Enzym-Assays und Kinetik
English
Share
Overview
Enzym-Kinetik beschreibt die katalytische Wirkung von Enzymen, die Biomoleküle, die chemische Reaktionen notwendig für lebende Organismen zu erleichtern. Enzyme wirken auf Moleküle, als Substrate für Form-Produkte bezeichnet. Enzym kinetische Parameter werden über Assays bestimmt, die direkt oder indirekt Substrat oder Produkt Konzentrationsänderungen im Laufe der Zeit messen.
Dieses Video wird die grundlegenden Prinzipien der Enzym-Kinetik (einschließlich Ratengleichungen) und kinetische Modelle decken. Die Konzepte für die Enzym-Assays werden ebenfalls behandelt, gefolgt von einer typischen farbmetrischen Assay. Im Anwendungsabschnitt wird einen Enzym-Assay über Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Analyse, Charakterisierung von extrazellulären Enzymaktivität in der Umgebung und Ermittlungsbehörden DNA Reparatur Kinetik mit molekularen Sonden.
Enzyme sind biochemische Katalysatoren, die lebensnotwendig sind. Enzym-Assays werden verwendet, um die kinetischen Eigenschaften der enzymatischen Reaktionen, Aufklärung der katalytischen Wirkung von Enzymen zu studieren. Dieses Video deckt Enzym Kinetik und Assays, gehen über ein allgemeines Verfahren, und zeigen einige Anwendungen.
Enzyme sind Proteine oder Protein-ähnliche Moleküle, die auf ein Edukt-Molekül als Substrat bezeichnet. Enzyme reduzieren die Aktivierungsenergie von biochemischen Reaktionen. Dadurch können Reaktionen auftreten, schneller Preisen mit niedrigeren Energiebedarf.
Enzymatische Reaktionen können in drei elementaren Bestandteile aufgeteilt werden. Die erste ist die Bildung von Enzym-Substrat-Komplex, gebildet durch die Bindung des Substrats an das Enzym aktiven Seite. Die Anlage kann in seine ursprünglichen Bestandteile zerlegen. Dies ist die zweite Grundschule Reaktion. Alternativ kann die Anlage bilden das Produkt und das Enzym, das dritte elementare Reaktion zu erholen.
Die Kinetik einer elementaren Reaktion ist durch die elementaren Rate Gesetz Gleichung gegeben. Ratengleichungen Recht geben die Rate in Bezug auf die Konzentration der Reaktanden und eine Geschwindigkeitskonstante. Die Elementarreaktionen jeweils eine individuelle Rate Gesetz Gleichung mit eigenem Geschwindigkeitskonstante. Diese Gleichungen können bis zu einer kinetischen Modell, bekannt als die Michaelis-Menten-Gleichung destilliert werden. Dies gibt die Geschwindigkeit der Reaktion in Bezug auf die Substratkonzentration; die experimentell ermittelt werden kann. Einige generelle Trends für Enzymreaktionen können unter Verwendung der Michaelis-Menten-Gleichung identifiziert werden. Bei hoher Substratkonzentration ist ein Sättigungspunkt erreicht Vmax genannt. Hier, die Rate wird durch die Konzentration der gesamten Enzym begrenzt, und die Anzahl der Substrat-Moleküle ein Enzym wandelt in Produkt pro Zeit, auch bekannt als Kcat gegeben. Im Michaelis-Menten ist Kinetik Kcat eine der zwei Konstanten, die Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen. Die andere konstante KM, bekannt als die Affinität Konstante. KM entspricht auch die Konzentration wo die Reaktionsgeschwindigkeit ist gleichbedeutend mit einem halben Vmax. Ein Enzym mit einer höheren Affinität wird haben eine niedrigerere KM und Vmax schneller, während ein Enzym mit niedriger Affinität eine höhere KM haben und länger dauern, bis die Vmax zu erreichen. Kcat und KM erlaubt für Enzyme verglichen werden. Zu diesem Zweck verwenden wir eine Verhältnis genannt Enzym Effizienz. Kcat höheren und niedrigeren KM führen höhere Wirkungsgrade, während niedrigere Kcat und höhere KM-Ergebnisse im unteren.
Die Faktoren zur Enzym-Kinetik zu erhellen müssen experimentell ermittelt werden. Diese Tests werden in der Regel durch das Mischen von einer Enzym und Substrat-Lösung in einer kontrollierten Umgebung durchgeführt. Beobachtungen werden durch die Messung der Veränderungen in der Konzentration des Substrates, Produkt oder Nebenprodukte in Bezug auf Zeit.
