Summary
우리는 비-침략 적, 변형, 그리고 재사용 가능한 드라이 타입 16 채널 EEG 센서를 설계. 이 종이 생산 신호 비주얼 갖는 잠재력 (VEP)의 처리를 제안 된 뇌 파 전극 건조 비-침략 적 다중 채널 EEG 센서를 사용 하 여 마우스 두 피 측정 신호 전체 프로세스를 설명 합니다.
Abstract
실험실 쥐와 두 피 뇌 파 연구 환경, 우리는 플런저 스프링 배럴 구조 면과 금속에서 발생 하는 기계적 힘 때문에 비-침략 적, 변형, 그리고 다시 사용할 수 있는 드라이 타입 16 채널 EEG 센서 설계 재료입니다. VEP 응답에는 vivo에서 마우스에서 획득을 위한 전체 프로세스 4 단계로 구성 됩니다: (1) 센서 어셈블리, (2) 동물 준비, VEP (3) 측정, 및 (4) 신호 처리. 이 종이 VEP 응답 submicro 전압 신호 해상도와 여러 생쥐에서의 대표적인 측정와 하위 수백 밀리초 시간 해상도 제공합니다. 제안된 된 방법에 비해 더 편리 하 고 안전은 이전에 보고 된 다른 동물 뇌 파 인수 방법, 신호 대 잡음 비율을 강화 하는 방법을 자유롭게 동물 이동로이 기술을 적용 하는 방법 등의 문제 남아 있다. 제안된 된 방법 쉽게 사용 가능한 리소스를 활용 하 고 만족 스러운 신호 품질 반복적인 VEP 응답을 보여 줍니다. 따라서,이 메서드 경도 실험 연구 및 비-침략 적 패러다임을 이용 하는 믿을 수 있는 변환 연구 활용 될 수 있습니다.
Introduction
치 매 퇴행 성 뇌 질환 환자 수가 치 매, 알츠하이머병, Parkinsonian 증후군, 그리고 스트로크는 노후화 인구와 증가 수명 증가 같은이 질병의 장기 사회 부담이 또한1,2,3증가. 또한, 정신 분열 증, 자폐증, 등 대부분 neurodevelopmental 질병, 인지 및 행동 장애 환자의 인생2,,34에 영향을 함께 제공 됩니다. 이러한 이유로, 연구원은 진단, 예방, 병 적인 이해, 장기 관측 및 뇌 질환의 치료를 개선 하기 위해 고군분투 하고있다. 그러나, 문제가 남아 두뇌의 복잡성과 한다 질병 병 리에서 형태소 분석. 변환 연구 기초 연구는 짧은 시간 내, 저렴 한 비용, 그리고 신경 과학 분야5 에서에서 높은 성공률 임상 응용 프로그램 전송 수 있기 때문에 솔루션을 식별 하는 데 유망한 도구가 될 수 있습니다. 6,7. 변환 연구의 또 다른 목표는 인 간에 대 한 동일한 방법에 대 한 비교를 허용 하는 동물에 비-침략 적 실험 방법 인간 주제에 적용을 살펴보는 것입니다. 이러한 조건이 비-침략 적 동물 준비 방법 개발에 대 한 여러 가지 중요 한 요구를 끌고있다. 한 가지 방법은 electroencephalography (뇌 파)는 대뇌 피 질의 뇌 연결 및 활동 높은 시간 분해능으로 2 차원적으로 계시 하 고는 비-침략 적 프로토콜에서 혜택입니다. 이벤트와 관련 된 잠재적인 기록 (ERP) 뇌 파를 활용 하는 전형적인 실험 패러다임 중 하나입니다.
