यह प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग Ca के उपयोग का वर्णन करता है2 + रिपोर्टर Caenorhabditis एलिगेंस कीड़े व्यवहार में तंत्रिका गतिविधि में परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए.
यह तेजी से स्पष्ट है कि तंत्रिका सर्किट जानवरों के व्यवहार में गतिविधि है कि anesthetized या मैटीरियल जानवरों में देखा से काफी अलग हो गया है । अति संवेदनशील, सीए2 + के आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर सेल और synaptic गतिविधि जानवरों के व्यवहार में गैर इनवेसिव ऑप्टिकल दृष्टिकोण का उपयोग कर की रिकॉर्डिंग में क्रांति ला दिया है । जब आनुवंशिक और optogenetic तकनीक के साथ संयुक्त, आणविक तंत्र है कि सेल और सर्किट गतिविधि अलग व्यवहार राज्यों के दौरान मिलाना पहचाना जा सकता है ।
यहाँ हम ratiometric Ca के लिए तरीकों का वर्णन2 + स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर Caenorhabditis एलिगेंस कीड़े में एकल न्यूरॉन्स की इमेजिंग. हम एक सरल बढ़ते तकनीक है कि धीरे से एक मानक निमेटोड विकास मीडिया (NGM) एक गिलास coverslip के साथ आगर ब्लॉक पर बढ़ कीड़े ओवरले का प्रदर्शन, पशुओं की अनुमति के लिए उच्च संकल्प पर दर्ज की अप्रतिबंधित आंदोलन और व्यवहार के दौरान । इस तकनीक के साथ, हम संवेदनशील ca2 + रिपोर्टर GCaMP5 का उपयोग करने के लिए intracellular ca2 + में परिवर्तन रिकॉर्ड serotonergic द्विलिंग विशिष्ट ंयूरॉंस (HSNs) में वे अंडा बिछाने व्यवहार ड्राइव के रूप में । द्वारा सह व्यक्त mCherry, एक Ca2 +असंवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन, हम ~ 1 µm भीतर एचएसएन की स्थिति को ट्रैक कर सकते है और प्रतिदीप्ति में उतार चढ़ाव के लिए सही ध्यान या आंदोलन में परिवर्तन की वजह से । एक साथ, अवरक्त brightfield इमेजिंग व्यवहार रिकॉर्डिंग और एक मोटर की अवस्था का उपयोग कर जानवर ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है । इन सूक्ष्म तकनीक और डेटा धाराओं को एकीकृत करके, हम सीए रिकॉर्ड कर सकते हैं2 + C. एलिगेंस अंडा में गतिविधि सर्किट बिछाने के रूप में यह मिनट के दसियों से अधिक निष्क्रिय और सक्रिय व्यवहार राज्यों के बीच प्रगति.
तंत्रिका विज्ञान के एक केंद्रीय लक्ष्य को समझने की कैसे ंयूरॉंस सर्किट में संवाद करने के लिए पशु व्यवहार ड्राइव है । सर्किट गतिविधि बदलने के क्रम में तंत्रिका सर्किट विविध संवेदी cues की एक श्रृंखला को एकीकृत, जिससे जानवरों के लिए अपने वातावरण का जवाब करने के लिए आवश्यक व्यवहार परिवर्तन ड्राइविंग । निमेटोड, सी. एलिगेंस, ३०२ न्यूरॉन्स जिनके synaptic कनेक्शन पूरी तरह से1मैप किया गया है के साथ एक सरल तंत्रिका तंत्र है. इसके अतिरिक्त, जीन है कि neurotransmission में शामिल प्रोटीन के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना अत्यधिक C. एलिगेंस और स्तनधारी2के बीच संरक्षित कर रहे हैं । इसके तंत्रिका तंत्र की संरचनात्मक सादगी के बावजूद, यह एक उपजाऊ मंच प्रदान करने के लिए कैसे ंयूरॉंस व्यवहार को विनियमित समझने की एक जटिल प्रदर्शनों की व्यवस्थाओं को प्रदर्शित करता है3।
C. एलिगेंस आनुवंशिक हेरफेर के रूप में दृष्टिकोण की एक विस्तृत श्रृंखला के आवेदन के लिए उत्तरदायी है, लेजर सेल पृथक, electrophysiological तकनीक, साथ ही vivo में ऑप्टिकल इमेजिंग4,5. हाल के अध्ययनों से प्रमुख न्यूरोट्रांसमीटर सिग्नलिंग सिस्टम के विस्तृत नक्शे का उत्पादन किया है C. एलिगेंस कोलीनर्जिक और GABAergic न्यूरॉन नेटवर्क सहित. इन अध्ययनों के साथ चल रहे अध्ययनों के साथ सभी की अभिव्यक्ति का नक्शा करने के लिए ंयूरॉन जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स एक अद्वितीय स्थिति में इस मॉडल जगह अत्यधिक विस्तृत संरचनात्मक और कार्यात्मक ंयूरॉंस कनेक्टिविटी नक्शे को पूरी तरह से समझने के लिए कैसे इन विभिंन रिसेप्टर्स और timescales के माध्यम से विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर संकेत पशु व्यवहार के विभिन्न पहलुओं को ड्राइव करने के लिए.