Die Veränderung der Konzentration im Laufe der Zeit wird verwendet, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen. Für die Bestimmung die Kinetik ist Tarifdaten in mehreren Konzentrationen einzuholen. Wenn ein Grundstück von der inversen Anfangsrate vs. inverse Ausgangskonzentration, bekannt als der Lineweaver-Burk Plot, linear ist, folgt die Reaktion Michaelis-Menten Kinetik. Die Steigung und Achsenabschnitt der Linie ermöglichen die Bestimmung der kinetischen Parameter KM und Vmax, die dann zur Berechnung Kcat und die Enzym-Effizienz verwendet werden kann.
Nun, die Grundsätze der Enzym-Kinetik diskutiert haben, schauen Sie wie eine typische Enzym-Assay durchgeführt wird.
In diesem Verfahren wird ein farbmetrischen Assay demonstriert. Der erste Schritt ist eine Standardkurve generiert, die Extinktion mit Proteinkonzentration korreliert werden. Lösungen bekannter Konzentration werden zusammen mit einer Kontrollprobe vorbereitet. Eine Entwicklerlösung, die mit dem Zielprotein reagiert wird hinzugefügt, um eine farbige Verbindung zu produzieren. Extinktion gemessen und aufgetragen gegen Konzentration die Standardkurve zu generieren.
Um den Test durchzuführen, ist ein bekannter Konzentration des Substrats zusammen mit der entsprechenden Menge des Enzyms bereit. Enzym und Substrat gemischt und durfte für einen festgelegten Zeitraum zu inkubieren. pH und Temperatur werden mit Pufferlösungen und Heizblöcke gesteuert. Ein abschrecken Agent wird hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Entwicklerlösung wird dann hinzugefügt, um die Reaktionen und gemischt. Die Lösungen werden dann in Küvetten und Extinktion gemessen. Die Höhe des Substrats verbraucht wird bestimmt durch den Vergleich der gemessenen Absorption an der Standardkurve. Anhand der gesammelten Daten werden anfängliche Reaktionsgeschwindigkeiten durch Plotten Konzentration im Laufe der Zeit bestimmt. Schließlich ist mit der Tarifdaten und Konzentration, die Michaelis-Menten Handlung gemacht. Dies ermöglicht die Bestimmung der kinetischen Eigenschaften für das Enzym wie Umsatz, Anzahl und Enzym Effizienz.
Nun, da wir ein Testverfahren überprüft haben, betrachten wir andere Möglichkeiten, wie Tests durchgeführt werden und deren Anwendungen.
In diesem Verfahren Bund dient der Analyse, die Kinetik der eine Protease Eisensalz eine Peptidbindung eines Proteins zu studieren. Diese Emissionen können gemessen werden, so dass für eine kontinuierliche und quantitative Analyse Substrat Verbrauchs-und Produktionsmuster, Unterstützung bei der Bestimmung der Reaktionskinetik.
Enzym-Assays können in Umweltwissenschaften verwendet werden, um festzustellen, das Niveau der extrazellulären Enzymaktivität in der Umgebung. Gewässer, Böden und Sedimente können aus der Umgebung gesammelt und im Labor verarbeitet werden. Extrazellulären Enzymaktivität dieser Materialien kann dann mit Enzym-Assays charakterisiert werden. Dies ist ein nützliches Werkzeug für das Verständnis, wie die Umwelt organisches Material verarbeitet.
Eine Zelle DNA-Reparaturmechanismus kann ausgewertet werden, durch das Studium der Kinetik der Enzyme in den Zellkern. Die Rate, bei der ein Enzym DNA-Läsionen, oder Schadensersatz entfernt, kann mit fluoreszierenden molecular Beacons nur fluoreszieren, wenn Sie gebunden zu einzigartigen DNA-Sequenzen gemessen werden. Die Ebene der DNA-Reparatur kann in Echtzeit gemessen werden, indem er erkennt das Eindringmittel beschrifteten Spaltprodukte.
Sie habe nur Jupiters Video-on-Enzym Kinetik und Assays beobachtet. Dieses Video erklärt Enzym Kinetik, bedeckt Assay Konzepte, ging über ein allgemeines Verfahren, und einige Anwendungen beschrieben.
Danke fürs Zuschauen!
Procedure
Disclosures
Transcript
Enzymes are biochemical catalysts that are essential for life. Enzyme assays are used to study the kinetic properties of enzymatic reactions, elucidating the catalytic effects of enzymes. This video will cover enzyme kinetics and assays, go over a general procedure, and show some applications.
