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Neuroscience

Ratiometric व्यवहार में व्यक्तिगत ंयूरॉंस की कैल्शियम इमेजिंग Caenorhabditis एलिगेंस

doi: 10.3791/56911 Published: February 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग Ca के उपयोग का वर्णन करता है2 + रिपोर्टर Caenorhabditis एलिगेंस कीड़े व्यवहार में तंत्रिका गतिविधि में परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए.

Abstract

यह तेजी से स्पष्ट है कि तंत्रिका सर्किट जानवरों के व्यवहार में गतिविधि है कि anesthetized या मैटीरियल जानवरों में देखा से काफी अलग हो गया है । अति संवेदनशील, सीए2 + के आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर सेल और synaptic गतिविधि जानवरों के व्यवहार में गैर इनवेसिव ऑप्टिकल दृष्टिकोण का उपयोग कर की रिकॉर्डिंग में क्रांति ला दिया है । जब आनुवंशिक और optogenetic तकनीक के साथ संयुक्त, आणविक तंत्र है कि सेल और सर्किट गतिविधि अलग व्यवहार राज्यों के दौरान मिलाना पहचाना जा सकता है ।

यहाँ हम ratiometric Ca के लिए तरीकों का वर्णन2 + स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर Caenorhabditis एलिगेंस कीड़े में एकल न्यूरॉन्स की इमेजिंग. हम एक सरल बढ़ते तकनीक है कि धीरे से एक मानक निमेटोड विकास मीडिया (NGM) एक गिलास coverslip के साथ आगर ब्लॉक पर बढ़ कीड़े ओवरले का प्रदर्शन, पशुओं की अनुमति के लिए उच्च संकल्प पर दर्ज की अप्रतिबंधित आंदोलन और व्यवहार के दौरान । इस तकनीक के साथ, हम संवेदनशील ca2 + रिपोर्टर GCaMP5 का उपयोग करने के लिए intracellular ca2 + में परिवर्तन रिकॉर्ड serotonergic द्विलिंग विशिष्ट ंयूरॉंस (HSNs) में वे अंडा बिछाने व्यवहार ड्राइव के रूप में । द्वारा सह व्यक्त mCherry, एक Ca2 +असंवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन, हम ~ 1 µm भीतर एचएसएन की स्थिति को ट्रैक कर सकते है और प्रतिदीप्ति में उतार चढ़ाव के लिए सही ध्यान या आंदोलन में परिवर्तन की वजह से । एक साथ, अवरक्त brightfield इमेजिंग व्यवहार रिकॉर्डिंग और एक मोटर की अवस्था का उपयोग कर जानवर ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है । इन सूक्ष्म तकनीक और डेटा धाराओं को एकीकृत करके, हम सीए रिकॉर्ड कर सकते हैं2 + C. एलिगेंस अंडा में गतिविधि सर्किट बिछाने के रूप में यह मिनट के दसियों से अधिक निष्क्रिय और सक्रिय व्यवहार राज्यों के बीच प्रगति.

Introduction

तंत्रिका विज्ञान के एक केंद्रीय लक्ष्य को समझने की कैसे ंयूरॉंस सर्किट में संवाद करने के लिए पशु व्यवहार ड्राइव है । सर्किट गतिविधि बदलने के क्रम में तंत्रिका सर्किट विविध संवेदी cues की एक श्रृंखला को एकीकृत, जिससे जानवरों के लिए अपने वातावरण का जवाब करने के लिए आवश्यक व्यवहार परिवर्तन ड्राइविंग । निमेटोड, सी. एलिगेंस, ३०२ न्यूरॉन्स जिनके synaptic कनेक्शन पूरी तरह से1मैप किया गया है के साथ एक सरल तंत्रिका तंत्र है. इसके अतिरिक्त, जीन है कि neurotransmission में शामिल प्रोटीन के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना अत्यधिक C. एलिगेंस और स्तनधारी2के बीच संरक्षित कर रहे हैं । इसके तंत्रिका तंत्र की संरचनात्मक सादगी के बावजूद, यह एक उपजाऊ मंच प्रदान करने के लिए कैसे ंयूरॉंस व्यवहार को विनियमित समझने की एक जटिल प्रदर्शनों की व्यवस्थाओं को प्रदर्शित करता है3

C. एलिगेंस आनुवंशिक हेरफेर के रूप में दृष्टिकोण की एक विस्तृत श्रृंखला के आवेदन के लिए उत्तरदायी है, लेजर सेल पृथक, electrophysiological तकनीक, साथ ही vivo में ऑप्टिकल इमेजिंग4,5. हाल के अध्ययनों से प्रमुख न्यूरोट्रांसमीटर सिग्नलिंग सिस्टम के विस्तृत नक्शे का उत्पादन किया है C. एलिगेंस कोलीनर्जिक और GABAergic न्यूरॉन नेटवर्क सहित. इन अध्ययनों के साथ चल रहे अध्ययनों के साथ सभी की अभिव्यक्ति का नक्शा करने के लिए ंयूरॉन जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स एक अद्वितीय स्थिति में इस मॉडल जगह अत्यधिक विस्तृत संरचनात्मक और कार्यात्मक ंयूरॉंस कनेक्टिविटी नक्शे को पूरी तरह से समझने के लिए कैसे इन विभिंन रिसेप्टर्स और timescales के माध्यम से विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर संकेत पशु व्यवहार के विभिन्न पहलुओं को ड्राइव करने के लिए.

आदेश में किसी भी प्रणाली में गतिशील ंयूरॉंस गतिविधि पैटर्न का अध्ययन करने के लिए, एक आवश्यक शर्त को मजबूत तरीके से व्यवहार के दौरान व्यक्तिगत ंयूरॉंस या पूरे सर्किट में गतिविधि रिकॉर्ड विकसित है । विशेष रूप से महत्वपूर्ण presynaptic गतिविधि है कि ड्राइव synaptic पुटिका संलयन कल्पना करने के लिए इस तरह के ऑप्टिकल दृष्टिकोण की सुविधा है । intracellular Ca के तेज और अति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रिपोर्टर2 +, संवेदनशील photodetectors की बढ़ती उपलब्धता के साथ, व्यवहार के दौरान जाग, रहने वाले जानवरों में सेल और synaptic गतिविधि की रिकॉर्डिंग में क्रांति ला दिया है. क्योंकि synaptic विद्युत गतिविधि का एक प्रमुख परिणाम के लिए सीए2 + चैनलों को विनियमित है, intracellular ca में परिवर्तन2 + ईमानदारी से सेल गतिविधि में व्यवहार प्रासंगिक परिवर्तन की रिपोर्ट के लिए लगा रहे हैं ।

इस अध्ययन में, हम एक दृष्टिकोण ratiometric Ca2 + serotonergic एचएसएन मोटर न्यूरॉन्स में इमेजिंग कि अंडा- सी. एलिगेंस6,7में व्यवहार बिछाने को बढ़ावा देने के लिए प्रस्तुत करते हैं । इस दृष्टिकोण के पिछले प्रयासों पर बनाता है Ca2 + C. एलिगेंस में गतिविधि और अंडे-व्यवहार के दौरान सर्किट बिछाने5,8,9,10,11 . विधि एक साथ सेल में मनाया परिवर्तन और अंडा बिछाने की घटनाओं के साथ-साथ पशु हरकत राज्य में परिवर्तन को सहसंबंधी बनाना अनुमति देता है । हालांकि हम इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए वयस्क कीड़े, हमारी प्रयोगशाला से अप्रकाशित काम में गतिविधि का अध्ययन इस दृष्टिकोण चौथे लार्वा (L4) मंच पर किशोर जानवरों के लिए बढ़ाया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से । यह संभावना है कि अंय सी. एलिगेंस ंयूरॉंस की गतिविधि है कि अलग सर्किट और व्यवहार में काम इसी तरह इस तकनीक के साथ पहुंच जाना चाहिए । दूसरे हाल ही में विकसित तेजी से सीए2 + गैर अतिव्यापी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ संकेतक12,13,14,15,16, optogenetic उपकरण17 , और आनुवंशिक रूप से encoded ऑप्टिकल संकेतक झिल्ली वोल्टेज की18, हम में प्रवेश करने के लिए अनुमति चाहिए ' सभी ' ऑप्टिकल जांच में कैसे परिवर्तन के तंत्रिका सर्किट गतिविधि ड्राइव अलग व्यवहार राज्यों ।