आदेश में किसी भी प्रणाली में गतिशील ंयूरॉंस गतिविधि पैटर्न का अध्ययन करने के लिए, एक आवश्यक शर्त को मजबूत तरीके से व्यवहार के दौरान व्यक्तिगत ंयूरॉंस या पूरे सर्किट में गतिविधि रिकॉर्ड विकसित है । विशेष रूप से महत्वपूर्ण presynaptic गतिविधि है कि ड्राइव synaptic पुटिका संलयन कल्पना करने के लिए इस तरह के ऑप्टिकल दृष्टिकोण की सुविधा है । intracellular Ca के तेज और अति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रिपोर्टर2 +, संवेदनशील photodetectors की बढ़ती उपलब्धता के साथ, व्यवहार के दौरान जाग, रहने वाले जानवरों में सेल और synaptic गतिविधि की रिकॉर्डिंग में क्रांति ला दिया है. क्योंकि synaptic विद्युत गतिविधि का एक प्रमुख परिणाम के लिए सीए2 + चैनलों को विनियमित है, intracellular ca में परिवर्तन2 + ईमानदारी से सेल गतिविधि में व्यवहार प्रासंगिक परिवर्तन की रिपोर्ट के लिए लगा रहे हैं ।
इस अध्ययन में, हम एक दृष्टिकोण ratiometric Ca2 + serotonergic एचएसएन मोटर न्यूरॉन्स में इमेजिंग कि अंडा- सी. एलिगेंस6,7में व्यवहार बिछाने को बढ़ावा देने के लिए प्रस्तुत करते हैं । इस दृष्टिकोण के पिछले प्रयासों पर बनाता है Ca2 + C. एलिगेंस में गतिविधि और अंडे-व्यवहार के दौरान सर्किट बिछाने5,8,9,10,11 . विधि एक साथ सेल में मनाया परिवर्तन और अंडा बिछाने की घटनाओं के साथ-साथ पशु हरकत राज्य में परिवर्तन को सहसंबंधी बनाना अनुमति देता है । हालांकि हम इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए वयस्क कीड़े, हमारी प्रयोगशाला से अप्रकाशित काम में गतिविधि का अध्ययन इस दृष्टिकोण चौथे लार्वा (L4) मंच पर किशोर जानवरों के लिए बढ़ाया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से । यह संभावना है कि अंय सी. एलिगेंस ंयूरॉंस की गतिविधि है कि अलग सर्किट और व्यवहार में काम इसी तरह इस तकनीक के साथ पहुंच जाना चाहिए । दूसरे हाल ही में विकसित तेजी से सीए2 + गैर अतिव्यापी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ संकेतक12,13,14,15,16, optogenetic उपकरण17 , और आनुवंशिक रूप से encoded ऑप्टिकल संकेतक झिल्ली वोल्टेज की18, हम में प्रवेश करने के लिए अनुमति चाहिए ‘ सभी ‘ ऑप्टिकल जांच में कैसे परिवर्तन के तंत्रिका सर्किट गतिविधि ड्राइव अलग व्यवहार राज्यों ।
Transgenes:
क्योंकि mCherry अभिव्यक्ति codon अनुकूलन और intron प्रविष्टि के माध्यम से सुधार किया गया है (और सबसे उपलब्ध GCaMP पत्रकारों को नहीं है), सुई ~ 4x GCaMP5-व्यक्त प्लाज्मिड की मात्रा मजबूत Ca के दौरान GCaMP5 प्रतिदीप्ति के तुलनीय स्तर सुनिश्चित करने के लिए 2 + यात्रियों । lin-15 (n765ts) उत्परिवर्तन के बचाव अंडे बिछाने और अंय व्यवहार३५पर ंयूनतम प्रभाव के साथ ट्रांसजेनिक पशुओं के सतही वसूली के लिए अनुमति देता है । Transgenes विभिंन जानवरों के बीच समान अभिव्यक्ति और इमेजिंग शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए एकीकृत किया जाना चाहिए25। एंटीबायोटिक प्रतिरोध सहित चयन मार्करों३६,३७ और तापमान के बचाव के प्रति संवेदनशील घातक३८ भी काम करना चाहिए, लेकिन, क्योंकि गैर ट्रांसजेनिक पशु मर चुके हैं, transgene एकीकरण की पुष्टि और homozygosity मार्क्स की तुलना में अधिक कठिन है जो25दिखाई देने वाले phenotype को प्रस्तुत करते हैं । ऐसे rol-6 (डीएम)के रूप में सामांय गतिवान और कमी स्वास्थ्य, बाधित प्रमुख मार्करों,३९से बचा जाना चाहिए । लाइट-1 उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में इमेजिंग इमेजिंग23,४०,४१के दौरान नीली बत्ती एस्केप प्रतिक्रियाओं को कम करने के लिए आवश्यक है । gur के अतिरिक्त उत्परिवर्तन -3, जो लाइट-1के समानांतर में कार्य करता है, आगे अवशिष्ट व्यवहार और शारीरिक नीले प्रकाश४२की वजह से परिवर्तन को कम कर सकते हैं । सुविधा, gur-3, लाइट-1, और लिन-15 सभी गुणसूत्र एक्स के ठीक आधे पर स्थित हैं, जो सीए2 + इमेजिंग और optogenetic प्रयोगों के लिए नए उपभेदों के निर्माण को सरल बनाना चाहिए ।
जोखिम बार कम कर रहे हैं और छवियों 20 हर्ट्ज, GCaMP5 और mCherry संकेतों उज्ज्वल होना चाहिए पर एकत्र कर रहे हैं क्योंकि. शोर Ca2 + रिकॉर्डिंग के लिए सबसे अधिक संभावना स्पष्टीकरण कमज़ोर रिपोर्टर व्यंजक के कारण मंद प्रतिदीप्ति है । प्रवर्तकों को भी इस क्षेत्र के लिए यथोचित विशिष्ट होना चाहिए । क्योंकि एचएसएन कोशिका शरीर और वल्वल मांसपेशियों पर synapses शरीर के केंद्र में हैं, सिर और पूंछ में एनएलपी-3 प्रमोटर से अतिरिक्त अभिव्यक्ति आम तौर पर देखने के क्षेत्र के बाहर है और में अतिरिक्त फिल्टर का उपयोग कर बाहर रखा जा सकता है Ratiometric Quantitation लागेको हो । यह सुनिश्चित करने के लिए कि intracellular Ca2 +में वास्तविक परिवर्तनों से GCaMP5 प्रतिदीप्ति परिणाम में देखा गया परिवर्तन, नियंत्रण transgenes GFP के बजाय GCaMP5 व्यक्त करने के लिए स्वतंत्र रूप से तैयार और26विश्लेषण किया जाना चाहिए । नए ca2 + विभिंन ca2 + संवेदनशीलता, कैनेटीक्स, और रंग के साथ रिपोर्टर इमेजिंग उपकरण उपलब्ध की पसंद का विस्तार किया है, लेकिन प्रत्येक नए रिपोर्टर ca2 +-असंवेदनशील फ्लोरोसेंट संस्करण का उपयोग कर मांय किया जाना चाहिए14 ,16.
