Det här protokollet beskriver användningen av genetiskt kodade Ca2 + reportrar att registrera ändringar i neural aktivitet i beter sig Caenorhabditis elegans maskar.
Det har blivit allt tydligare att neural krets aktivitet i beter sig djur skiljer sig väsentligen från som hos sövda eller immobiliserade djur. Mycket känsliga, genetiskt kodade fluorescerande reportrar av Ca2 + har revolutionerat inspelning av cellen och synaptisk aktivitet med hjälp av icke-invasiva optiska metoder i beter sig djur. När de kombineras med genetiska och optogenetic tekniker, de molekylära mekanismerna som modulerar cell och krets verksamhet under olika beteende som staterna kan identifieras.
Här beskriver vi metoder för proportionerlig Ca2 + avbildning av enstaka nervceller i fritt bete Caenorhabditis elegans maskar. Vi visar en enkel montering teknik som försiktigt överlägg maskar som växer på en standard Nematoden Growth Media (NGM) agar blockera med ett täckglas, tillåter djur registreras på högupplösta under obegränsad rörlighet och beteende. Med denna teknik använder vi känslig Ca2 + reportern GCaMP5 för att registrera förändringar i intracellulära Ca2 + i serotonerga hermafrodit specifika nervceller (HSNs) som de kör äggläggningen beteende. Genom att samtidigt uttrycka mCherry, en Ca2 +-okänsliga fluorescerande protein, kan vi spåra positionen för HSN inom ~ 1 µm och rätt för fluktuationer i fluorescens orsakad av förändringar i fokus eller rörelse. Samtidig, IR brightfield imaging tillåter beteende inspelning och djur spårning med hjälp av en motoriserad scenen. Genom att integrera dessa mikroskopiska tekniker och dataströmmar, kan vi spela in Ca2 + aktivitet i C. elegans äggläggningen kretsen eftersom det fortskrider mellan inaktiva och aktiva beteende stater över tiotals minuter.
Ett centralt mål för neurovetenskap är att förstå hur nervceller kommunicerar i kretsar för att driva djurs beteende. Neurala kretsar integrera en rad olika sensoriska signaler för att ändra krets verksamhet, därmed körning beteendemässiga förändringar nödvändiga för djur att bemöta sina miljöer. Nematoden, C. elegans, har en enkel nervsystemet med 302 nervceller vars synapsförbindelser har varit helt mappade1. Gener som kodar för proteiner som är involverade i neurotransmission bevaras dessutom mycket mellan C. elegans och däggdjur2. Trots dess nervsystemet anatomiska enkelhet visar det en komplex repertoar av bevarade beteenden ger en bördig plattform för att förstå hur nervceller reglerar beteende3.
C. elegans är mottagliga för tillämpningen av ett brett utbud av metoder såsom genmanipulation, laser cell ablation, elektrofysiologiska tekniker, samt i vivo optisk imaging4,5. Nyligen genomförda studier har producerat detaljerade kartor över den viktiga signalsubstansen signalering system i C. elegans inklusive de kolinerga och GABAergic neuronala nätverk. Dessa studier, tillsammans med pågående studier för att kartlägga uttryck för alla neuronala G-protein kopplade receptorer placera denna modell i en unik position att utnyttja mycket detaljerade strukturella och funktionella neuronala connectivity kartor för att fullt förstå hur dessa olika signalsubstanser signalen via olika receptorer och tidsskalor att driva olika aspekter av djurs beteende.
För att studera dynamiska neuronal aktivitetsmönster i alla system, är en nödvändig förutsättning att utveckla robusta metoder för att registrera aktivitet i enskilda nervceller eller hela kretsar under beteenden. Särskilt viktigt är föredragandens sådana optiska metoder för att visualisera presynaptiska aktivitet som driver synaptiskt vesikelprotein fusion. Snabb och mycket känsliga fluorescerande reportrar av intracellulära Ca2 +, tillsammans med den ökande tillgången till känsliga fotodetektorer, har revolutionerat inspelningen av cellen och synaptisk aktivitet i vaken, levande djur under beteende. Eftersom ett större resultat av synaptisk elektriska aktivitet är att reglera Ca2 + kanaler, är ändringar i intracellulära Ca2 + tänkt att troget rapport behaviorally relevanta förändringar i cellernas aktivitet.