Protocol

1. उपभेदों, संस्कृति मीडिया, और पशुओं के बढ़ते

  1. मानक ६०-mm निमेटोड विकास मध्यम (NGM) पर 20 डिग्री सेल्सियस पर सी. एलिगेंस कीड़े बढ़ते OP50 ई. कोलाई बैक्टीरियल खाद्य19के साथ बीज प्लेटें ।
  2. हित के प्रत्येक कोशिका-विशिष्ट प्रवर्तक के लिए दो plasmids तैयार करें: एक, GCaMP5 की ड्राइविंग एक्सप्रेशन को intracellular Ca2 +रिकॉर्ड करने के लिए, और दूसरा, ड्राइविंग एक्सप्रेशन ऑफ mCherry के ratiometric quantitation के लिए अनुमति देने के लिए GCaMP5 प्रतिदीप्ति परिवर्तन और ऑब्जेक्ट ढूँढना और माप को सरल बनाएँ.
    नोट: GCaMP5: mCherry ratiometric इमेजिंग GCaMP5 प्रतिदीप्ति में उतार चढ़ाव के लिए सही है कि फोकस और पशु आंदोलन में परिवर्तन से परिणाम, intracellular Ca2 +में वास्तविक परिवर्तन नहीं ।
  3. GCaMP5 इंजेक्षन-और mCherry-व्यक्त plasmids प्लाज्मिड लाइट-1 (gonads), lin-15 (LX1832) एक्स उत्परिवर्ती जानवरों के ce314 में pL15EK दिखाई बचाव मार्कर n765ts के साथ साथ और गैर एमयूवी लिन-15 (+) पशुओं GCaMP5 व्यक्त करने और mCherry से एक उच्च-प्रतिलिपि transgene20,21,22। नीले प्रकाश परिहार व्यवहार23,24को कम करने के लिए लाइट-1 उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि का प्रयोग करें ।
  4. गुणसूत्रों के लिए transgenes एकीकृत करने के लिए मोज़ेक को कम करने और यौगिक उत्परिवर्ती उपभेदों की पीढ़ी को सरल25
    नोट: LX2004 तनाव यहां वर्णित एक एकीकृत उच्च-प्रतिलिपि transgene है कि GCaMP5 और mCherry से HSNs में व्यक्त किया जाता है एनएलपी-3 प्रमोटर ( सामग्री की तालिकादेखें)26,27, 28 , 29. एनएलपी-3 प्रमोटर एचएसएन विकास या अंडा में महत्वपूर्ण दोषों के कारण बिना देर L4 और वयस्क जानवरों के HSNs में मजबूत अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए परीक्षण किया गया था (उदाहरण के लिए, फड-1,) (उदा. egl-6, और unc-८६) । यह तनाव और दूसरों कि ventral कॉर्ड (VC) मोटर न्यूरॉन्स, वल्वल की मांसपेशियों में GCaMP5 और mCherry एक्सप्रेस, और uv1 neuroendocrine कोशिकाओं को Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र से उपलब्ध है और उनके निर्माण का विवरण वर्णित किया गया है 27.
  5. एक बीज NGM आगर प्लेट से एक प्लैटिनम कीड़ा लेने के नीचे करने के लिए OP50 बैक्टीरियल खाना लागू करें, और इसका इस्तेमाल करने के लिए स्थानांतरण ~ 20 देर L4 LX2004 पशुओं कि एक्सप्रेस GCaMP5 और mCherry से HSNs में एनएलपी-3 प्रमोटर । यह सुनिश्चित करें कि विकासशील योनी एक stereomicroscope में एक स्पष्ट अंधेरे एक सफेद वर्धमान से घिरा स्थान के रूप में प्रकट होता है । 24-40 एच के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर जानवरों की मशीन ।
  6. इस मशीन के बाद, लेने के लिए OP50 लागू करें और स्थानांतरण ~ कीड़े के 3 एक unअस्तव्यस्त NGM प्लेट को, कीड़े के लिए पीछे भोजन की एक छोटी राशि छोड़ने के लिए इमेजिंग के दौरान पर फ़ीड । पर्याप्त भोजन सुनिश्चित करें, के रूप में बहुत कम बैक्टीरियल खाना कीड़े को प्रोत्साहित करने के लिए थाली के केंद्र से दूर भटकना होगा, जबकि बहुत अधिक भोजन पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और कारण हाइपोक्सिया वृद्धि होगी ।
  7. एक फ्लैट गोल रंग का उपयोग करने के लिए एक ~ 20 मिमी x 20 मिमी हिस्सा कीड़े ले थाली से कट और एक साफ 24 मिमी x ६० मिमी #1 .5 coverslip (चित्रा 1) के केंद्र पर हिस्सा चेहरा नीचे हस्तांतरण. एक तरफ से आवेदन शुरू coverslip के तहत फंस जा रहा है और इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप से बुलबुले रखने के लिए । एक 22 मिमी x 22 मिमी #1 coverslip खंड के शीर्ष करने के लिए चिपकाएं और वाष्पीकरण को कम करने के लिए लागू करें ।