मीडिया:
इमेजिंग के लिए NGM प्लेटें उच्च गुणवत्ता वाले आगार के साथ तैयार की जानी चाहिए । कम गुणवत्ता वाले आगार पूरी तरह से autoclaving पर भंग नहीं होगा, छोड़ने छोटे कण कि इमेजिंग के दौरान प्रकाश तितर बितर, और बढ़ती पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति । आणविक जीवविज्ञान ग्रेड agarose बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन जोड़ा मात्रा समकक्ष प्लेट दृढ़ता बनाए रखने के लिए कम किया जाना चाहिए ।
अंय बढ़ते तरीकों से तुलना:
अंडे में छवि गतिविधि के लिए पिछले दृष्टिकोण बिछाने व्यवहार सर्किट एक agarose पैड को गोंद के साथ मैटीरियल कीड़े का इस्तेमाल किया है । इन शर्तों के तहत, सर्किट गतिविधि और अंडा बिछाने व्यवहार संस्कृति मीडिया में कमी के बिना इष्ट नहीं है osmolarity8,10,४४,४५। हाल ही में सबूत पता चलता है कि कई कीड़ा व्यवहार गतिवान राज्य द्वारा संग्राहक रहे हैं, सेल गतिविधि के संबंध के बारे में सवाल उठाने मैटीरियल जानवरों में देखा है कि स्वतंत्र रूप से व्यवहार पशुओं में देखी । हमने हाल ही में दिखाया है कि अंडा बिछाने सर्किट गतिविधि अप्रत्याशित रूप से गतिवान26,27के साथ चरणबद्ध है । इसी प्रकार, compartmentalized Ca2 + में संकेतन रिया ंयूरॉन४६चारा के दौरान संवेदी ंयूरॉंस और सिर मोटर ंयूरॉंस से गतिविधि को एकीकृत । शौच व्यवहार भी गतिवान में एक सटीक और टकसाली परिवर्तन के साथ है कि जानवरों अपशिष्ट४७निष्कासित करने से पहले अपने चारा स्थल से दूर स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है । साथ में, इन परिणामों का सुझाव है कि मैटीरियल जानवरों से सर्किट गतिविधि की संक्षिप्त रिकॉर्डिंग स्वतंत्र रूप से व्यवहार जानवरों में प्राप्त उन लोगों से मौलिक रूप से अलग हो सकता है ।
एक coverslip के नीचे सीधे होने के बावजूद, कीड़ा व्यवहार है कि मानक NGM प्लेटों पर देखा जैसा दिखता है । रखी अंडे हैच पर जाना होगा, और जमा भोजन की छोटी राशि L1 लार्वा वयस्कों में विकसित करने के लिए अनुमति देता है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । बड़े आगर हिस्सा आकार उचित गैस विनिमय के लिए अनुमति देता है और निर्जलीकरण का विरोध करता है, हालांकि बहुत अधिक भोजन पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति वृद्धि होगी । हालांकि इस विधि वयस्कों के लिए सबसे अच्छा काम करता है, तकनीक भी L4 जानवरों छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, खंड और coverslip के बीच जलीय परत की मोटाई ऐसी है कि छोटे लार्वा कठिनाई रेंगने है, और अक्सर एक चलती वयस्क के जाग में फंस सकता है ।
इस बढ़ते तकनीक की एक सीमा है कि प्रत्यक्ष यांत्रिक या रासायनिक उत्तेजना शरीर के सटीक क्षेत्रों के लिए मुश्किल है । नमूनों में हाल की घटनाओं प्रदीप्ति तकनीक सिर या पूंछ के अलग उत्तेजना के लिए अनुमति-अलग रोशनी और GCaMP का पता लगाने के साथ माइक्रोबियल opsins व्यक्त की प्रतिदीप्ति४८में mCherry midbody,४९। परिणामस्वरूप, यह optogenetic दृष्टिकोण का उपयोग कर इस समस्या को दूर करने के लिए संभव हो सकता है ।
अंय Ca से तुलना 2 + इमेजिंग दृष्टिकोण:
यह विधि एकल, हल किए गए कक्षों और उनके synaptic क्षेत्रों से cytoplasmic Ca2 + में परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए बहुत अच्छी तरह से कार्य करती है । वास्तविक समय, सिर में न्यूरॉन्स की volumetric इमेजिंग हाल ही में सेल पहचान के लिए सेल नाभिक की स्थिति का उपयोग कर प्राप्त किया गया है और nucleoplasmic कैल्शियम में परिवर्तन quantitate करने के लिए५०,५१,५२. परमाणु और synaptic Ca2 + के बीच संबंध अस्पष्ट बनी हुई है । हमारे डेटा एचएसएन intracellular Ca में सबसे विशिष्ट परिवर्तन का सुझाव2 + सेल सोमा से दूर presynaptic टर्मिनी पर हो (चित्रा 4d) । एचएसएन और कुलपति न्यूरॉन्स के presynaptic टर्मिनी postsynaptic वल्वल मांसपेशियों में एम्बेडेड हैं26. यह स्पष्ट नहीं है कि क्या वहां जेड आयाम में भी कताई डिस्क या प्रकाश शीट तकनीक के साथ परमशॆवर presynaptic Ca के लिए पर्याप्त संकल्प होगा2 + कोशिका पहचान के लिए दैहिक कैल्शियम पर किसी तरह से निर्भर बिना विशिष्ट कोशिकाओं को संकेत . यहां वर्णित तकनीकों का उपयोग करना, प्रत्येक 10 मिनट, दो चैनल रिकॉर्डिंग के साथ १२,००१ २५६ x २५६ १६-bit पिक्सेल TIFF छवियां ~ 4 GB है । अनुपात और तीव्रता संग्राहक अनुपात चैनल के लिए फ़ाइल का आकार डबल ~ 8 GB । एक ठेठ प्रयोग दो पादी के प्रत्येक से 10 जानवरों की रिकॉर्डिंग (जंगली-प्रकार और प्रयोगात्मक) लगभग १५० GB प्राथमिक डेटा जनरेट करता है और 20 के लिए इकट्ठा और विश्लेषण एच की आवश्यकता है । Volumetric विश्लेषण के साथ 10 timepoint प्रति Z स्लाइस परिमाण का एक आदेश अधिक डेटा और विश्लेषणात्मक समय की आवश्यकता होगी, समझा क्यों इतना कुछ ऐसे अध्ययन पूरा कर लिया गया है ।