I denna studie presenterar vi ett tillvägagångssätt för att utföra proportionerlig Ca2 + imaging i de serotonerga HSN motoriska nervceller som främjar äggläggningen beteende i C. elegans6,7. Denna strategi bygger på tidigare ansträngningar att visualisera Ca2 + aktivitet i C. elegans och äggläggningen krets under beteende5,8,9,10,11 . Metoden tillåter samtidigt korrelera de observerade förändringarna i cell/krets verksamhet med äggläggningen händelser, samt ändringar i djurens rörelseapparaten tillstånd. Även om vi använder denna metod för att studera aktivitet i vuxna maskar, visar opublicerade verk från vårt laboratorium detta tillvägagångssätt kan förlängas till unga djur på den fjärde (L4) larvstadium samt. Det är troligt att aktiviteten av andra C. elegans nervceller som fungera i olika kretsar och beteenden bör finnas på samma sätt med denna teknik. Andra nyligen utvecklat snabb Ca2 + indikatorer med icke-överlappande utsläpp spectra12,13,14,15,16, optogenetic verktyg17 , och genetiskt kodade optiska indikatorer membran spänning18, bör göra det möjligt för oss att utföra genomträngande ‘all-optiska’ utredningar om hur förändringar i neural krets aktivitet kör distinkta beteende stater.
Transgener:
Eftersom mCherry uttryck har förbättrats genom kodon-optimering och intron insättning (och mest tillgängliga GCaMP reportrar har inte), injicera ~ 4 x mängden GCaMP5-uttryckande plasmiden att säkerställa jämförbara nivåer av GCaMP5 fluorescens under stark Ca 2 + transienter. Räddning av lin-15(n765ts) mutation tillåter för facile återvinning av transgena djur med minimala effekter på äggläggning och andra beteenden35. Transgener bör integreras för att säkerställa enhetliga uttryck och imaging villkor mellan olika djur25. Valbar markörer inklusive antibiotikaresistens36,37 och räddning av temperaturkänsliga lethals38 borde också fungera, men eftersom icke-transgena djur är döda, bekräftelse av transgenens integration och homozygosity är svårare jämfört med markörer som presenterar en synlig fenotyp25. Dominerande markörer som störa normal förflyttning och minska fitness, såsom rol-6(dm), bör undvikas39. Imaging i lite-1 är mutant bakgrunden viktigt att minska blå ljus escape Svaren under imaging23,40,41. Ytterligare mutation av gur-3, som agerar parallellt med lite-1, kan ytterligare minimera kvarvarande beteende och fysiologiska förändringar orsakade av blå ljus42. Bekvämt, gur-3, lite-1och lin-15 ligger alla på den högra halvan av kromosom X, vilket bör förenkla byggandet av nya stammar för Ca2 + imaging och optogenetic experiment.
Eftersom exponeringstider är kort och bilder samlas in vid 20 Hz, måste GCaMP5 och mCherry signaler vara ljusa. Den mest sannolika förklaringen för bullriga Ca2 + inspelningar är dim fluorescens orsakad av svag reporter uttryck. Projektansvariga bör rimligen specifika för regionen som avbildas. Eftersom HSN cellkroppen och synapser på vulval musklerna är i mitten av kroppen, ytterligare uttryck från nlp-3 arrangören i huvud och svans är oftast utanför synfältet och kan uteslutas med hjälp av ytterligare filter i den Proportionerlig kvantitering programvara. För att säkerställa att observerade förändringar i GCaMP5 fluorescens resultatet från faktiska förändringar i intracellulära Ca2 +, kontroll transgener uttrycker GFP istället för GCaMP5 bör förberedas självständigt och analyserat26. Nyare Ca2 + reportrar med olika Ca2 + känslighet, kinetik och färger har utökat valet av imaging verktyg tillgängliga, men varje ny reporter ska valideras med hjälp av Ca2 +-okänsliga fluorescerande variant14 ,16.
Media:
NGM plattor för imaging bör förberedas med hög kvalitet-agar. Lägre kvalitet agar kommer inte helt lös vid autoklavering, lämnar små partiklar som scatter ljus under imaging och öka bakgrunden fluorescens. Molekylär biologi grade agar kan användas i stället, men tillsatta mängden bör minskas för att upprätthålla likvärdig plattan fasthet.