2. हार्डवेयर और इंस्ट्रूमेंटेशन सेटअप

  1. एक ≥ ०.७ संख्यात्मक एपर्चर योजना के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर मंचन, ट्रांसजेनिक कीड़े प्लेस-Apochromat 20x उद्देश्य, एक जॉयस्टिक, एक छवि अलगानेवाला, और एक साथ प्रतिदीप्ति के लिए GCaMP5 फिल्टर के साथ नियंत्रणीय XY स्टेज मोटर चालित, और mCherry उत्तेजना और उत्सर्जन, प्रतिदीप्ति और अवरक्त brightfield इमेजिंग के लिए कैमरा, और एक ट्रिगर प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) रोशनी प्रणाली (चित्रा 2) ।
    नोट: एक 80/20 बीम-अलगानेवाला प्रतिदीप्ति कैमरा और brightfield कैमरा के लिए 20% करने के लिए छवि संकेत के ८०% भेजता है । एक ईमानदार खुर्दबीन भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन NGM हिस्सा एक गिलास स्लाइड और इस मामले में बड़े coverslip के बीच में रखा जाना चाहिए ।
    1. इमेजिंग के लिए एक कीड़ा का चयन करने के लिए दूरबीन eyepieces का प्रयोग करें । जब एक जानवर चयनित है, संघनित्र के ऊपर जगह में अवरक्त फिल्टर स्लाइड ।
  2. ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर तर्क (TTL) ट्रिगर
    1. प्रतिदीप्ति कैमरा पर तीन TTL ट्रिगर उत्पादन लाइनों में से प्रत्येक से समाक्षीय केबल देते हैं । एलईडी रोशनी प्रणाली के #3 BNC इनपुट के लिए पहली उत्पादन कनेक्ट ।
    2. 8 पिन GPIO कनेक्टर GPIO इनपुट #3 (पिन 4) और जमीन (पिन 5) के अवरक्त कैमरा, क्रमशः से चलाने से हरे और भूरे रंग के तारों के साथ एक ' BNC केले ' एडाप्टर के लिए दूसरा आउटपुट कनेक्ट करें ।
    3. डिजिटल अधिग्रहण डिवाइस में #8 डिजिटल इनपुट और जमीन के लिए चल रहे जंपर तारों के साथ एक BNC ' केले ' एडाप्टर के लिए तीसरे आउटपुट कनेक्ट (चित्रा 2बी) ।
  3. डिजिटल अधिग्रहण डिवाइस (DAQ)
    1. DAQ microcontroller बोर्ड कनेक्ट ( सामग्री की तालिकादेखें) एक यूएसबी केबल के माध्यम से पीसी के लिए. मानक Firmata प्रोटोकॉल के साथ फर्मवेयर अद्यतन ( सामग्री की तालिकादेखें) और ५७६०० बॉड पर संचार करने के लिए यूएसबी पोर्ट विन्यस्त करें.
  4. एल
    1. एलईडी नियंत्रक सॉफ्टवेयर भागो ( सामग्री की तालिकादेखें). ' सतत ' से ' Gated ' के लिए ट्रिगर मोड स्विच और ४७० और ५९० एनएम एल ई डी दोनों के लिए ' 3 ' का चयन करें ट्रिगर चैनल ।
    2. चालू करें और प्रत्येक एलईडी के लिए नेतृत्व शक्ति दर्ज करें (उदा, ४७० एनएम सेट 20% और ५९० एनएम ४०% करने के लिए नेतृत्व करने के लिए नेतृत्व किया.
  5. इस धारावाहिक-स्टेज कम्युनिकेशन स्क्रिप्ट ' XY-स्टेज-फाइनल ' बोनसाई में चलाएं ( सामग्री की तालिकादेखें)30। धूसर ' CsvWriter ' नोड पर क्लिक करें और रिकॉर्ड किए गए X और Y चरण जानकारी (चित्र 3) को सहेजने के लिए किसी फ़ोल्डर को चुनें । DAQ को प्रारंभ करने के लिए उपकरण पट्टी में हरा ऐरोहेड दबाएं ।
    नोट: स्क्रिप्ट प्रतिदीप्ति कैमरा एक TTL संकेत भेजता है जब एक्स और वाई चरण स्थिति रिकॉर्डिंग शुरू कर देंगे. यह स्क्रिप्ट डेटा के चार स्तंभों को आउटपुट: फ़्रेम संख्या, X स्थिति (µm), Y स्थिति (µm), और फ़्रेम (s) के बीच का अंतराल ।
  6. अवरक्त कैमरा रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में ( सामग्री की तालिकादेखें) के तहत ' कस्टम वीडियो मोड, ' का चयन करें "मोड 1" (2 एक्स 2 बिन्नी; १,०२४ x १,०२४ पिक्सल), और "पिक्सेल प्रारूप रॉ 8". के अंतर्गत ' ट्रिगर/स्ट्रोब ', ट्रिगर इनपुट लाइन (GPIO) के लिए सेट "3", ध्रुवीयता को "उच्च", ' मोड ' करने के लिए "14". एक TTL ट्रिगर संकेत प्राप्त होने तक फ़्रेम प्राप्ति रोकने के लिए ' सक्षम ' टॉगल करें ।
    1. कि खिड़की खुला छोड़ने, मुख्य कैमरा दृश्य उपकरण पट्टी पर लाल "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करें । सहेजे जाने के लिए छवि अनुक्रम के लिए फ़ोल्डर का चयन करें । ' बफ़र्ड ' रिकॉर्डिंग मोड का चयन करें, और JPEG स्वरूप में ' छवियाँ ' सहेजें । अधिग्रहण आरंभ करने के लिए "रिकॉर्डिंग शुरू" पर क्लिक करें ।
  7. प्रतिदीप्ति कैमरा और छवि अलगानेवाला
    नोट: ratiometric quantitation के लिए उचित छवि पंजीकरण सुनिश्चित करने के लिए GCaMP5 और mCherry प्रतिदीप्ति चैनल एक साथ एकत्रित किए जाने चाहिए । एक छवि अलगानेवाला GCaMP5 और mCherry प्रतिदीप्ति के दो चैनल अधिग्रहण एक संवेदक पर अनुमति देता है ।
    1. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के ' कब्जा ' टैब में ( सामग्री की तालिकादेखें), 10 ms के लिए जोखिम समय सेट, 4x करने के लिए, और 16-bit छवि गहराई । ५१२ पिक्सेल चौड़े २५६ पिक्सेल उच्च द्वारा एक केंद्रित कैमरा उपसरणी का चयन करें । ' शो आउटपुट ट्रिगर विकल्प ' पर क्लिक करें और सभी ट्रिगर करने के लिए ' सकारात्मक सेट.
      नोट: यदि वे 10 ms या उससे कम हैं, तो DAQ कभी भी TTL ट्रिगर्स याद कर सकते हैं ।
    2. सुनिश्चित करें कि ' ट्रिगर 1 ' और ' ट्रिगर 2 ' के लिए ' एक्सपोजर ' सेट कर रहे हैं, जबकि ' ट्रिगर 3 ' 25 ms की ' एक अवधि ' के साथ प्रोग्राम करने के लिए सेट है । ' अनुक्रम ' टैब के अंतर्गत, 20 हर्ट्ज पर छवियों को इकट्ठा करने के लिए ५० ms के एक ' फील्ड Delay1 ' के साथ ' टाइम चूक ' का चयन करें. ' अस्थाई बफ़र में सहेजें ' का चयन करें ।
  8. पीएमटी गेन और लेजर तीव्रता के दौरान तीन चैनल फोकल इमेजिंग
    1. PMT लाभ सेट करें ताकि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति सिर्फ न्यूनतम (काले स्तर) के ऊपर एक स्तर पर है. ५६१ एनएम (हरा) लेजर शक्ति बढ़ाएं जब तक एक भी संतृप्त 12-bit या 16-bit पिक्सेल mCherry चैनल में presynaptic टर्मिनस पर मनाया जाता है ।
    2. ४८८ एनएम (नीला) लेजर तीव्रता समायोजित करें ताकि GCaMP5 प्रतिदीप्ति बस presynaptic ऊपर पृष्ठभूमि में दिखाई दे रहा है । यह कम सेटिंग GCaMP5 पिक्सेल के संतृप्ति रोकता है जब मजबूत Ca के जवाब में प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है2 + यात्रियों । प्रकाश कैप्चर को अधिकतम करने के लिए सभी तरह के फोकल pinhole खोलें ।

3. Ratiometric Ca2 + इमेजिंग और व्यवहार रिकॉर्डिंग

  1. प्रतिदीप्ति अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में ' अनुक्रम ' टैब के अंतर्गत, रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए "प्रारंभ" पर क्लिक करें । जॉयस्टिक के साथ कीड़ा ट्रैक, सेल (ओं) और ध्यान में ब्याज की synapses और दृश्य (FOV) के क्षेत्र के केंद्र में रखते हुए । प्रत्येक चैनल के पिक्सेल आँकड़े दिखाने के लिए हिस्टोग्राम विंडो में ' आँकड़े ' बटन पर क्लिक करें.
  2. एलईडी शक्ति को समायोजित करने के लिए एक अधिकतम एकल पिक्सेल mCherry प्रतिदीप्ति सुनिश्चित करने के presynaptic टर्मिनस पर ≥ ८,००० गणना (~ ४,००० photoelectrons), दे एक ~ 12-बिट पृष्ठभूमि के ऊपर गतिशील रेंज (~ १०० photoelectrons). GCaMP5 (कम) Ca के दौरान presynaptic टर्मिनस पर सिग्नल2 + के आसपास होना चाहिए ~ २,५०० मायने रखता है-बस ऊपर पृष्ठभूमि दिखाई ।
  3. एक अंडा बिछाने सक्रिय राज्य तक पहुँच गया है जब तक रिकॉर्ड; आम तौर पर यह एक जंगली प्रकार कृमि7में हर 20-30 मिनट होता है । एक 10-ंयूनतम सबसेट (१२,००१ फ़्रेम), ६,००० फ़्रेम पहले और पहले अंडा-बिछाने घटना (फ़्रेम ६,००१) के बाद सहेजें । वर्म व्यवहार और XY चरण स्थिति के timepoints की brightfield छवियों का एक ही सबसेट रखने के लिए सुनिश्चित हो, या डेटा स्ट्रीम्स का सटीक सिंक्रनाइज़ेशन खो जाएगा ।
  4. ImageJ और ( सामग्री की तालिकादेखें)) छवि Cytometry मानक (. ics) प्रारूप करने के लिए छवि दृश्यों को परिवर्तित करने के लिए ताकि यह Ratiometric Quantitation सॉफ्टवेयर में आयात किया जा सकता है का उपयोग करें ।