수많은 이전 연구 고용된 비-침략 적 뇌 파 방법 침략 적 방법와 같은 임 플 란 트 나사와 극 형식 전극, 반면 인간 주제를 대상으로 동물 연구8,,910 에서 사용 된 , 11 , 12. 신호 품질과 이러한 메서드의 특성은 센서 배치의 침입에 크게 의존. 대 한 성공적인 변환 연구, 인간의 연구13에 사용한 것과 동물 연구에 대 한 동일한 조건을 사용 하 여 강조 하는 가너. 그러나 동물을 사용 하 여 기본 연구,, 비-침략 적 뇌 파 방법론 되어 있습니다 하지. 실험실 쥐에 초점을 맞추고 비-침략 적 두 피 뇌 파 센서 시스템을 사용 하 여 새로운 접근 방식을 인 간에 대 한 비-침략 적 패러다임에 적용 될 수 있는 변환 연구에 대 한 안정적이 고 효율적인 도구 것입니다.
다 수의 마우스 뇌 파 연구의 PCB의 상용화 방법을 이끄는 (인쇄 회로 기판) 기반 멀티 채널 전극14,,1516. 그들은 침략 적 방법을 채택, 그들은 채널 (3-8), 대규모 두뇌 역학 관찰 하기 어렵게 만든 수가 제한 했다. 또한, 응용 프로그램 그들의 침입 및 높은 비용에 의해 제한 될 수 있습니다. 또 다른 연구, KIST (한국 과학 및 기술) 40 채널 구체의 기반 박막 전극 개발 하 고 마우스의 두개골17,,1819,20에 그것을 연결 . 이 작품 인수 마우스 뇌 파 채널의 가장 높은 번호. 그러나 그것은,, 기계적으로 약하고 쉽게 재사용; 따라서, 선도 약화 신호를 가능 하 게 한 면역 반응에 의해 발생 하는 장기 관측에 적합 했다. 한편, Troncoso 및 Mégevand 획득 감각 evoked 가능성 (9 월) 설치류의 두개골에 천공된 (PMMA, 아크릴 유리) Poly(methyl methacrylate) 그리드21,22 에 의해 보안 32 스테인리스 전극 , 23. 그들의 높은 신호 품질에도 불구 하 고 전극은 기계적으로 유연 하 고 부드러운; 따라서, 그들은 여러 실험에 적용 되 고 어려움을 했다. 또한,이 방법은 여전히 최소한 침략 적 이었다. 이러한 방법은 좋은 신호 품질을 제공 하지만 마우스의 두개골의 표면적이 제한, 따라서 전극의 수는 스테인리스 극 형 전극 사용 하 여 제한. 마우스에 대 한 이전 뇌 파 연구의 숫자 몇 가지 제한 했다. 이 연구에서 우리는 비-침략 적 드라이 타입 멀티 채널 센서를 사용 하 여 전 임상 변환 연구에 적용 가능한 뇌 파 측정 하는 새로운 방법을 보여줍니다.
이전 동물 뇌 파 방법론 동물 준비, 침해, 높은 비용, 낭비, 및 약한 기계적 강도의 본질적인 복잡성을 포함의 한계를 극복 하기 위해 우리는 전시 하는 새로운 전극 개발 하고자 유연성, 건식 상태, 다중 채널 기능, 비-침해, 및 재사용. 다음 프로토콜에서 마우스 두 피 건조, 비-침략 적, 다중 채널 EEG 센서를 사용 하 여에 비주얼 갖는 잠재력 (VEP) 녹음을 측정 하는 과정을 설명 합니다. 이 방법은 따라서 공학 분야에서 동물 실험으로 진입 장벽을 낮추는 쉽게 사용할 수 있는 리소스를 사용 합니다.
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Protocol
동물 관리 및 처리는 광주 과학 기술원 및 기술 (GIST)의 기관 지침에 따 랐 다.
참고: 한 마우스에서 vivo에서 에서 VEP 신호 획득을 위한 절차의 4 단계 구성: (1) 센서 어셈블리, (2) 동물 준비, VEP (3) 측정, 및 (4) 신호 처리.
1. 센서 어셈블리
- 한 비-침략 적 전극에 대 한 16 개의 핀을 준비 합니다.