Jämförelser med andra metoder för montering:
Tidigare metoder för bilden aktivitet i äggläggningen beteende kretsen har använt maskar orörlig med lim till en agaros pad. Under dessa förhållanden, krets aktivitet och äggläggningen beteende är inte gynnade utan en minskning av kultur media osmolaritet8,10,44,45. Nyligen tyder på att flera mask beteenden moduleras av locomotion staten, ifrågasätter om förhållandet av cellernas aktivitet observerats hos immobiliserade djur som hos fritt beter djur. Vi har nyligen visat att äggläggningen krets aktivitet oväntat fasas med locomotion26,27. Likaså integrerar konkurrensbetingat Ca2 + signalering i den RIA interneuron aktivitet från sensoriska nervceller och huvudet motoriska nervceller under födosök rörelser46. Defekation beteende åtföljs av en exakt och stereotypa rörelsemönster som gör att djuren att flytta bort från deras födosök plats innan utvisa avfall47. Sammantaget tyder dessa resultat på att korta inspelningar av krets aktivitet från immobiliserade djur kan vara fundamentalt annorlunda från dem som erhålls i fritt beter djur.
Trots att direkt under ett täckglas, liknar maskens beteende det sett på standard NGM tallrikar. Lagda ägg kommer för att kläckas, och den lilla mängden mat deponeras tillåter L1 larver att växa till vuxna (inga data anges). Den stora agar bit storleken möjliggör rimliga gasutbyte och motstår uttorkning, även om för mycket mat kommer att öka bakgrunden fluorescens. Denna metod fungerar bäst för vuxna, kan tekniken också användas till bild L4 djur. Tjockleken på vattenskiktet mellan bit och täckglaset är dock sådan att mindre larver har svårt att krypa, och kan ofta fastna i kölvattnet av en glidande vuxen.
En begränsning av denna montering teknik är att direkt mekanisk eller kemisk stimulering till exakt regioner av kroppen är svårt. Senaste utvecklingen i mönstrad belysning tekniker möjliggör separat excitation av huvud eller svans-uttryckta mikrobiella opsins med separat belysning och upptäckt av GCaMP/mCherry fluorescens mellankroppen48,49. Som ett resultat, kan det vara möjligt att övervinna problemet med hjälp av optogenetic metoder.
Jämförelser till andra certifikatutfärdare 2 + Imaging metoder:
Denna metod fungerar mycket bra för att registrera ändringar i cytoplasmiska Ca2 + från enkelrum, löst celler och deras synaptiska regioner. Realtid, volymetrisk avbildning av nervceller i huvudet har nyligen uppnåtts med placeringen av cellkärnor för cell identifiering och att kvantifiera förändringar i nucleoplasmic kalcium50,51,52. Förhållandet mellan kärnvapen och synaptic Ca2 + oklar. Våra data tyder mest iögonfallande förändringar i HSN intracellulära Ca2 + uppstå på presynaptiska termini från den cell soma (figur 4 d). De presynaptiska termini i HSN och VC nervceller är inbäddade i den postsynaptiska vulval muskler26. Det är inte klart om det skulle finnas tillräcklig upplösning i dimensionen Z även med spinning disk eller ljus plåt tekniker att tillskriva presynaptiska Ca2 + signaler till specifika celler utan förlitar sig på något sätt på somatiska kalcium för cell identifiering . Med metoder som beskrivs här, varje 10 min, två-kanals inspelning med 12,001 256 x 256 pixel 16-bitars TIFF-bilder är ~ 4 GB. Förhållandet förhållandet och intensitet modulerade kanaler dubbla filstorleken till ~ 8 GB. En typisk experiment inspelning 10 djur från var och en av två genotyper (vildtyp och experimentell) genererar nästan 150 GB av primärdata och kräver 20 h att samla in och analysera. Volymetriska analyser med 10 Z skivor per tidpunkt skulle kräva en storleksordning mer data och analytisk tid, förklarar varför så få sådana studier har avslutats.
Hårdvara:
Vi registrera och analysera bildsekvenser på dubbla processorer arbetsstationer med hög prestanda (t.ex. spel) grafikkort, 64 GB RAM, och högpresterande SSD-enheter (se Tabell för material). Data ska lagras på nätverksanslutna redundant array av oberoende diskar (RAID) och säkerhetskopieras till molnet i en off-site datacenter.