4. छवि विभाजन और मात्रात्मक विश्लेषण

  1. Ratiometric Quantitation सॉफ़्टवेयर में छवि अनुक्रम आयात करें ( सामग्री की तालिकादेखें) । ' उपकरण ' मेनू में ' ऑटो कंट्रास्ट ' क्लिक करें, और प्रत्येक चैनल के विपरीत समायोजित करने के लिए उपयुक्त काले (~ १,८००) और सफेद स्तर (१०,०००) की स्थापना । mCherry और GCaMP5 चैनल रंग असाइनमेंट सही है की पुष्टि करने के लिए उपकरण मेनू में ' रंग बदलें... ' का चयन करें (चित्र 4A-C) ।
    1. ' अनुक्रम ' टैब में समय श्रृंखला पर राइट क्लिक करें और यह 20 फ्रेम करने के लिए सेट/एस और १.२५ µm/पिक्सेल ।
  2. ' टूल ' मेनू से ' अनुपात ' का चयन करें और ' GCaMP5 ' के लिए ' चैनल A ' और ' mCherry ' के लिए ' चैनल बी ' का चयन करें । प्रत्येक छवि अनुक्रम से पृष्ठभूमि घटाना करने के लिए ' थ्रेसहोल्ड ' के बगल में "गणना" पर क्लिक करें. चुनें "अनुपात चैनल के लिए एक इंद्रधनुष LUT लागू करें" ।
    नोट: ०.३ (कम ca2 +) और 2-3 के एक अधिकतम अनुपात (उच्च ca2 +) के एक माध्य आधार रेखा अनुपात के साथ एक रिकॉर्डिंग के लिए, एक उपयुक्त लुकअप तालिका 0 (नीला) से 1 (लाल) होगा ।
  3. mCherry चैनल (चित्रा 4डी) का उपयोग कर एक तीव्रता संग्राहक अनुपात चैनल उत्पन्न करें । तीव्रता संग्राहक अनुपात चैनल के एक लाखों रंग की छवि है, जहां अनुपात रंग mCherry चैनल की चमक पर मैप किया गया है ।
  4. ' माप ' टैब के तहत, ' प्रोटोकॉल ' फलक के लिए ' तीव्रता का उपयोग कर ऑब्जेक्ट्स ढूँढें ' उपकरण खींचकर एक ऑब्जेक्ट ढूँढना प्रोटोकॉल बनाएँ । mCherry तीव्रता मानों की विंडो सेट करने और ऑब्जेक्ट्स ढूँढने के लिए ' दांता ' पर क्लिक करें.
    1. चुनें तीव्रता मूल्यों ≥ 2 मानक विचलन (एसडी) ऊपर पृष्ठभूमि (उदा., की निचली सीमा ~ २,५००, ६५,५३५ की ऊपरी सीमा) । सुनिश्चित करें कि presynaptic टर्मिनस का पता चला है और ' स्वचालित रूप से अद्यतन प्रतिक्रिया ' माप मेनू से चुना जाता है ।
      नोट: सॉफ्टवेयर भी एक संबंधित ' प्रोटोकॉल एसडी तीव्रता का उपयोग पृष्ठभूमि से उनके मानक विचलन द्वारा वस्तुओं की पहचान कर सकते हैं. हालांकि, अगर एक विशेष रूप से उज्ज्वल वस्तु FOV में प्रवेश करती है, यह नाटकीय रूप से उन timepoints के दौरान मतलब तीव्रता बदल सकते हैं, एचएसएन को खोजने के लिए इस्तेमाल किया तीव्रता कटऑफ को प्रभावित । यदि raw तीव्रता मान ऑब्जेक्ट्स को ढूँढने के लिए उपयोग किए जाते हैं, तो यह परिवर्तनशीलता उत्पन्न नहीं होगी ।
  5. केवल mCherry चैनल लक्ष्यीकरण अतिरिक्त फिल्टर जोड़ें (आकार, अधिकतम तीव्रता, आदि.) यदि आवश्यक हो तो सिर, पूंछ, और आंत प्रतिदीप्ति की तरह अवांछित वस्तुओं को बाहर करने के लिए । माप मेनू से ' माप आइटम बनाओ ' चुनें और ' All Timepoints ' चुनें ।
    नोट: यह प्रोटोकॉल निष्पादित करेगा, जो फ़ाइल मेनू में ' निर्यात करें ' आदेश का उपयोग कर निर्यात किया जाना चाहिए एक कॉमा सेपरेटेड वैल्यू (. csv) फ़ाइल के लिए सभी माप लिख रहा है ।
  6. निर्यातित. csv फ़ाइल खोलें और Timepoint, क्षेत्र (µm2), माध्य (अनुपात चैनल), केन्द्रक X (µm), और केन्द्रक Y (µm) डेटा को एक नए पत्रक में कॉपी करें । स्तंभ शीर्षलेखों के बिना. csv फ़ाइल निर्यात करें । Ratiometric Quantitation सॉफ़्टवेयर प्रति timepoint एक या अधिक ऑब्जेक्ट्स के रूप में रुचि के कक्ष को वर्गीकृत कर सकता है ।
    1. इन ऑब्जेक्ट्स को फिर से संयोजित करने के लिए, कस्टम स्क्रिप्ट ' AnalzyeGCaMP_2017. m ' का उपयोग करें ।
      नोट: स्क्रिप्ट डेटा में Ca2 + (अनुपात) चोटियों की भी पहचान करती है, और उनकी timepoints, पीक आयाम, और पीक चौड़ाई की. csv फ़ाइल सहेजता है । यह भी अपुष्ट और व्याख्या अनुपात अंश के लिए पोस्टस्क्रिप्ट फ़ाइलें जनरेट करता है । इस जानकारी के साथ, Ca2 + परिवर्तनीय आयाम और अंतर-परिवर्तनीय अंतराल निर्धारित किया जाना चाहिए ।
  7. प्रत्येक प्रतिदीप्ति ऑब्जेक्ट से आउटपुट x और y केन्द्रक मान जोड़ें बोनसाई से XY-स्टेज स्क्रिप्ट द्वारा रिकॉर्ड किए गए x और y मानों पर डालें । एक कृमि गतिवान ट्रेस उत्पन्न करने के लिए और अलग व्यवहार के साथ सेल विस्थापन और वेग की गणना करने के लिए नेट XY स्थिति का उपयोग करें31राज्यों ।
  8. रिकॉर्ड किए गए brightfield छवियों को ImageJ में एक वर्चुअल स्टैक के रूप में आयात करें । व्याख्या अंडा बिछाने घटनाओं और अंय व्यवहार । इन ईवेंट्स के समय का अनुपात ट्रेस से Ca2 + चोटियों की तुलना करें ।

Representative Results

सरल बढ़ते तकनीक यहां वर्णित (चित्रा 1) L4 और वयस्क सी. एलिगेंस की संस्कृति पर्यावरण के लिए ंयूनतम परिवर्तन का कारण बनता है, जबकि एक गिलास coverslip (चित्रा 4) के माध्यम से जानवरों के व्यवहार में उच्च संकल्प रिकॉर्डिंग की अनुमति । एलईडी प्रकाश स्रोतों, स्टेज नियंत्रकों, और कैमरा जोखिम के तुल्यकालन 20 फ्रेम में एकाधिक धाराओं से डेटा अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है/उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों (0.7-0.8) के साथ मध्यवर्ती आवर्धन (20x) अच्छा प्रदान करता है अंडा बिछाने व्यवहार सर्किट में synaptic क्षेत्र के स्थानिक संकल्प, यहां तक कि 4 x 4 पिक्सेल बिन्नी के साथ (१.२५ µm/पिक्सेल) । GCaMP5 और mCherry प्रतिदीप्ति संकेतों के एक साथ अधिग्रहण (चित्रा 4ए, बी) के लिए एक पिक्सेल द्वारा पिक्सेल अनुपात चैनल है कि पशु आंदोलन और फोकस (चित्रा 4डी) में परिवर्तन के लिए क्षतिपूर्ति उत्पंन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एचएसएन presynaptic टर्मिनस के रूप में बड़े है के रूप में कई ंयूरॉन कोशिका निकायों में C. एलिगेंस, और presynaptic एचएसएन Ca2 + में परिवर्तन स्पष्ट रूप से visualized किया जा सकता है । इंफ्रारेड brightfield कैमरा के बड़े FOV (चित्रा 4) रिकॉर्डिंग के दौरान मैन्युअल रूप से ट्रैक किया जा करने के लिए अनुमति देता है. प्रत्येक जानवर के लिए, intracellular Ca2 + में परिवर्तन brightfield इमेजिंग में अंडा रिलीज और गतिवान (चित्रा 4) में परिवर्तन सहित स्पष्ट व्यवहार के साथ संबद्ध किया जा सकता है ।

Quantitation एचएसएन Ca के2 + और गति की पुष्टि करता है कि कीड़े उनके गतिवान परिवर्तन के रूप में वे अंडे के लिए संक्रमण बिछाने व्यवहार । वहां कृमि गति में महत्वपूर्ण अंतर से पहले, के दौरान, और अंडे के बाद सक्रिय राज्य बिछाने (चित्रा 5) । यह इमेजिंग या ट्रैकिंग प्रणाली के लिए निहित शोर के कारण नहीं है । एक अंडा बिछाने घटना में zooming, हम GCaMP5 प्रतिदीप्ति (ΔF/एफ) में एक मजबूत परिवर्तन का पालन करने से पहले अंडा बिछाने घटना जबकि mCherry प्रतिदीप्ति अपेक्षाकृत अपरिवर्तित है (चित्रा 5बी) । GCaMP5 में मापा परिवर्तन: mCherry अनुपात (ΔR/स्पष्ट रूप से एक एचएसएन Ca2 + क्षणिक ~ 4 एस अंडा रिलीज से पहले (चित्रा 5बी) दिखाने के लिए । वल्वल मांसपेशी संकुचन के साथ संयोग, कीड़ा गतिवान की एक स्पष्ट धीमा होता है कि अंडा रिलीज के साथ समाप्त होता है । पिछले परिणामों से पता चला है कि कोलीनर्जिक कुलपति मोटर न्यूरॉन्स, जो HSNs द्वारा innervated हैं, मजबूत वल्वल मांसपेशी संकुचन के दौरान पीक गतिविधि दिखाने के लिए और अंडा रिलीज के दौरान 8,10,27. हम यह भी पता चला है कि कुलपति ंयूरॉंस के optogenetic सक्रियकरण गतिवान की एक तत्काल धीमा ड्राइव, सुझाव है कि कुलपति ंयूरॉंस वल्वल मांसपेशी संकुचन द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, जिससे अंडा रिलीज 27 की प्रतिक्रिया प्राप्त करने तक गतिवान धीमा .