참고: 각 핀 형 전극의 세 부분으로 구성 됩니다: 프로브 헤드 플런저, 내부 봄, 그리고 그림 1a와 같이 배럴. 각 핀의 길이 13 m m 이며 조정 가능한 봄 사전 로드 길이 1 m m 이다. - 유리 섬유 기판의 두 조각을 잘라 (두께: 1.5 m m) 15 m m × 17 m m (폭 × 높이)의 크기.
참고: 여러 개의 신호를 분리 하는 절연체로 비 전도성 섬유 유리 기판 기능 마우스의 두 피에서 동시에 인수. - 그림 1 c와 같이 확인 16 구멍 직경 1.2 m m의 정밀 조각 기계 사용.
- 평면 기판 위에 2 mm의 간격에 균등 하 게 프로브 조정 밖으로 확산: 7/0, + 2 /-2, 2/0, + 2 / + 2, 0 /-4, 0 /-2, 0/0 (bregma) 0 / + 2, 0 / +,-2 /-3,-2 /-1,-2 / + 1,-2 / + 3,-4 /-2,-4/0 -4 / 2 (m m에서 bregma의 기초와 anteroposterior/측면)24,,2526.
- 두 기판 스택과 기판 층, 3mm 두께 16 안정적이 고 병렬 전극 신호 중 지원의 더블 레이어를 생산 사이 빠른 연기 접착제 접착제 한 방울을 적용.
- 수동으로 하나 하나 기판에 16 전극 조립.
참고: 작은 구멍 직경에 동일한 길이 각 전극을 중지합니다. 각 구멍 직경 단일 핀 (1.3 m m) 어떤 완화 없이 꽉 고정 전극의 수 내 배럴의 두꺼운 직경 보다 약간 작습니다. - 솔더 및 각 전극의 끝 솔더 컵 부분 터치 증거 커넥터에 연결.
- 표지 및 전기 절연 제를 위한 열 수축 튜브와 함께 벌 거 벗은 접합 숨기기.
2. 동물 준비
- Anesthetize ketamine:xylazine 100:10의 복 (i.p.) 주사와 마우스 (100 mg / mL:10 mg/mL) 몸 무게의 10 µ L/g 양의 혼합물.
참고: 동물의 마 취는 한 다리를 당기 거 나 준비를 시작 하기 전에 꼬리를 조정 하 여 적절 한 확인 하십시오. - 마우스의 각 막을 면봉으로 촉촉한 유지 하 눈 연 고를 적용 합니다.
- 머리와 머리 깎기로 어깨 주위 머리카락을 제거 후 상용 depilatory 크림을 확산 하 고 3-4 분이 지역에 그것을 유지.
- 주걱,으로 적용 된 탈모를 제거 하 고 나머지를 적용 물 여러 번 하는 젖은 손수건으로 닦아.
3. VEP 측정
참고: 전체 VEP 측정 하는 과정에서에서 일어났다 어두운 패러데이 케이지 (폭 × 깊이 × 높이: 61 × 61 × 60 cm).
- 마우스의 귀 운하에 귀 막대를 배치 하 고 장소에 정확 하 게 그들을 강화 하 여 stereotaxic 프레임에 마우스의 머리를 탑재 합니다.
- 주문 품 전극 홀더 (그림 1b)에 센서를 탑재 하 고 그림 1d에서 같이 stereotaxic 프레임 센서 홀더를 수정.
- 기준 전극 위치와 bregma 위치27고려 유연한 뇌 파 센서를 찾습니다. 그 후, 기준점과 전극 plungers 문의 곡선된 여백에 균등 하 게 마우스의 두 피는 매우 신중 하 게 수직 방향으로 센서를 낮은.
참고: 낮춘된 거리 플런저의 조정 가능한 길이 1mm 보다 작습니다. - 임피던스는 2 m ω ~ 100 k ω에서 적절 한 범위 내에서 확인 합니다. 핀의 임피던스 값 범위28때 전극 위치를 변경할.
- 마우스의 눈에서 20 cm 사진 자극 위치.