Enzymes are proteins, or less often RNAs, that act on a specific reactant, referred to as the substrate. An enzyme reduces the activation energy needed to initiate a biochemical reaction, causing the reaction to occur at a faster rate.
Enzymatic reactions can be broken up into three elementary components. The first is the formation of the enzyme-substrate complex, formed by the binding of the substrate to the enzyme active site. The complex can decompose into its original constituents. This is the second elementary reaction. Alternatively, the complex can form the product and recover the enzyme, the third elementary reaction.
The kinetics of an elementary reaction is given by the elementary rate law equation. Rate law equations give the rate in terms of the concentration of the reactants and a rate constant. Each of the elementary reactions has an individual rate law equation, with its own rate constant. These equations can be distilled down to a kinetic model known as the Michaelis-Menten equation. This gives the reaction rate in terms of the substrate concentration; which can be experimentally determined. Some general trends for enzyme reactions can be identified using the Michaelis-Menten equation. At high substrate concentration, a saturation point is reached, called Vmax. Here, the rate is limited by the total enzyme concentration, and the number of substrate molecules an enzyme converts into product per given time, also known as kcat. In Michaelis-Menten kinetics kcat is one of the two constants that govern reaction rate. The other constant, KM, is known as the affinity constant. KM is also equivalent to the concentration where the reaction rate is equivalent to one-half Vmax . An enzyme with a higher affinity will have a lower KM and reach Vmax faster, while an enzyme with lower affinity will have a higher KM and take longer to reach Vmax. Knowing kcat and KM allows for enzymes to be compared. To do this we use a ratio called enzyme efficiency. Higher kcat and lower KM result in higher efficiencies, while lower kcat and higher KM results in lower.
The factors used to elucidate enzyme kinetics must be determined experimentally. These assays are typically performed by mixing an enzyme and substrate solution in a controlled environment. Observations are made by measuring the changes in concentration of the substrate, product, or byproducts with respect to time.
The change in concentration over time is used to determine the reaction rate. In order to determine the kinetics, rate data must be obtained at multiple concentrations. If a plot of the inverse initial rate vs. inverse initial concentration, known as the Lineweaver-Burk plot, is linear, then the reaction follows Michaelis-Menten kinetics. The slope and intercept of the line allow for the determination of the kinetic parameters KM and Vmax, which can then be used to calculate kcat and the enzyme efficiency.
Now that the principles of enzyme kinetics have been discussed, let’s look at how a typical enzyme assay is performed.
In this procedure a colorimetric assay is demonstrated. The first step is to generate a standard curve, which will correlate absorbance with substrate concentration. Solutions of known concentration are prepared along with a control sample. A developer solution that reacts with the substrate is added to produce a colored compound. Absorbance is measured and plotted against concentration to generate the standard curve.
To perform the assay, a known concentration of substrate is prepared along with the appropriate amount of enzyme. The enzyme and substrate are mixed and allowed to incubate for a set time interval. pH and temperature are controlled with buffer solutions and heating blocks. A quenching agent is added to stop the reaction. Developer solution is then added to the reactions and mixed. The solutions are then placed in cuvettes and absorbance is measured. The amount of substrate consumed is determined by comparing the measured absorbance to the standard curve. Using the collected data, initial reaction rates are determined by plotting concentration over time. Finally, with the rate data and concentration, the Michaelis-Menten plot is made. This allows for the determination of kinetic properties for the enzyme such as turnover number and enzyme efficiency.
Now that we’ve reviewed an assay procedure, let’s look at other ways assays are performed and their applications.
In this procedure FRET analysis is used to study the kinetics of a protease hydrolyzing a peptide bond of a protein. These emissions can be measured, allowing for a continuous and quantitative analysis of substrate consumption and production, aiding in the determination of the reaction kinetics.
Enzyme assays can be used in environmental science to determine the levels of extracellular enzyme activity in the environment. Waters, soils, and sediments can be collected from the environment and processed in the laboratory. Extracellular enzymatic activity of these materials can then be characterized using enzyme assays. This is a useful tool for understanding how the environment processes organic material.
A cell’s DNA repair mechanism can be evaluated by studying the kinetics of enzymes found in the nucleus. The rate at which an enzyme removes DNA lesions, or damages, can be measured using fluorescent molecular beacons, which only fluoresce when bound to unique DNA sequences. The level of DNA repair can be measured in real time by detecting the fluorescently labeled cleavage products.
You’ve just watched JoVE’s video on enzyme kinetics and assays. This video explained enzyme kinetics, covered assay concepts, went over a general procedure, and described some applications.
Thanks for watching!