इमेजिंग और ट्रैकिंग प्रणाली वर्णित अंडे की स्थानिक संगठन के दृश्य-व्यवहार बिछाने (चित्रा 5सी) की अनुमति देता है । पहले दिखाए गए के रूप में, कीड़े अभी सक्रिय राज्य३२से पहले आगे गतिवान के निरंतर रन दर्ज करें । कीड़े अपने समय के बहुमत के जीवाणुओं पर चारा आगर खंड के केंद्र में खर्च करते हैं । सक्रिय राज्य में प्रवेश करने से पहले, कीड़े भोजन है, जो निराला एचएसएन Ca2 + यात्रियों की उपस्थिति के साथ संयोग है से दूर ले जाएँ । एचएसएन गतिविधि तो फट फायरिंग में संक्रमण, कई बारीकी से अंतरिक्ष एचएसएन Ca2 + यात्रियों कि अंडा बिछाने की घटनाओं को बनाए रखने के साथ. कीड़े तो अक्सर चारों ओर बारी, आगे गतिवान फिर से शुरू, और OP50 बैक्टीरिया के पास अपने शुरू की स्थिति की ओर वापस रास्ते पर अंडे देना । हमें अनुमान है कि स्थानीय हे2 में परिवर्तन और/2 एकाग्रता को प्रभावित किया जा सकता है जहां कीड़े अंडे देना तय३३,३४

Figure 1
चित्र 1C. एलिगेंस अंडे के उच्च संकल्प इमेजिंग-सर्किट गतिविधि और व्यवहार बिछाने के लिए तकनीक बढ़ते । शीर्ष, ओर से अंतिम माउंट । नीचे, अंतिम माउंट के रूप में बड़े coverslip के नीचे के माध्यम से देखा । तीर OP50 बैक्टीरियल खाना, सी एलिगेंस कीड़े और अंडे, NGM आगर हिस्सा और बड़े 24 मिमी x ६० मिमी coverslip के बीच सैंडविच संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . Widefield ratiometric Ca2 + इमेजिंग और व्यवहार एक औंधा epifluorescence माइक्रोस्कोप पर रिकॉर्डिंग । () कीड़ा स्थिति और व्यवहार brightfield में एक 20x (०.८ ना) योजना के माध्यम से कब्जा कर लिया है-Apochromat उद्देश्य अवरक्त (750-790 एनएम) प्रकाश (बैंगनी तीर) NGM खंड के माध्यम से एक हैलोजन दीपक से उत्सर्जित का उपयोग । एक जॉयस्टिक और मोटर चालित स्टेज नियंत्रक रिकॉर्डिंग के दौरान देखने के क्षेत्र में कीड़ा बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है । स्टेज स्थिति (Δx, Δy) सीरियल पोर्ट द्वारा पीसी के लिए भेजा जाता है । GCaMP5 और mCherry प्रोटीन कीड़ा में व्यक्त ४७० एनएम (नीले तीर) और ५९० एनएम (पीले तीर) प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) का उपयोग कर उत्साहित हैं । उत्सर्जित GCaMP5 (हरे तीर) और mCherry (नारंगी तीर) अवरक्त प्रकाश के साथ प्रतिदीप्ति एक बहु बैंड dichroic मिरर के माध्यम से गुजरता है ( सामग्री की तालिकादेखें). एक 80/20 बीम-अलगानेवाला एक अवरक्त-संवेदनशील CMOS कैमरा (बैंगनी तीर) पर कब्जा करने के लिए एक 0.63 एक्स demagnifer के माध्यम से प्रकाश का 20% भेजता है । प्रकाश की शेष ८०% एक छवि अलगानेवाला है कि एक sCMOS कैमरे के अलग हिस्सों पर GCaMP5 और mCherry प्रतिदीप्ति अलग जबकि अवरक्त brightfield प्रकाश को हटाने के पक्ष के माध्यम से भेजा जाता है । दोनों कैमरों से डेटा USB3 केबल के माध्यम से एक पीसी के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं । प्रतिदीप्ति sCMOS कैमरा (ब्लू) से ट्रिगर बंदरगाहों एलईडी रोशनी प्रणाली, अवरक्त brightfield CMOS कैमरा, और डिजिटल अधिग्रहण डिवाइस (DAQ) के लिए + 5v TTL ट्रिगर भेजने के लिए उपयोग किया जाता है । (B) ट्रिगर 3 आउटपुट TTL संकेतों को डिजिटल pin #8 पर DAQ द्वारा पाया जाता है और PC को USB कनेक्शन के माध्यम से भेजा जाता है । इन डिजिटल आदानों एक बोनसाई सॉफ्टवेयर स्क्रिप्ट (xy-स्टेज-अंतिम) जो पढ़ता एक्स और वाई प्रत्येक GCaMP5/mCherry प्रतिदीप्ति/अवरक्त छवि पर कब्जा कर लिया के लिए मंच स्थिति से एक ' कहां xy धारावाहिक कमान ट्रिगर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : बोनसाई धारावाहिक मंच संचार स्क्रिप्ट XY-स्टेज-अंतिम का लेआउट । शीर्ष DigitalInput नोड (पिंक) TTL DAQ के पिन #8 में आने से चलाता है पढ़ता है । प्रत्येक सकारात्मक TTL वोल्टेज के लिए (हरा), DAQ एक टाइमस्टैंप बनाता है (नीला) और एक ' कहां XY? ' स्ट्रिंग (गुलाबी) धारावाहिक बंदरगाह (ग्रे) के माध्यम से मंच नियंत्रक के लिए लिखता है । SerialStringRead नोड (गुलाबी) X और Y मंच नियंत्रक से समंवय प्रतिक्रिया पढ़ता है । इस स्ट्रिंग तो माइक्रोन में बदल दिया और एक्स और वाई मंच निर्देशांक में अलग है. अंत में, इन चार धाराओं एक ज़िप नोड का उपयोग कर संयुक्त कर रहे है (नीला) और एक चार कॉलम. csv फ़ाइल लिखा है: TTL संकेतों की एक फ्रेम गिनती प्राप्त (रेंज नोड, गुलाबी), X और Y निर्देशांक, और क्रमिक timepoints के बीच अंतराल (सामांयतया ~ ५० ms जब 20 हर्ट्ज पर रिकॉर्डिंग). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : अंडा बिछाने के व्यवहार के दौरान एचएसएन प्रतिदीप्ति और पूरे पशु brightfield के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ । (-) HSNs में GCaMP5 और mCherry प्रतिदीप्ति के एक साथ ratiometric इमेजिंग बस अंडा रिलीज से पहले । एचएसएन presynaptic टर्मिनी ऐरोहेड के साथ संकेत कर रहे हैं । () GCaMP5 और mCherry प्रतिदीप्ति का विलय । (D) तीव्रता संग्राहक GCaMP5: mCherry अनुपात; एक उच्च अनुपात (लाल) presynaptic टर्मिनस पर उच्च intracellular Ca2 + इंगित करता है । () पूरे कीड़ा की Brightfield इमेज सिर्फ अंडे के बाद रखी गई है । ऐरोहेड योनी के पूर्वकाल और पीछे आधा से संकेत मिलता है जो अंडे रखी हैं । सभी छवियों के लिए स्केल बार है ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : एचएसएन Ca की रिकॉर्डिंग2 + और अंडा बिछाने व्यवहार के दौरान गतिवान गति । () GCaMP5 के निशान: intracellular Ca के जवाब में mCherry अनुपात परिवर्तन2 + यात्रियों (ΔR/आर; लाल) तात्कालिक कीड़ा गति (µm/ अंडा बिछाने की घटनाओं ऐरोहेड द्वारा संकेत दिया जाता है । (B) एचएसएन GCaMP5 प्रतिदीप्ति (हरा; ΔF/f), mCherry प्रतिदीप्ति (लाल; ΔF/f), GCaMP5: mCherry प्रतिदीप्ति अनुपात (black; ΔR/R), और वर्म गति (नीला) अंडा रिलीज़ के क्षण के आस-पास । () पूरे 10-ंयूनतम रिकॉर्डिंग के दौरान अंडा-बिछाने और गतिवान व्यवहार के स्थानिक संगठन । वर्म ट्रैक XY चरण जानकारी जो mCherry प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग से प्राप्त एचएसएन की केन्द्रक स्थिति में जोड़ा गया था से प्राप्त किया गया था । एचएसएन यात्रियों (लाल हलकों), अंडा बिछाने घटनाओं (काले ऐरोहेड) के समय, और रिकॉर्डिंग के शुरू और अंत (हरे और नीले हीरे) संकेत कर रहे हैं । स्केल बार 1 मिमी है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

Transgenes:

क्योंकि mCherry अभिव्यक्ति codon अनुकूलन और intron प्रविष्टि के माध्यम से सुधार किया गया है (और सबसे उपलब्ध GCaMP पत्रकारों को नहीं है), सुई ~ 4x GCaMP5-व्यक्त प्लाज्मिड की मात्रा मजबूत Ca के दौरान GCaMP5 प्रतिदीप्ति के तुलनीय स्तर सुनिश्चित करने के लिए 2 + यात्रियों । lin-15 (n765ts) उत्परिवर्तन के बचाव अंडे बिछाने और अंय व्यवहार३५पर ंयूनतम प्रभाव के साथ ट्रांसजेनिक पशुओं के सतही वसूली के लिए अनुमति देता है । Transgenes विभिंन जानवरों के बीच समान अभिव्यक्ति और इमेजिंग शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए एकीकृत किया जाना चाहिए25। एंटीबायोटिक प्रतिरोध सहित चयन मार्करों३६,३७ और तापमान के बचाव के प्रति संवेदनशील घातक३८ भी काम करना चाहिए, लेकिन, क्योंकि गैर ट्रांसजेनिक पशु मर चुके हैं, transgene एकीकरण की पुष्टि और homozygosity मार्क्स की तुलना में अधिक कठिन है जो25दिखाई देने वाले phenotype को प्रस्तुत करते हैं । ऐसे rol-6 (डीएम)के रूप में सामांय गतिवान और कमी स्वास्थ्य, बाधित प्रमुख मार्करों,३९से बचा जाना चाहिए । लाइट-1 उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में इमेजिंग इमेजिंग23,४०,४१के दौरान नीली बत्ती एस्केप प्रतिक्रियाओं को कम करने के लिए आवश्यक है । gur के अतिरिक्त उत्परिवर्तन -3, जो लाइट-1के समानांतर में कार्य करता है, आगे अवशिष्ट व्यवहार और शारीरिक नीले प्रकाश४२की वजह से परिवर्तन को कम कर सकते हैं । सुविधा, gur-3, लाइट-1, और लिन-15 सभी गुणसूत्र एक्स के ठीक आधे पर स्थित हैं, जो सीए2 + इमेजिंग और optogenetic प्रयोगों के लिए नए उपभेदों के निर्माण को सरल बनाना चाहिए ।

जोखिम बार कम कर रहे हैं और छवियों 20 हर्ट्ज, GCaMP5 और mCherry संकेतों उज्ज्वल होना चाहिए पर एकत्र कर रहे हैं क्योंकि. शोर Ca2 + रिकॉर्डिंग के लिए सबसे अधिक संभावना स्पष्टीकरण कमज़ोर रिपोर्टर व्यंजक के कारण मंद प्रतिदीप्ति है । प्रवर्तकों को भी इस क्षेत्र के लिए यथोचित विशिष्ट होना चाहिए । क्योंकि एचएसएन कोशिका शरीर और वल्वल मांसपेशियों पर synapses शरीर के केंद्र में हैं, सिर और पूंछ में एनएलपी-3 प्रमोटर से अतिरिक्त अभिव्यक्ति आम तौर पर देखने के क्षेत्र के बाहर है और में अतिरिक्त फिल्टर का उपयोग कर बाहर रखा जा सकता है Ratiometric Quantitation लागेको हो । यह सुनिश्चित करने के लिए कि intracellular Ca2 +में वास्तविक परिवर्तनों से GCaMP5 प्रतिदीप्ति परिणाम में देखा गया परिवर्तन, नियंत्रण transgenes GFP के बजाय GCaMP5 व्यक्त करने के लिए स्वतंत्र रूप से तैयार और26विश्लेषण किया जाना चाहिए । नए ca2 + विभिंन ca2 + संवेदनशीलता, कैनेटीक्स, और रंग के साथ रिपोर्टर इमेजिंग उपकरण उपलब्ध की पसंद का विस्तार किया है, लेकिन प्रत्येक नए रिपोर्टर ca2 +-असंवेदनशील फ्लोरोसेंट संस्करण का उपयोग कर मांय किया जाना चाहिए14 ,16.

मीडिया:

इमेजिंग के लिए NGM प्लेटें उच्च गुणवत्ता वाले आगार के साथ तैयार की जानी चाहिए । कम गुणवत्ता वाले आगार पूरी तरह से autoclaving पर भंग नहीं होगा, छोड़ने छोटे कण कि इमेजिंग के दौरान प्रकाश तितर बितर, और बढ़ती पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति । आणविक जीवविज्ञान ग्रेड agarose बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन जोड़ा मात्रा समकक्ष प्लेट दृढ़ता बनाए रखने के लिए कम किया जाना चाहिए ।

अंय बढ़ते तरीकों से तुलना:

अंडे में छवि गतिविधि के लिए पिछले दृष्टिकोण बिछाने व्यवहार सर्किट एक agarose पैड को गोंद के साथ मैटीरियल कीड़े का इस्तेमाल किया है । इन शर्तों के तहत, सर्किट गतिविधि और अंडा बिछाने व्यवहार संस्कृति मीडिया में कमी के बिना इष्ट नहीं है osmolarity8,10,४४,४५। हाल ही में सबूत पता चलता है कि कई कीड़ा व्यवहार गतिवान राज्य द्वारा संग्राहक रहे हैं, सेल गतिविधि के संबंध के बारे में सवाल उठाने मैटीरियल जानवरों में देखा है कि स्वतंत्र रूप से व्यवहार पशुओं में देखी । हमने हाल ही में दिखाया है कि अंडा बिछाने सर्किट गतिविधि अप्रत्याशित रूप से गतिवान26,27के साथ चरणबद्ध है । इसी प्रकार, compartmentalized Ca2 + में संकेतन रिया ंयूरॉन४६चारा के दौरान संवेदी ंयूरॉंस और सिर मोटर ंयूरॉंस से गतिविधि को एकीकृत । शौच व्यवहार भी गतिवान में एक सटीक और टकसाली परिवर्तन के साथ है कि जानवरों अपशिष्ट४७निष्कासित करने से पहले अपने चारा स्थल से दूर स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है । साथ में, इन परिणामों का सुझाव है कि मैटीरियल जानवरों से सर्किट गतिविधि की संक्षिप्त रिकॉर्डिंग स्वतंत्र रूप से व्यवहार जानवरों में प्राप्त उन लोगों से मौलिक रूप से अलग हो सकता है ।

एक coverslip के नीचे सीधे होने के बावजूद, कीड़ा व्यवहार है कि मानक NGM प्लेटों पर देखा जैसा दिखता है । रखी अंडे हैच पर जाना होगा, और जमा भोजन की छोटी राशि L1 लार्वा वयस्कों में विकसित करने के लिए अनुमति देता है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । बड़े आगर हिस्सा आकार उचित गैस विनिमय के लिए अनुमति देता है और निर्जलीकरण का विरोध करता है, हालांकि बहुत अधिक भोजन पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति वृद्धि होगी । हालांकि इस विधि वयस्कों के लिए सबसे अच्छा काम करता है, तकनीक भी L4 जानवरों छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, खंड और coverslip के बीच जलीय परत की मोटाई ऐसी है कि छोटे लार्वा कठिनाई रेंगने है, और अक्सर एक चलती वयस्क के जाग में फंस सकता है ।

इस बढ़ते तकनीक की एक सीमा है कि प्रत्यक्ष यांत्रिक या रासायनिक उत्तेजना शरीर के सटीक क्षेत्रों के लिए मुश्किल है । नमूनों में हाल की घटनाओं प्रदीप्ति तकनीक सिर या पूंछ के अलग उत्तेजना के लिए अनुमति-अलग रोशनी और GCaMP का पता लगाने के साथ माइक्रोबियल opsins व्यक्त की प्रतिदीप्ति४८में mCherry midbody,४९। परिणामस्वरूप, यह optogenetic दृष्टिकोण का उपयोग कर इस समस्या को दूर करने के लिए संभव हो सकता है ।

अंय Ca से तुलना 2 + इमेजिंग दृष्टिकोण:

यह विधि एकल, हल किए गए कक्षों और उनके synaptic क्षेत्रों से cytoplasmic Ca2 + में परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए बहुत अच्छी तरह से कार्य करती है । वास्तविक समय, सिर में न्यूरॉन्स की volumetric इमेजिंग हाल ही में सेल पहचान के लिए सेल नाभिक की स्थिति का उपयोग कर प्राप्त किया गया है और nucleoplasmic कैल्शियम में परिवर्तन quantitate करने के लिए५०,५१,५२. परमाणु और synaptic Ca2 + के बीच संबंध अस्पष्ट बनी हुई है । हमारे डेटा एचएसएन intracellular Ca में सबसे विशिष्ट परिवर्तन का सुझाव2 + सेल सोमा से दूर presynaptic टर्मिनी पर हो (चित्रा 4d) । एचएसएन और कुलपति न्यूरॉन्स के presynaptic टर्मिनी postsynaptic वल्वल मांसपेशियों में एम्बेडेड हैं26. यह स्पष्ट नहीं है कि क्या वहां जेड आयाम में भी कताई डिस्क या प्रकाश शीट तकनीक के साथ परमशॆवर presynaptic Ca के लिए पर्याप्त संकल्प होगा2 + कोशिका पहचान के लिए दैहिक कैल्शियम पर किसी तरह से निर्भर बिना विशिष्ट कोशिकाओं को संकेत . यहां वर्णित तकनीकों का उपयोग करना, प्रत्येक 10 मिनट, दो चैनल रिकॉर्डिंग के साथ १२,००१ २५६ x २५६ १६-bit पिक्सेल TIFF छवियां ~ 4 GB है । अनुपात और तीव्रता संग्राहक अनुपात चैनल के लिए फ़ाइल का आकार डबल ~ 8 GB । एक ठेठ प्रयोग दो पादी के प्रत्येक से 10 जानवरों की रिकॉर्डिंग (जंगली-प्रकार और प्रयोगात्मक) लगभग १५० GB प्राथमिक डेटा जनरेट करता है और 20 के लिए इकट्ठा और विश्लेषण एच की आवश्यकता है । Volumetric विश्लेषण के साथ 10 timepoint प्रति Z स्लाइस परिमाण का एक आदेश अधिक डेटा और विश्लेषणात्मक समय की आवश्यकता होगी, समझा क्यों इतना कुछ ऐसे अध्ययन पूरा कर लिया गया है ।

हार्डवेयर:

हम रिकॉर्ड और उच्च प्रदर्शन (जैसे, गेमिंग) ग्राफिक्स कार्ड, ६४ जीबी रैम, और उच्च प्रदर्शन ठोस राज्य ड्राइव के साथ दोहरे प्रोसेसर कार्यस्थानों पर छवि दृश्यों का विश्लेषण ( सामग्री की तालिकादेखें) । डेटा स्वतंत्र डिस्क (RAID) के नेटवर्क अनावश्यक सरणी पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और एक ऑफ-साइट डेटा केंद्र पर बादल को बैकअप लिया ।

हम धातु halide या बुध आधारित प्रकाश स्रोतों पर स्पंदित प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए उच्च शक्ति collimated एल ई डी का उपयोग करने की सलाह देते हैं । कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बहु रंग एलईडी सिस्टम उपलब्ध हैं । हालांकि इन एलईडी प्रणालियों के कुछ एक उच्च अग्रिम लागत है, वे एक लंबे जीवन है (> २०,००० ज), एक साथ चार या अधिक अलग fluorophores उत्तेजित कर सकते हैं, और सटीक अस्थाई नियंत्रण की पेशकश एक धारावाहिक का उपयोग कर या कम विलंबता के साथ/ समय) । ट्रिगर सुनिश्चित करता है कि नमूना ही प्रबुद्ध जब डेटा वास्तव में एकत्र किया जा रहा है । हम आम तौर पर एक 10 एमएस जोखिम हर ५० एमएस (20% शुल्क दर) का उपयोग करें । यह छवि कैद के दौरान phototoxicity और गति कलंक कम कर देता है, के रूप में पहले की रिपोर्ट४३

हम उनकी गति और छोटे, संवेदनशील पिक्सल के बड़े सरणी के लिए sCMOS कैमरों का उपयोग करें । एक EM-सीसीडी कैमरा एक अधिक महंगी विकल्प है, लेकिन ' ब्लूम ' प्रभाव आसंन पिक्सल में फैल photoelectrons पर कब्जा कर लिया में परिणाम कर सकते हैं । नई वापस प्रबुद्ध sCMOS कैमरों के समान संश्लेषण है EM-CCDs में काफी कम कीमत पर । चाहे जो सेंसर उपयोग किया जाता है, GCaMP5 और mCherry चैनल एक साथ प्राप्त किया जाना चाहिए. चलती कीड़े में अनुक्रमिक कब्जा खराब पंजीकृत छवियों ratiometric quantitation के लिए अनुपयुक्त के लिए नेतृत्व करेंगे । दोहरी चैनल इमेजिंग एक छवि अलगानेवाला का उपयोग कर चैनलों के बंटवारे के बाद एक एकल कैमरे पर पूरा किया जा सकता है (चित्रा 2) या दो समान कैमरों का उपयोग कर । 16 बिट छवियों की गतिशील रेंज सटीक ratiometric quantitation के लिए 8 बिट छवियों पर सिफारिश की है. कीड़ा व्यवहार के brightfield छवियों के लिए, हम एक 1 में ४.१ सांसद के पास-अवरक्त USB3 कैमरे के उपयोग पर कब्जा करने के लिए बड़े 2 एक्स 2 बिन्नी १,०२४ x १,०२४ ८-bit JPEG संपीड़न के बाद छवि दृश्यों पर कब्जा । बड़े FOV नए माइक्रोस्कोप मॉडल पर उपलब्ध एक वयस्क कीड़ा केवल मामूली विगनेटिंग (चित्रा 4E) के साथ 0.63 एक्स आवर्धन के बाद 20x पर visualized किया जा करने के लिए अनुमति देता है ।

हम मानक TTL वोल्टेज संकेतों का उपयोग करने के लिए रोशनी और फ्रेम पर कब्जा सिंक्रनाइज़ की सलाह देते हैं । क्योंकि विभिन्न सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में संभावित विलंब के, हम उपयोगकर्ताओं को कॉन्फ़िगर करें प्रतिदीप्ति कैमरा के साथ मास्टर के रूप में ट्रिगर outputs के साथ TTL अन्य सभी उपकरणों ड्राइविंग outputs. इस तरह, brightfield और स्टेज स्थिति की जानकारी प्रत्येक Ca के लिए एकत्र किया जाएगा2 + माप ।

भट्ठा-या गुंजयमान बिंदु-स्कैनिंग फोकल सूक्ष्मदर्शी आम तौर पर साझा फोकल सुविधाओं में पाया भी ratiometric Ca के दौरान उत्कृष्ट प्रदर्शन दे2 + इमेजिंग । इस तरह के उपकरणों brightfield24के साथ साथ दो या अधिक प्रतिदीप्ति चैनलों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस मामले में, फोकल pinhole अपनी अधिकतम व्यास के लिए खोला जाना चाहिए, और एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर अलग GCaMP5, mCherry, और अवरक्त brightfield संकेतों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यह एक मोटी (~ 20 µm) टुकड़ा से प्रकाश संग्रह अधिकतम है, जबकि अभी भी बाहर की अस्वीकृति-फोकस प्रतिदीप्ति की अनुमति । एक नकारात्मक पक्ष छोटे FOV और हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर अनुकूलन के लिए और अधिक प्रतिबंध है ।

सॉफ्टवेयर:

अधिकांश निर्माताओं जहाज और स्वामित्व सॉफ्टवेयर के साथ अपने कैमरे और सूक्ष्मदर्शी स्थापित आदानों और outputs ट्रिगर के विंयास सहित, । रिकॉर्डिंग के दौरान इस सॉफ़्टवेयर की सुविधाएं और प्रदर्शन भिंन हो सकते हैं । क्योंकि तेजी से चल कीड़े ट्रैक करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, रिकॉर्डिंग के दौरान छवि प्रदर्शन चिकनी और 20 हर्ट्ज पर स्थिर होने की जरूरत है । प्रदर्शन में सुधार करने के लिए, छवि दृश्यों को अस्थायी रूप से प्रयोग के अंत में सहेजे गए व्यवहार संगत उपसेट्स के साथ RAM में सहेजा जा सकता है. इन दो-चैनल छवि अनुक्रम फ़ाइलें Ratiometric Quantitation सॉफ़्टवेयर में आयात करने के लिए खोलें छवि Cytometry मानक स्वरूप (. ics) में कनवर्ट किया जा सकता है । OME-tiff एक नवीनतम खुला-स्रोत छवि स्वरूप है, यद्यपि अलग स्थापना tiff छवि अनुक्रम 4 GB से अधिक सहेजने में असमर्थ हो सकता है ।