- 실험을 시작 하기 전에 어둠 시각 적응에 대 한 어두운 장에 10 분 동안 마우스를 적응.
- 실험 장치 매개 변수를 다음과 같이 설정: 샘플링 주파수: 500 헤르쯔; 노치 필터링: 60 Hz; 간 자극 간격: 10 s; 기간 플래시: 10 ms; 플래시 자극의 수: 100 재판/주제.
참고: 플래시 빛은 백색 광 LED 조명 550 ± 20% lx 20 cm의 거리는 이다.
- 실험 장치 매개 변수를 다음과 같이 설정: 샘플링 주파수: 500 헤르쯔; 노치 필터링: 60 Hz; 간 자극 간격: 10 s; 기간 플래시: 10 ms; 플래시 자극의 수: 100 재판/주제.
4. VEP 응답 신호 처리 절차
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Epoching
- 직렬 데이터를 지속적으로 측정에 대 한 단일 재판 VEP 세그먼트 사전 자극 기간 (-300 ms)에서 후 자극 기간 (600 ms), 플래시 자극 증상에 따라 만들려는 각 epoch를 추출 합니다.
참고: 우리가 반복 해 서 각 주제에 대 한 100 개 이상의 실험 플래시 자극을 제공, 이후 각 마우스에 대 한 100 VEP 신기의 총이이 단계에서 추출 됩니다. 뇌 파 epoching 특정 시간 윈도우 지속적으로 측정 된 EEG 신호 데이터에서 추출 되는 과정 이다.
- 직렬 데이터를 지속적으로 측정에 대 한 단일 재판 VEP 세그먼트 사전 자극 기간 (-300 ms)에서 후 자극 기간 (600 ms), 플래시 자극 증상에 따라 만들려는 각 epoch를 추출 합니다.
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다시 (평균 참조)를 참조
- 모든 14 전극 매번 채널 가리킨 다음 각 채널에서 평균된 값을 빼기에 걸쳐 뇌 파 신호의 평균을 계산 합니다. 모든 VEP 신 기원에 대 한이 절차를 반복 합니다.
- 밴드 패스 ~ 1-100에서 신호의 필터링 Hz 유한 임펄스 응답 (FIR)을 사용 하 여 필터.
-
기준선 보정
- 사전 자극 기간에 뇌 파 신호의 평균 계산 (초기 계획 기간,-300 ~ 0 ms) 각 채널에 대 한 파형의 각 지점에서이 평균 뺍니다 (-300 ~ 600 ms). 이 진폭 축의 VEP 응답 자극 후의 뇌 파 변화 관찰을 용이 하 게 조정 합니다. VEP 신기의 모든에 대해이 단계를 반복 합니다.
-
그랜드 VEP 응답
- 평균 단일 주제를 만들 단일 재판 VEP epochs VEP 파형 각 채널에 대 한 평균. 그런 다음, VEP 모든 과목에 대해 각 채널에 대 한 응답의 그랜드 앙상블 평균을 계산 합니다.
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Representative Results
우리는 그림 2와 같이 11 쥐에서 VEP 응답의 앙상블 평균을 계산 합니다. 이 결과 자극 시간 0 s에 주어진 대로 후 자극 기간 (600 ms), 사전 자극 기간 (-300 ms)에서이 실험을 통해 얻은 VEP 응답을 보여 줍니다. 그것은 눈에 띄는 신호만 변동 (미만 300 ms) 자극, 신호 후 자극 기간 동안 꾸준히 안정화 하는 동안 후. 또한, 14 채널 유사한 형태학 및 패턴29공개 VEP 응답에 따라 여러 그룹으로 분류 될 수 있습니다. 이 메서드는 역학과 시간적, 공간적 특성을 존중 하는 뇌 파의 이해에 대 한 통찰력을 제공 합니다.