हार्डवेयर:
हम रिकॉर्ड और उच्च प्रदर्शन (जैसे, गेमिंग) ग्राफिक्स कार्ड, ६४ जीबी रैम, और उच्च प्रदर्शन ठोस राज्य ड्राइव के साथ दोहरे प्रोसेसर कार्यस्थानों पर छवि दृश्यों का विश्लेषण ( सामग्री की तालिकादेखें) । डेटा स्वतंत्र डिस्क (RAID) के नेटवर्क अनावश्यक सरणी पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और एक ऑफ-साइट डेटा केंद्र पर बादल को बैकअप लिया ।
हम धातु halide या बुध आधारित प्रकाश स्रोतों पर स्पंदित प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए उच्च शक्ति collimated एल ई डी का उपयोग करने की सलाह देते हैं । कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बहु रंग एलईडी सिस्टम उपलब्ध हैं । हालांकि इन एलईडी प्रणालियों के कुछ एक उच्च अग्रिम लागत है, वे एक लंबे जीवन है (> २०,००० ज), एक साथ चार या अधिक अलग fluorophores उत्तेजित कर सकते हैं, और सटीक अस्थाई नियंत्रण की पेशकश एक धारावाहिक का उपयोग कर या कम विलंबता के साथ/ समय) । ट्रिगर सुनिश्चित करता है कि नमूना ही प्रबुद्ध जब डेटा वास्तव में एकत्र किया जा रहा है । हम आम तौर पर एक 10 एमएस जोखिम हर ५० एमएस (20% शुल्क दर) का उपयोग करें । यह छवि कैद के दौरान phototoxicity और गति कलंक कम कर देता है, के रूप में पहले की रिपोर्ट४३।
हम उनकी गति और छोटे, संवेदनशील पिक्सल के बड़े सरणी के लिए sCMOS कैमरों का उपयोग करें । एक EM-सीसीडी कैमरा एक अधिक महंगी विकल्प है, लेकिन ‘ ब्लूम ‘ प्रभाव आसंन पिक्सल में फैल photoelectrons पर कब्जा कर लिया में परिणाम कर सकते हैं । नई वापस प्रबुद्ध sCMOS कैमरों के समान संश्लेषण है EM-CCDs में काफी कम कीमत पर । चाहे जो सेंसर उपयोग किया जाता है, GCaMP5 और mCherry चैनल एक साथ प्राप्त किया जाना चाहिए. चलती कीड़े में अनुक्रमिक कब्जा खराब पंजीकृत छवियों ratiometric quantitation के लिए अनुपयुक्त के लिए नेतृत्व करेंगे । दोहरी चैनल इमेजिंग एक छवि अलगानेवाला का उपयोग कर चैनलों के बंटवारे के बाद एक एकल कैमरे पर पूरा किया जा सकता है (चित्रा 2) या दो समान कैमरों का उपयोग कर । 16 बिट छवियों की गतिशील रेंज सटीक ratiometric quantitation के लिए 8 बिट छवियों पर सिफारिश की है. कीड़ा व्यवहार के brightfield छवियों के लिए, हम एक 1 में ४.१ सांसद के पास-अवरक्त USB3 कैमरे के उपयोग पर कब्जा करने के लिए बड़े 2 एक्स 2 बिन्नी १,०२४ x १,०२४ ८-bit JPEG संपीड़न के बाद छवि दृश्यों पर कब्जा । बड़े FOV नए माइक्रोस्कोप मॉडल पर उपलब्ध एक वयस्क कीड़ा केवल मामूली विगनेटिंग (चित्रा 4E) के साथ 0.63 एक्स आवर्धन के बाद 20x पर visualized किया जा करने के लिए अनुमति देता है ।
हम मानक TTL वोल्टेज संकेतों का उपयोग करने के लिए रोशनी और फ्रेम पर कब्जा सिंक्रनाइज़ की सलाह देते हैं । क्योंकि विभिन्न सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में संभावित विलंब के, हम उपयोगकर्ताओं को कॉन्फ़िगर करें प्रतिदीप्ति कैमरा के साथ मास्टर के रूप में ट्रिगर outputs के साथ TTL अन्य सभी उपकरणों ड्राइविंग outputs. इस तरह, brightfield और स्टेज स्थिति की जानकारी प्रत्येक Ca के लिए एकत्र किया जाएगा2 + माप ।
भट्ठा-या गुंजयमान बिंदु-स्कैनिंग फोकल सूक्ष्मदर्शी आम तौर पर साझा फोकल सुविधाओं में पाया भी ratiometric Ca के दौरान उत्कृष्ट प्रदर्शन दे2 + इमेजिंग । इस तरह के उपकरणों brightfield24के साथ साथ दो या अधिक प्रतिदीप्ति चैनलों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस मामले में, फोकल pinhole अपनी अधिकतम व्यास के लिए खोला जाना चाहिए, और एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर अलग GCaMP5, mCherry, और अवरक्त brightfield संकेतों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यह एक मोटी (~ 20 µm) टुकड़ा से प्रकाश संग्रह अधिकतम है, जबकि अभी भी बाहर की अस्वीकृति-फोकस प्रतिदीप्ति की अनुमति । एक नकारात्मक पक्ष छोटे FOV और हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर अनुकूलन के लिए और अधिक प्रतिबंध है ।
सॉफ्टवेयर:
अधिकांश निर्माताओं जहाज और स्वामित्व सॉफ्टवेयर के साथ अपने कैमरे और सूक्ष्मदर्शी स्थापित आदानों और outputs ट्रिगर के विंयास सहित, । रिकॉर्डिंग के दौरान इस सॉफ़्टवेयर की सुविधाएं और प्रदर्शन भिंन हो सकते हैं । क्योंकि तेजी से चल कीड़े ट्रैक करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, रिकॉर्डिंग के दौरान छवि प्रदर्शन चिकनी और 20 हर्ट्ज पर स्थिर होने की जरूरत है । प्रदर्शन में सुधार करने के लिए, छवि दृश्यों को अस्थायी रूप से प्रयोग के अंत में सहेजे गए व्यवहार संगत उपसेट्स के साथ RAM में सहेजा जा सकता है. इन दो-चैनल छवि अनुक्रम फ़ाइलें Ratiometric Quantitation सॉफ़्टवेयर में आयात करने के लिए खोलें छवि Cytometry मानक स्वरूप (. ics) में कनवर्ट किया जा सकता है । OME-tiff एक नवीनतम खुला-स्रोत छवि स्वरूप है, यद्यपि अलग स्थापना tiff छवि अनुक्रम 4 GB से अधिक सहेजने में असमर्थ हो सकता है ।
quantitation पाइपलाइन की एक प्रमुख विशेषता अनुपात चैनल की पीढ़ी है और फिर एक निष्पक्ष छवि विभाजन प्रक्रिया mCherry प्रतिदीप्ति का उपयोग करने के लिए ब्याज की कोशिकाओं को खोजने के लिए । प्रत्येक मिले ऑब्जेक्ट से, ऑब्जेक्ट आकार, XY केन्द्रक स्थिति, और ंयूनतम, माध्य, और प्रत्येक चैनल (अनुपात चैनल सहित) के लिए अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता मान परिकलित किए जाते हैं । साथ में, इन मानों को intracellular Ca2 + में प्रत्येक timepoint रिकॉर्डिंग में परिवर्तन quantitate करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रत्येक timepoint के लिए ऑब्जेक्ट माप बाद में विश्लेषण के लिए एक. csv फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जाता है ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल की एक प्रमुख सीमा सॉफ्टवेयर उत्पादों के चिथड़े के माध्यम से विभिन्न रूपों में डेटा ले जाने पर निर्भरता है । एक अतिरिक्त जलन यह है कि सॉफ्टवेयर के कुछ खुले स्रोत और मुक्त है, जबकि दूसरों को बंद कर रहे हैं, महंगा है, और असमान अद्यतन । एक प्रमुख सुधार का उपयोग करें या सॉफ्टवेयर का एक टुकड़ा (आदर्श खुला स्रोत) है कि प्रदर्शन और आसानी से अधिग्रहण से विश्लेषण के लिए उपयोग के समान स्तर प्रदान करता है विकसित होगा । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, ratiometric विश्लेषण दोनों फ़ाइल आकार और एक प्रयोग पूरा करने के लिए आवश्यक समय डबल्स । कैमरा ड्राइवरों की पीढ़ी है कि बोनसाई की तरह उपयोगकर्ता अनुकूलन चौखटे में एकीकृत किया जा सकता है छवियों और अंय डेटा धाराओं को एकत्र करने की अनुमति होगी और वास्तविक समय में विश्लेषण, काफी प्रवाह में सुधार होगा ।
भविष्य की संभावनाएं:
हम आम तौर पर कीड़ा आंदोलनों को मैन्युअल रूप से ट्रैक करते हैं, अवरक्त उज्ज्वल में पाया कीड़ा केन्द्रक की ट्रैकिंग-या डार्क-फ़ील्ड रिकॉर्डिंग स्टेज स्थिति और स्वचालित के बंद लूप समायोजन प्रदान कि अतिरिक्त छवि प्रसंस्करण नोड्स के लिए अनुमति चाहिए ट्रैकिंग (चित्र 3 और डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस विधि के साथ प्राप्त प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग के बहुमत अंधेरे और जैविक रूप से दिलचस्प डेटा से रहित है । पर सेंसर या वास्तविक समय के बाद अधिग्रहण छवि प्रसंस्करण तकनीक है कि फसल छवि अनुक्रम प्रासंगिक वस्तुओं के लिए वृद्धि हुई स्थानिक संकल्प के लिए अनुमति देते हैं और डेटा विश्लेषण पाइपलाइन में तेजी लाने, विशेष रूप से यदि प्रत्येक के लिए अतिरिक्त Z-स्लाइस एकत्र कर रहे हैं timepoint सर्किट में सभी पूर्व और postsynaptic कोशिकाओं के भीतर गतिविधि कल्पना करने के लिए ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम NINDS से केएमसी (R01 NS086932) के लिए अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया । LMN को NIGMS IMSD प्रोग्राम (R25 GM076419) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । इस अध्ययन में प्रयुक्त उपभेदों C. एलिगेंस जेनेटिक्स केंद्र, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है. हम उपयोगी चर्चा के लिए जेंस बेकर और मेसन क्लेन धंयवाद ।
C. elegans growth, cultivation, and mounting | |||
Escherichia coli bacterial strain, OP50 | Caenorhabditis Genetic Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1 |
HSN GCaMP5+mCherry worm strain | Caenorhabditis Genetic Center | LX2004 | Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN. Full genotype: vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X |
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation | author | LX1832 | Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request |
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid | author | pL15EK | Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request |
pKMC299 plasmid | author | pKMC299 | Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region |
pKMC300 plasmid | author | pKMC300 | Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P8281 | For preparation of NGM plates |