quantitation पाइपलाइन की एक प्रमुख विशेषता अनुपात चैनल की पीढ़ी है और फिर एक निष्पक्ष छवि विभाजन प्रक्रिया mCherry प्रतिदीप्ति का उपयोग करने के लिए ब्याज की कोशिकाओं को खोजने के लिए । प्रत्येक मिले ऑब्जेक्ट से, ऑब्जेक्ट आकार, XY केन्द्रक स्थिति, और ंयूनतम, माध्य, और प्रत्येक चैनल (अनुपात चैनल सहित) के लिए अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता मान परिकलित किए जाते हैं । साथ में, इन मानों को intracellular Ca2 + में प्रत्येक timepoint रिकॉर्डिंग में परिवर्तन quantitate करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रत्येक timepoint के लिए ऑब्जेक्ट माप बाद में विश्लेषण के लिए एक. csv फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जाता है ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल की एक प्रमुख सीमा सॉफ्टवेयर उत्पादों के चिथड़े के माध्यम से विभिन्न रूपों में डेटा ले जाने पर निर्भरता है । एक अतिरिक्त जलन यह है कि सॉफ्टवेयर के कुछ खुले स्रोत और मुक्त है, जबकि दूसरों को बंद कर रहे हैं, महंगा है, और असमान अद्यतन । एक प्रमुख सुधार का उपयोग करें या सॉफ्टवेयर का एक टुकड़ा (आदर्श खुला स्रोत) है कि प्रदर्शन और आसानी से अधिग्रहण से विश्लेषण के लिए उपयोग के समान स्तर प्रदान करता है विकसित होगा । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, ratiometric विश्लेषण दोनों फ़ाइल आकार और एक प्रयोग पूरा करने के लिए आवश्यक समय डबल्स । कैमरा ड्राइवरों की पीढ़ी है कि बोनसाई की तरह उपयोगकर्ता अनुकूलन चौखटे में एकीकृत किया जा सकता है छवियों और अंय डेटा धाराओं को एकत्र करने की अनुमति होगी और वास्तविक समय में विश्लेषण, काफी प्रवाह में सुधार होगा ।

भविष्य की संभावनाएं:

हम आम तौर पर कीड़ा आंदोलनों को मैन्युअल रूप से ट्रैक करते हैं, अवरक्त उज्ज्वल में पाया कीड़ा केन्द्रक की ट्रैकिंग-या डार्क-फ़ील्ड रिकॉर्डिंग स्टेज स्थिति और स्वचालित के बंद लूप समायोजन प्रदान कि अतिरिक्त छवि प्रसंस्करण नोड्स के लिए अनुमति चाहिए ट्रैकिंग (चित्र 3 और डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस विधि के साथ प्राप्त प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग के बहुमत अंधेरे और जैविक रूप से दिलचस्प डेटा से रहित है । पर सेंसर या वास्तविक समय के बाद अधिग्रहण छवि प्रसंस्करण तकनीक है कि फसल छवि अनुक्रम प्रासंगिक वस्तुओं के लिए वृद्धि हुई स्थानिक संकल्प के लिए अनुमति देते हैं और डेटा विश्लेषण पाइपलाइन में तेजी लाने, विशेष रूप से यदि प्रत्येक के लिए अतिरिक्त Z-स्लाइस एकत्र कर रहे हैं timepoint सर्किट में सभी पूर्व और postsynaptic कोशिकाओं के भीतर गतिविधि कल्पना करने के लिए ।

Disclosures

लेखक घोषणा करते है कि कोई प्रतिस्पर्धी हित मौजूद नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम NINDS से केएमसी (R01 NS086932) के लिए अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया । LMN को NIGMS IMSD प्रोग्राम (R25 GM076419) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । इस अध्ययन में प्रयुक्त उपभेदों C. एलिगेंस जेनेटिक्स केंद्र, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है. हम उपयोगी चर्चा के लिए जेंस बेकर और मेसन क्लेन धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans growth, cultivation, and mounting
Escherichia coli bacterial strain, OP50 Caenorhabditis Genetic Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1
HSN GCaMP5+mCherry worm strain Caenorhabditis Genetic Center LX2004 Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN.  Full genotype:  vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation author LX1832 Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid author pL15EK Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request
pKMC299 plasmid author pKMC299 Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
pKMC300 plasmid author pKMC300 Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
Potassium Phosphate Monobasic Sigma P8281 For preparation of NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Sigma P5655 For preparation of NGM plates
Magnesium Sulfate Heptahydrate Amresco 0662 For preparation of NGM plates
Calcium Chloride Dihydrate Alfa Aesar 12312 For preparation of NGM plates
Peptone Becton Dickinson 211820 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Amresco 0241 For preparation of NGM plates
Cholesterol Alfa Aesar A11470 For preparation of NGM plates
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure Affymetrix 10906 For preparation of NGM plates
60 mm Petri dishes VWR 25384-164  For preparation of NGM plates
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 VWR 48393-251 Cover glass through which worms are imaged
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 VWR 48366-067 Cover glass that covers the top of the agar chunk
Stereomicroscope with transmitted light base Leica M50 Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm ALFA AESAR AA39526-BW For worm transfer
Calcium imaging microscope
Anti-vibration air table TMC 63-544 Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top
Inverted compound microscope Zeiss 431007-9902-000 Axio Observer.Z1 inverted microscope
Sideport L80/R100 (3 position) Zeiss 425165-0000-000 To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera
Tilt Back Illumination Carrier Zeiss 423920-0000-000 For infrared/behavior imaging
Lamphousing 12V/100W w/ Collector Zeiss 423000-9901-000 For infrared/behavior imaging
Halogen lamp 12V/100W Zeiss 380059-1660-000 For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp Zeiss 447958-9000-000 BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized Zeiss 424244-0000-000 For infrared/behavior imaging
Condenser & Shutter Zeiss 423921-0000-000 For infrared/behavior imaging
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera Zeiss 425536-0000-000 For infrared/behavior imaging
Eyepiece 10x, 23mm Zeiss 444036-9000-000 For worm localization on the agar chunk
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier Zeiss 426113-0000-000 Mount for infrared CMOS camera
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) FLIR (formerly Point Grey Research) GS3-U3-41C6NIR-C Camera for brightfield imaging
USB 3.0 Host Controller Card FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-1202 Fresco FL1100, 4 Ports
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector  FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-3000 Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 Zeiss 420650-9901-000 Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance
6-cube Reflector Turret, Motorized Zeiss 424947-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Light Train, Motorized Zeiss 423607-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Shutter Zeiss 423625-0000-000 For fluorescence imaging
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) Zeiss 489062-9901-000 FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging
LED illumination system Zeiss 423052-9501-000 Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination
GFP LED module (470 nm) Zeiss 423052-9052-000 Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation
mCherry LED module (590 nm) Zeiss 423052-9082-000 Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation
Iris stop slider for incident-light equipment Zeiss 000000-1062-360 Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view
C-Mount Adapter 1" 1.0x Zeiss 426114-0000-000 Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera
Image splitter Hamamatsu A12801-01 Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) Semrock Di02-R594-25x36 Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals
GFP emission filter (image splitter) Semrock FF01-525/30-25 Capturing GCaMP5 fluorescence
mCherry/ emission filter (image splitter) Semrock FF01-647/57-25 This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) Hamamatsu A12802-01 / C11440-22CU Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter
Motorized XY Stage Märzhäuser SCAN IM 130 x 100 Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step 
XY Stage controller with joystick LUDL MAC6000, XY joystick Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud
Digital Acquisition board (DAQ) Arduino Uno Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud
BNC Male to BNC Male Cable - 6 ft Hosa Technology HOBB6 BNC connectors for TTL triggering
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") uxcell 608641773651 To connect the fluorescence camera trigger outputs
BNC turn head adapter Hantek RRBNCTH21 BNC to Banana Plug Adapter (4mm)
BNC female to female connector Diageng 20130530009 Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug
Solderless flexible breadboard jumper wires Z&T GK1212827 To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ.  Male to male.
High performace workstation HP Z820 Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives
M.2 Solid state drive Samsung MZ-V5P512BW High-speed streaming and analysis of image data
M.2 Solid state drive adapter for workstations Lycom DT-120 M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter
Network attached storage Synology DS-2415+ Imaging data storage and analysis
Hard disk drives Western Digital WD80EFZX RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy)
Software
Fluorescence Acquisition Hamamatsu HCImage DIA Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps
Brightfield Acquisition FLIR (formerly Point Grey Research) Flycapture Recording of brightfield JPEG image sequences
Stage Serial Port Reader Bonsai https://bitbucket.org/horizongir/bonsai Facilitates tracking of worms during behavior
LED controller software Zeiss Micro Toolbox Test 2011 To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit
ImageJ  NIH https://imagej.net/Fiji/Downloads Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software
Excel Microsoft  2002984-001-000001 For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis
Peak Finding MATLAB R2017a Script used for Ratio peak feature calculations
Ratiometric Quantitation Perkin Elmer Volocity 6.3 Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects
Scripts
XY-stage-final.bonsai Bonsai TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps).  X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. 

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References

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Ratiometric व्यवहार में व्यक्तिगत ंयूरॉंस की कैल्शियम इमेजिंग <em>Caenorhabditis एलिगेंस</em>
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Cite this Article

Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).More

Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).

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