그림 1 : 마우스 뇌 파 센서 설명 및 마우스 뇌 파 센서를 사용 하 여 위한 지침. (a) 16 핀 EEG 전극 (b) 사용자 지정된 전극 홀더 (c) 16 전극 배열 핀 지도; (GND) 지상 전극과 참조 전극 (Ref) 블랙 (d), vivo에서 마우스 뇌 파 측정 stereotaxic 프레임에 제안 된 센서와 사용자 지정 된 소유자를 사용 하 여 강조 표시 됩니다. 이 그림 29에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 대표 비주얼 14 채널에서 잠재적인 실험 결과 불러 일으켰다. 그랜드 비주얼 갖는 잠재적인 신호 후 자극 기간 (600 ms) 사전 자극 기간 (-300 ms)에서 모든 시련과 모든 11 과목의 평균. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리 첫째 복잡 한 수술 과정을 최소화 하 여 실용성을 우선 순위는 센서의 디자인에 집중. 변형 뇌 파 센서는 16 핀을 이루어져 있다: 녹음, 한 지상, 및 마지막 한 14 참조 전극. 각 전극 플런저-봄-배럴 구조, 그래서 그들은 곡선과 부드러운 마우스의 두 피에서 균일 하 고 안정적인 신호 수집을 용이 하 게 전극의 접촉면에 deformability를 적용 하는 있다. 동물의 복지를 고려 하 고 우리는 스프링 힘에 의해 발생 하는 피부-전극 인터페이스29의 접촉 영역을 확대 하 여 피부에 적용 압력을 경감 하 여 통증을 최소화 하려고.
멀티 채널 전체 전극의 구성 하는 개별 핀 두께, 길이, 플런저 유형, 다양 한 사양이 고 강도 봄. 이러한 다양 한 옵션의 고통을 해소 하는 전극 디자인을 고민 한다. 또한, 핀 지도 배열 및 전극의 수는 실험의 목적에 따라 수정할 수 있습니다. 전극 홀더 및 섬유 유리 기판은 다른 방법론 및 다른 디자인, 3D 인쇄 방법30,31에 의해 만들 수 있습니다.
일반적으로, 건조 전극의 임피던스 임피던스, 높고 젖은 전극32,33에 비해 낮아진된 신호 품질을 일으키는 나타났습니다. 우리는 2 m ω를 100 k ω에서 적절 한 범위 내에서 임피던스 검사를 통해 두 피에도 힘 아래 16 전극의 적절 한 위치를 확인할 수: 범위 인간33에 대 한 상용화 드라이 형 뇌 파 전극과 비교 했다 . 임피던스 값의 범위는 296.2 k ω에서 1,522.6 k ω (± SD 의미: 825.2 ± 443.2 k ω). 한편, 아마 내부 스프링에 의해 발생 하는 두 피에 기계적 압력 전극의 임피던스를 낮 췄 다, 따라서,이 신호 개선34영향을 수 있습니다. 핀 헤드의 표면에 전도 젤 적용을 통해 신호 품질을 향상 시킬 수 있지만이 밀폐 된 마우스의 두 피 영역 때문에 인접 한 핀 사이 신호 간섭을 발생할 수 있습니다.
새롭게 설계 된 EEG 센서의 비보에 유틸리티를 증명 하기 위해 우리는 이벤트와 관련 된 잠재적인 녹음 패러다임 VEP를 구현 전형적인 수동 EEG 패러다임 중 하나. 비록 우리가 어떤 전도 젖은 젤 없이 마우스의 두 피에 VEP 신호 측정, 신호 같은 마우스 종27epicranial 뇌 파의 이전 VEP 결과를 비교 했다. VEP 프로세스 측정, 동안 개별 부품 모든 전극 홀더, stereotaxic 프레임 등의 접지는 외부에서 전기 소음을 최소화 하기 위해 필수적인 과정 이다. 우리는 또한 어두운 시각 적응 및 기본 감각 적응35,36VEP 실험을 시작 하기 전에 10 분 동안 마우스를 유지.