Potassium Phosphate Dibasic | Sigma | P5655 | For preparation of NGM plates |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 0662 | For preparation of NGM plates |
Calcium Chloride Dihydrate | Alfa Aesar | 12312 | For preparation of NGM plates |
Peptone | Becton Dickinson | 211820 | For preparation of NGM plates |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | For preparation of NGM plates |
Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | For preparation of NGM plates |
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure | Affymetrix | 10906 | For preparation of NGM plates |
60 mm Petri dishes | VWR | 25384-164 | For preparation of NGM plates |
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 | VWR | 48393-251 | Cover glass through which worms are imaged |
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 | VWR | 48366-067 | Cover glass that covers the top of the agar chunk |
Stereomicroscope with transmitted light base | Leica | M50 | Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting |
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm | ALFA AESAR | AA39526-BW | For worm transfer |
Calcium imaging microscope | |||
Anti-vibration air table | TMC | 63-544 | Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top |
Inverted compound microscope | Zeiss | 431007-9902-000 | Axio Observer.Z1 inverted microscope |
Sideport L80/R100 (3 position) | Zeiss | 425165-0000-000 | To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera |
Tilt Back Illumination Carrier | Zeiss | 423920-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Lamphousing 12V/100W w/ Collector | Zeiss | 423000-9901-000 | For infrared/behavior imaging |
Halogen lamp 12V/100W | Zeiss | 380059-1660-000 | For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter |
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp | Zeiss | 447958-9000-000 | BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior |
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized | Zeiss | 424244-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Condenser & Shutter | Zeiss | 423921-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera | Zeiss | 425536-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Eyepiece 10x, 23mm | Zeiss | 444036-9000-000 | For worm localization on the agar chunk |
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier | Zeiss | 426113-0000-000 | Mount for infrared CMOS camera |
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) | FLIR (formerly Point Grey Research) | GS3-U3-41C6NIR-C | Camera for brightfield imaging |
USB 3.0 Host Controller Card | FLIR (formerly Point Grey Research) | ACC-01-1202 | Fresco FL1100, 4 Ports |
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector | FLIR (formerly Point Grey Research) | ACC-01-3000 | Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5 |
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 | Zeiss | 420650-9901-000 | Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance |
6-cube Reflector Turret, Motorized | Zeiss | 424947-0000-000 | For fluorescence imaging |
Fluorescence Light Train, Motorized | Zeiss | 423607-0000-000 | For fluorescence imaging |
Fluorescence Shutter | Zeiss | 423625-0000-000 | For fluorescence imaging |
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) | Zeiss | 489062-9901-000 | FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging |
LED illumination system | Zeiss | 423052-9501-000 | Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination |
GFP LED module (470 nm) | Zeiss | 423052-9052-000 | Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation |
mCherry LED module (590 nm) | Zeiss | 423052-9082-000 | Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation |
Iris stop slider for incident-light equipment | Zeiss | 000000-1062-360 | Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view |