Vi rekommenderar att använda high-power parallell lysdioder för pulsade fluorescens excitation över metallhalogenlampor eller kvicksilverbaserade ljuskällor. Det finns flera kommersiellt tillgängliga flerfärgade LED system. Medan vissa av dessa LED system har en högre initial kostnad, kan de har en lång livslängd (> 20.000 h), samtidigt hetsas fyra eller fler olika fluorophores och erbjuda exakt temporal kontroll använder serial eller TTL gränssnitt med låg latens (10-300 µs växla tid). Utlöser säkerställer att provet tänds endast när data samlas in faktiskt. Vi använder vanligtvis en 10 ms exponering varje 50 ms (20% tullsats). Detta minskar fototoxicitet och rörelseoskärpa under Bildinsamling, som tidigare rapporterats43.
Vi använder sCMOS kameror för sin hastighet och stort utbud av små, känsliga pixlar. En EM-CCD-kamera är ett dyrare alternativ, men ‘Blom’ effekter kan resultera i tagna photoelectrons spilla i närliggande pixlar. Nya back-belysta sCMOS kameror har liknande ljuskänslighet av EM-CCD: er till en betydligt lägre kostnad. Oavsett måste vilken sensor används, GCaMP5 och mCherry kanaler erhållas samtidigt. Sekventiell fånga flytta maskar kommer att leda till dåligt registrerade bilder olämpliga för proportionerlig kvantifieringsmetoden. Dubbla kanaler imaging kan åstadkommas på en enda kamera efter uppdelning av kanaler med hjälp av en bild-splitter (figur 2) eller två identiska kameror. Det dynamiska omfånget av 16-bitars bilder rekommenderas över 8-bitars bilder för korrekt proportionerlig kvantifieringsmetoden. För brightfield bilder av masken beteende fånga vi använder en 1 tum 4.1 MP infrarött USB3 kamera för att fånga stora 2 x 2 binned 1 024 x 1 024 8-bitars bildsekvenser efter JPEG-komprimering. Större FOV finns på nyare Mikroskop modeller tillåter en vuxen mask till visualiseras på 20 x efter 0.63 x demagnification med endast liten vinjettering (figur 4E).
Vi rekommenderar att du använder standard TTL spänningssignaler för att synkronisera belysning och frame capture. På grund av potentiella latenser i olika program rekommenderar vi att användare konfigurera kamerans fluorescens med trigger-utgångar som master med TTL utgångar köra alla andra enheter. På detta sätt samlas brightfield och scenen positionsinformationen för varje Ca2 + mätning.
Slit- eller resonant punkt-scanning confocal Mikroskop normalt återfinns i delade confocal faciliteter också ge utmärkt prestanda under proportionerlig Ca2 + imaging. Sådana instrument kan användas för att fånga två eller fler fluorescens kanaler tillsammans med brightfield24. I det här fallet confocal pinhole bör öppnas till dess maximal diameter och en spektral detektor bör användas till separat GCaMP5, mCherry och IR brightfield signaler. Detta maximerar ljus samling från en tjock (~ 20 µm) skiva samtidigt tillåta förkastande av out-of-fokus fluorescens. En nackdel är mindre FOV och mer restriktioner för anpassning av maskinvara och programvara.
Programvara:
De flesta tillverkare levererar och installerar deras kameror och Mikroskop med egenutvecklade programvara, inklusive konfiguration av utlösande ingångar och utgångar. Funktioner och utförandet av denna programvara under inspelning kan variera. Eftersom snabbrörliga maskar kan vara svårt för att spåra, image display under inspelning måste vara smidig och stabil vid 20 Hz. För att förbättra prestanda, kan bildsekvenser tillfälligt sparas i RAM med behaviorally relevanta undergrupper Sparad i slutet av experimentet. Dessa två-kanals bild sekvens filer kan konverteras till öppen bild flödescytometri standardformat (.ics) för import till den proportionerlig kvantitering programvaran. OME-TIFF är en nyare öppen källkod image format, även om olika installationer går inte att spara TIFF bildsekvenser större än 4 GB.
En nyckelfunktion i rörledningen kvantitering är generation av baserat på kanalen och sedan en opartisk bild segmentering proceduren med mCherry fluorescens för att hitta celler av intresse. Från varje Funna objekt, objektstorlek, XY centroiden position och minimum, menar, och maximal fluorescens intensitetsvärden för varje kanal (inklusive kanalen baserat) beräknas. Tillsammans, används dessa värden för att kvantifiera förändringar i intracellulära Ca2 + vid varje tidpunkt i inspelningen. Objektet mätningar för varje tidpunkt exporteras sedan som a.csv fil för senare analyser.