결론적으로, 비-침략 적 건조 멀티 채널 마우스 머릿가죽 EEG 센서를 사용 하 여 시각적 evoked 가능성을 제공 하는 반복 실험 프로토콜을 설명 합니다. 여기에 설명 된 방법은 비-침략 적, 따라서 그것은 어떤 추가적인 수술 준비로 드라이 형 전극 사용 하는 경우 실시 젤, 준비 시간을 줄이고 필요 하지 않습니다. 또한, 소지 여러 전극 센서 우리가 동시에 다른 두 피 영역에서 뇌 파를 측정할 수 있습니다. 비-침략 적 두 피 뇌 파 센서에 대 한 제안된 방법 비교, 안정적이 고 효율적인 결과 함께 인간의 연구에 기초 과학 결과 연결 하는 변환 연구 분야에 기여할 수 있습니다. 궁극적으로,이 중요 한 특성을 가진 접근 편의 안전을 모두 사용자와 주제를 제공합니다. 아직도, 연구 문제, 신호 품질을 향상, 다른 뇌 파 수집 방법론으로 신호 품질을 비교 하 고 자유롭게 이동 마우스에이 방법을 적용 등 더 있다. 또한, 제시 방법 더 가능성 있다 vivo에서임상 작은 동물 뇌 파에 응용 연구, 대규모 두뇌 네트워크 분석, 감각 되 살려 진 잠재적인 녹음, 그리고 조합을 두뇌 자극 또는 표면-깊은 electrophysiological 녹음 방법입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 GIST 연구소 (GRI), 2017 년에서 GIST 제공한 교부 금을 통해 GIST-대학원생 연구 협업 프로젝트 부분에 지원 했다. 또한 연구 그랜트 (NRF-2016R1A2B4015381)의 국립 연구 재단 (NRF) (MEST), 한국 정부 및 한국 뇌 연구원 과학의 부, 정보 통신, 및 미래 투자를 통해 KBRI 연구 프로그램을 자금 지원 계획 (17-BR-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 50 Inj. (Vial) | Yuhan | - | Ketamine HCl 57.68 mg |
| Zoletil 50 Inj. | Virbac | - | Tiletamina 125 mg/ Zolazepam 125 mg |
| Rompun 2% Inj. | BAYER | - | Xylazine hydrochloride 23.32mg/mL |
| Hycell solution 2% | Samil | - | Hydroxypropylmethylcellulose 20 mg |
| Puralube Vet Ointment 3.5 mg | Pharmaderm | - | |
| Saline solution Inj. | JW Pharmaceutical | - | NaCl 9 g/1000 mL |
| Veet Hair Removal Cream – Legs & Body - Sensitive Skin | Reckitt Benckiser | - | depilatory |
| Skins - Surgical Skin Marker | Surgmed | S-3000 | STERILE - Multi-Tip Fine Marker with ruler and label set |
| Stainless Steel Micro Spatulas | HEATHROW SCIENTIFIC | HS15907 | One Round Flat End, 2L x 5/16W" |
| cotton swap | |||
| Stereotaxic, Desktop Digi Single | RWD Life Science | 68025 | |
| Mouse Adapter | RWD Life Science | 68010 | |
| Ear Bar for Mouse Non-Rupture | RWD Life Science | 68306 | |
| Mitsar-EEG 202-24 | MITSAR | amplifier | |
| EEGStudio EEG acquisition software | MITSAR | ||
| White flash stimulator | MITSAR | MITSAR Flash stimulator | |
| BCI2000 software | Schalk lab | ||
| g.USBamp | g.tec | 0216 | |
| g.Power-g.USBamp | g.tec | 0247 | |
| 441 style straight body Touch Proof connector | PlasticsOne | 441000PSW080001 | 441 - 000 PSW 80" (BLACK) |
| Standard probe | LEENO | SK100CSW | http://www.globalinterpark.com/detail/detail?prdNo=2114277241&dispNo=001851006012 |
| Precision engraving machine tools | TINYROBO | TinyCNC-6060C | |
| Heat shirink | 3M | FP301 |
References
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