C-Mount Adapter 1" 1.0x | Zeiss | 426114-0000-000 | Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera |
Image splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras |
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) | Semrock | Di02-R594-25×36 | Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals |
GFP emission filter (image splitter) | Semrock | FF01-525/30-25 | Capturing GCaMP5 fluorescence |
mCherry/ emission filter (image splitter) | Semrock | FF01-647/57-25 | This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging |
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) | Hamamatsu | A12802-01 / C11440-22CU | Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter |
Motorized XY Stage | Märzhäuser | SCAN IM 130 x 100 | Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step |
XY Stage controller with joystick | LUDL | MAC6000, XY joystick | Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud |
Digital Acquisition board (DAQ) | Arduino | Uno | Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud |
BNC Male to BNC Male Cable – 6 ft | Hosa Technology | HOBB6 | BNC connectors for TTL triggering |
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") | uxcell | 608641773651 | To connect the fluorescence camera trigger outputs |
BNC turn head adapter | Hantek | RRBNCTH21 | BNC to Banana Plug Adapter (4mm) |
BNC female to female connector | Diageng | 20130530009 | Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug |
Solderless flexible breadboard jumper wires | Z&T | GK1212827 | To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ. Male to male. |
High performace workstation | HP | Z820 | Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives |
M.2 Solid state drive | Samsung | MZ-V5P512BW | High-speed streaming and analysis of image data |
M.2 Solid state drive adapter for workstations | Lycom | DT-120 | M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter |
Network attached storage | Synology | DS-2415+ | Imaging data storage and analysis |
Hard disk drives | Western Digital | WD80EFZX | RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy) |
Software | |||
Fluorescence Acquisition | Hamamatsu | HCImage DIA | Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps |
Brightfield Acquisition | FLIR (formerly Point Grey Research) | Flycapture | Recording of brightfield JPEG image sequences |
Stage Serial Port Reader | Bonsai | https://bitbucket.org/horizongir/bonsai | Facilitates tracking of worms during behavior |
LED controller software | Zeiss | Micro Toolbox Test 2011 | To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit |
ImageJ | NIH | https://imagej.net/Fiji/Downloads | Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software |
Excel | Microsoft | 2002984-001-000001 | For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis |
Peak Finding | MATLAB | R2017a | Script used for Ratio peak feature calculations |
Ratiometric Quantitation | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects |
Scripts | |||
AnalyzeGCaMP_2017.m | MATLAB | Mean Ratio and XY centroid script | Analyzes a ratiometric output in .csv format, consolidating objects and centroid positions, calculating ratio changes (∆R/R), identifying peaks and peak features, and writing plots (with and without annotated peaks) in postscript format. For matrix file import, the script will output data into three folders: analyzed, peaks, and traces. 'Analyzed' output is a matrix file of the consolidated objects with six columns (units): time (s), area (square microns), ratio, X centroid (microns), Y centroid (microns), and ∆R/R. 'Peaks' output is a matrix file of the timepoints of found peaks, the amplitude (in ∆R/R), the peak width (s), and the prominance of the peak. 'Traces' output are postscript files of calcium traces. |
XY-stage-final.bonsai | Bonsai | TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader | Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps). X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. |