En stor begränsning av protokollet som beskrivs här är beroendet på flytta data i olika former genom ett lapptäcke av programvaruprodukter. En ytterligare irritation är att några av programvaran är öppen källkod och gratis medan andra är stängda, dyra och ojämnt uppdaterad. En stor förbättring skulle vara att använda eller utveckla en bit av programvara (helst öppen källkod) som ger liknande nivåer av prestanda och välbefinnande-av-använda från förvärv till analys. Som nämnts ovan, fördubblar proportionerlig analys både filstorlek och tid som krävs för att slutföra ett experiment. Generering av kamera drivrutiner som kan integreras i användaranpassningsbara ramar som Bonsai skulle tillåta bilder och andra dataströmmar samlas in och analyseras i realtid, avsevärt förbättra genomströmning.
Framtidsutsikter:
Medan vi spårar normalt mask rörelser manuellt, bör spårning av den masken centroiden upptäcks i infrarött ljus – eller mörk-fältinspelningar möjliggöra ytterligare bildbehandling noder som ger slutna justering av scenen ställning och automatiserad spårning (figur 3 och data som inte visas). Majoriteten av fluorescens inspelningarna erhålls med denna metod är mörk och saknar biologiskt intressanta data. På-sensor eller i realtid efter förvärvet bildbehandling tekniker som Beskär bildsekvenser till relevanta objekt skulle möjliggöra ökad rumslig upplösning och påskynda data analys rörledningen, särskilt om ytterligare Z-slices samlas in för varje tidpunkt för att visualisera aktivitet inom alla pre- och postsynaptiska celler i kretsen.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades genom ett bidrag från NINDS till KMC (R01 NS086932). LMN stöddes av ett bidrag från programmet NIGMS IMSD (R25 GM076419). Stammar som används i denna studie C. elegans genetik Center, som är finansierad av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Vi tackar James Baker och Mason Klein för bra diskussioner.
C. elegans growth, cultivation, and mounting | |||
Escherichia coli bacterial strain, OP50 | Caenorhabditis Genetic Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1 |
HSN GCaMP5+mCherry worm strain | Caenorhabditis Genetic Center | LX2004 | Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN. Full genotype: vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X |
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation | author | LX1832 | Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request |
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid | author | pL15EK | Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request |
pKMC299 plasmid | author | pKMC299 | Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region |
pKMC300 plasmid | author | pKMC300 | Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P8281 | For preparation of NGM plates |
Potassium Phosphate Dibasic | Sigma | P5655 | For preparation of NGM plates |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 0662 | For preparation of NGM plates |
Calcium Chloride Dihydrate | Alfa Aesar | 12312 | For preparation of NGM plates |
Peptone | Becton Dickinson | 211820 | For preparation of NGM plates |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | For preparation of NGM plates |
Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | For preparation of NGM plates |
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure | Affymetrix | 10906 | For preparation of NGM plates |
60 mm Petri dishes | VWR | 25384-164 | For preparation of NGM plates |
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 | VWR | 48393-251 | Cover glass through which worms are imaged |
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 | VWR | 48366-067 | Cover glass that covers the top of the agar chunk |
Stereomicroscope with transmitted light base | Leica | M50 | Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting |
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm | ALFA AESAR | AA39526-BW | For worm transfer |
Calcium imaging microscope | |||
Anti-vibration air table | TMC | 63-544 | Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top |
Inverted compound microscope | Zeiss | 431007-9902-000 | Axio Observer.Z1 inverted microscope |
Sideport L80/R100 (3 position) | Zeiss | 425165-0000-000 | To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera |
Tilt Back Illumination Carrier | Zeiss | 423920-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Lamphousing 12V/100W w/ Collector | Zeiss | 423000-9901-000 | For infrared/behavior imaging |
Halogen lamp 12V/100W | Zeiss | 380059-1660-000 | For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter |
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp | Zeiss | 447958-9000-000 | BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior |
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized | Zeiss | 424244-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Condenser & Shutter | Zeiss | 423921-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera | Zeiss | 425536-0000-000 | For infrared/behavior imaging |
Eyepiece 10x, 23mm | Zeiss | 444036-9000-000 | For worm localization on the agar chunk |
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier | Zeiss | 426113-0000-000 | Mount for infrared CMOS camera |
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) | FLIR (formerly Point Grey Research) | GS3-U3-41C6NIR-C | Camera for brightfield imaging |
