergic transmission to shape the temporal organization of C. elegans egg-laying behavior. PLoS Genet. 13, 1006697 (2017).
  30. Lopes, G., et al. Bonsai: an event-based framework for processing and controlling data streams. Front. Neuroinformatics. 9, 7 (2015).
  31. Flavell, S. W., et al. Serotonin and the neuropeptide PDF initiate and extend opposing behavioral states in C. elegans. Cell. 154, 1023-1035 (2013).
  32. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. J. Neurobiol. 49, 303-313 (2001).
  33. Ringstad, N., Horvitz, H. R. FMRFamide neuropeptides and acetylcholine synergistically inhibit egg-laying by C. elegans. Nat. Neurosci. 11, 1168-1176 (2008).
  34. Hallem, E. A., et al. Receptor-type guanylate cyclase is required for carbon dioxide sensation by Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 254-259 (2011).
  35. Tanis, J. E., Moresco, J. J., Lindquist, R. A., Koelle, M. R. Regulation of serotonin biosynthesis by the G proteins Galphao and Galphaq controls serotonin signaling in Caenorhabditis elegans. Genetics. 178, 157-169 (2008).
  36. Giordano-Santini, R., et al. An antibiotic selection marker for nematode transgenesis. Nat. Methods. 7, 721-723 (2010).
  37. Semple, J. I., Garcia-Verdugo, R., Lehner, B. Rapid selection of transgenic C. elegans using antibiotic resistance. Nat. Methods. 7, 725-727 (2010).
  38. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Res. 22, 1762-1763 (1994).
  39. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  40. Gong, J., et al. The C. elegans Taste Receptor Homolog LITE-1 Is a Photoreceptor. Cell. 167, 1252-1263 (2016).
  41. Liu, J., et al. C. elegans phototransduction requires a G protein-dependent cGMP pathway and a taste receptor homolog. Nat. Neurosci. 13, 715-722 (2010).
  42. Bhatla, N., Horvitz, H. R. Light and hydrogen peroxide inhibit C. elegans Feeding through gustatory receptor orthologs and pharyngeal neurons. Neuron. 85, 804-818 (2015).
  43. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 4266-4273 (2013).
  44. Zang, K. E., Ho, E., Ringstad, N. Inhibitory peptidergic modulation of C. elegans serotonin neurons is gated by T-type calcium channels. eLife. 6, (2017).
  45. Branicky, R., Miyazaki, H., Strange, K., Schafer, W. R. The voltage-gated anion channels encoded by clh-3 regulate egg laying in C. elegans by modulating motor neuron excitability. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 34, 764-775 (2014).
  46. Hendricks, M., Ha, H., Maffey, N., Zhang, Y. Compartmentalized calcium dynamics in a C. elegans interneuron encode head movement. Nature. 487, 99-103 (2012).
  47. Nagy, S., Huang, Y. -C., Alkema, M. J., Biron, D. Caenorhabditis elegans exhibit a coupling between the defecation motor program and directed locomotion. Sci. Rep. 5, 17174 (2015).
  48. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 147-152 (2011).
  49. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 153-158 (2011).
  50. Kato, S., et al. Global brain dynamics embed the motor command sequence of Caenorhabditis elegans. Cell. 163, 656-669 (2015).
  51. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 1074-1081 (2016).
  52. Toyoshima, Y., et al. Accurate Automatic Detection of Densely Distributed Cell Nuclei in 3D Space. PLOS Comput. Biol. 12, 1004970 (2016).
Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten <em>Caenorhabditis Elegans</em>
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Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).More

Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).

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