USB 3.0 Host Controller Card | FLIR (formerly Point Grey Research) | ACC-01-1202 | Fresco FL1100, 4 Ports |
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector | FLIR (formerly Point Grey Research) | ACC-01-3000 | Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5 |
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 | Zeiss | 420650-9901-000 | Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance |
6-cube Reflector Turret, Motorized | Zeiss | 424947-0000-000 | For fluorescence imaging |
Fluorescence Light Train, Motorized | Zeiss | 423607-0000-000 | For fluorescence imaging |
Fluorescence Shutter | Zeiss | 423625-0000-000 | For fluorescence imaging |
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) | Zeiss | 489062-9901-000 | FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging |
LED illumination system | Zeiss | 423052-9501-000 | Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination |
GFP LED module (470 nm) | Zeiss | 423052-9052-000 | Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation |
mCherry LED module (590 nm) | Zeiss | 423052-9082-000 | Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation |
Iris stop slider for incident-light equipment | Zeiss | 000000-1062-360 | Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view |
C-Mount Adapter 1" 1.0x | Zeiss | 426114-0000-000 | Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera |
Image splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras |
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) | Semrock | Di02-R594-25×36 | Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals |
GFP emission filter (image splitter) | Semrock | FF01-525/30-25 | Capturing GCaMP5 fluorescence |
mCherry/ emission filter (image splitter) | Semrock | FF01-647/57-25 | This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging |
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) | Hamamatsu | A12802-01 / C11440-22CU | Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter |
Motorized XY Stage | Märzhäuser | SCAN IM 130 x 100 | Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step |
XY Stage controller with joystick | LUDL | MAC6000, XY joystick | Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud |
Digital Acquisition board (DAQ) | Arduino | Uno | Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud |
BNC Male to BNC Male Cable – 6 ft | Hosa Technology | HOBB6 | BNC connectors for TTL triggering |
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") | uxcell | 608641773651 | To connect the fluorescence camera trigger outputs |
BNC turn head adapter | Hantek | RRBNCTH21 | BNC to Banana Plug Adapter (4mm) |
BNC female to female connector | Diageng | 20130530009 | Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug |
Solderless flexible breadboard jumper wires | Z&T | GK1212827 | To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ. Male to male. |
High performace workstation | HP | Z820 | Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives |
M.2 Solid state drive | Samsung | MZ-V5P512BW | High-speed streaming and analysis of image data |
M.2 Solid state drive adapter for workstations | Lycom | DT-120 | M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter |
Network attached storage | Synology | DS-2415+ | Imaging data storage and analysis |
Hard disk drives | Western Digital | WD80EFZX | RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy) |
Software | |||
Fluorescence Acquisition | Hamamatsu | HCImage DIA | Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps |
Brightfield Acquisition | FLIR (formerly Point Grey Research) | Flycapture | Recording of brightfield JPEG image sequences |
Stage Serial Port Reader | Bonsai | https://bitbucket.org/horizongir/bonsai | Facilitates tracking of worms during behavior |
LED controller software | Zeiss | Micro Toolbox Test 2011 | To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit |
ImageJ | NIH | https://imagej.net/Fiji/Downloads | Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software |
Excel | Microsoft | 2002984-001-000001 | For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis |
Peak Finding | MATLAB | R2017a | Script used for Ratio peak feature calculations |
Ratiometric Quantitation | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects |
Scripts | |||
AnalyzeGCaMP_2017.m | MATLAB | Mean Ratio and XY centroid script | Analyzes a ratiometric output in .csv format, consolidating objects and centroid positions, calculating ratio changes (∆R/R), identifying peaks and peak features, and writing plots (with and without annotated peaks) in postscript format. For matrix file import, the script will output data into three folders: analyzed, peaks, and traces. 'Analyzed' output is a matrix file of the consolidated objects with six columns (units): time (s), area (square microns), ratio, X centroid (microns), Y centroid (microns), and ∆R/R. 'Peaks' output is a matrix file of the timepoints of found peaks, the amplitude (in ∆R/R), the peak width (s), and the prominance of the peak. 'Traces' output are postscript files of calcium traces. |
XY-stage-final.bonsai | Bonsai | TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader | Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps). X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. |