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Neuroscience

Des enregistrements de potentiels évoqués visuels chez les souris en utilisant un multicanal Non invasif de la sec du cuir chevelu EEG capteur

Published: January 12, 2018 doi: 10.3791/56927
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Department of Biomedical Science and Engineering (BMSE), Gwangju Institute of Science and Technology (GIST), 2School of Electrical Engineering and Computer Science (EECS), Gwangju Institute of Science and Technology (GIST), 3School of Mechanical Engineering (SME), Gwangju Institute of Science and Technology (GIST)

Summary

Nous avons conçu un capteur de 16 canaux EEG de type sec qui est non invasif, déformable et ré-utilisable. Cet article décrit l’ensemble du processus de fabrication des signaux de l’électrode EEG proposée pour le traitement des potentiels évoqués visuels (VEP) du signal mesuré sur un cuir chevelu de souris en utilisant un capteur d’EEG multicanal non invasif sec.

Abstract

Pour les environnements de recherche du cuir chevelu EEG avec des souris de laboratoire, nous avons conçu un type sec 16 canaux EEG capteur non invasif, déformable et ré-utilisable à cause du piston-ressort-barrel facette structurel et des résistances mécaniques résultant de métal matériaux. L’ensemble du processus d’acquisition de la VEP responses in vivo d’une souris se compose de quatre étapes : ensemble de capteur (1), la préparation (2) animaux, VEP (3) mesure et traitement du signal (4). Ce document présente des mesures représentatives des réponses VEP de plusieurs souris avec une résolution de signal de tension submicro et la résolution temporelle des centaines de milliseconde. Bien que la méthode proposée est plus sûr et plus pratique par rapport à préalablement mesurées pour animaux méthodes absorbante de l’EEG, il reste des questions y compris comment améliorer le rapport signal-bruit et comment appliquer cette technique avec se déplaçant librement les animaux. La méthode proposée utilise des ressources facilement accessibles, montre une réponse VEP répétitive avec une qualité de signal satisfaisant. Par conséquent, cette méthode pourrait être utilisée pour des études expérimentales longitudinales et fiable recherche translationnelle exploitant les paradigmes non invasif.

Introduction

Comme le nombre de patients atteints de maladies cérébrales dégénératives séniles telles que la démence, Alzheimer, syndromes parkinsoniens et les AVC ont augmenté avec une population vieillissante et une espérance de vie croissante, le fardeau sociétal à long terme de ces maladies a 1,2,3a également augmenté. En outre, la plupart des maladies neurologiques, telles que la schizophrénie et l’autisme, sont accompagnés de troubles cognitifs et comportements qui affectent un patient toute vie2,3,4. Pour cette raison, les chercheurs ont lutté pour améliorer le diagnostic, prévention, compréhension pathologique, observation à long terme et traitement des maladies du cerveau. Toutefois, les problèmes restent provenant de maladie non révélés pathologies et la complexité du cerveau. Recherche translationnelle peut être un outil prometteur pour trouver des solutions car elle permet le transfert de la recherche fondamentale aux applications cliniques dans un laps de temps plus courte, à moindre coût et avec un taux de succès plus élevé en neuroscience champs5 ,6,7. Un autre objectif de la recherche translationnelle est d’examiner l’applicabilité chez des sujets humains, qui exige des approches expérimentales non invasive chez les animaux qui permettent des comparaisons avec la même méthode pour les humains. Ces conditions ont entraîné plusieurs besoins importants pour le développement de méthodes de préparation animaux non invasif. Une méthode est l’électroencéphalographie (EEG), qui révèle la connectivité corticale et activité en deux dimensions avec une haute résolution temporelle, et qui bénéficie d’un protocole non invasif. L’enregistrement de potentiel liés à l’événement (ERP) est l’un des paradigmes expérimentaux typiques qui utilisent l’EEG.

Nombreuses études indépendants non invasif EEG méthodes précédentes afin de cibler les sujets humains, tandis que les méthodes invasives, telles que l’implant vis et électrodes de type poteau, ont été utilisés dans les études animales8,9,10 , 11 , 12. la qualité du signal et les caractéristiques de ces méthodes dépendent significativement l’empiétement que constitue le placement du capteur. Recherche translationnelle réussie, Garner a souligné en utilisant les mêmes conditions d’étude animale que celles utilisées pour la recherche humaine13. Pour la recherche fondamentale à l’aide d’animaux, cependant, des méthodes non invasives EEG ne sont pas répandues. Une nouvelle approche à l’aide d’un système de capteur non invasif cuir chevelu EEG en se concentrant sur des souris de laboratoire serait un outil fiable et efficace de recherche translationnelle qui peut s’appliquer à des paradigmes non invasif pour les êtres humains, aussi bien.

De nombreuses études de souris EEG a montré la voie en commercialisant des PCB (printed circuit board) basé à canaux multiples électrodes14,15,16. Bien qu’ils ont adopté une méthode invasive, ils avaient un nombre limité de canaux (3-8), qui rend plus difficile d’observer la dynamique du cerveau à grande échelle. En outre, les applications peuvent être limitées par leur pouvoir invasif et le coût élevé. Dans une autre étude, le KIST (Korea Institute of Science and Technology) mis au point une électrode de minces 40 canaux axée sur le polyimide et attache à crâne17,18,19,20 d’une souris . Ce travail a acquis le plus grand nombre de canaux de souris EEG. Toutefois, c’est mécaniquement faible et pas facile à réutiliser ; par conséquent, il ne convenait pas pour les observations à long terme, menant à un signal affaibli, éventuellement, causé par une réaction immunitaire. Pendant ce temps, Troncoso et Mégevand acquis un potentiels évoqués sensitifs (SEP) sur les crânes des rongeurs avec électrodes en acier inoxydable de trente-deux garantis par une perforée Poly(methyl methacrylate) (PMMA, verre acrylique) grille21,22 , 23. en dépit de leur qualité de signal élevé, les électrodes ont été mécaniquement souple et tendre ; par conséquent, ils avaient difficultés appliquées aux expériences multiples. En outre, cette méthode a été toujours mini-invasive. Bien que ces méthodes offrent la qualité du signal est bonne, la surface du crâne de la souris est limitée, donc le nombre d’électrodes est limité à l’aide d’une électrode en acier inoxydable de type poteau. Un certain nombre d’études antérieures d’EEG pour souris a montré plusieurs limitations. Dans cette étude, nous montrerons une nouvelle méthode de mesure EEG applicable en recherche translationnelle pré-clinique en utilisant un capteur non invasif de multicanal type sec.

Afin de surmonter les limites des précédentes méthodes EEG animales, qui comprenait la complexité intrinsèque de la préparation animaux, effraction, coût élevé, gaspillage et faible résistance mécanique, nous avons cherché à développer une nouvelle électrode qui présente souplesse, statut de type sec, fonctionnalités multicanaux, caractère non invasif et réutilisation. Dans le protocole suivant, nous allons décrire le processus de mesure des enregistrements de (VEP) potentiels évoqués visuels sur un cuir chevelu de souris en utilisant un capteur de sec, non invasif, multicanaux EEG. Cette méthode utilise des ressources facilement disponibles, donc abaisser la barrière à l’entrée de l’expérimentation animale dans le domaine du génie biomédical.

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Protocol

Manutention et protection des animaux a suivi l’orientation institutionnelle de la Gwangju Institut de Science et technologie (GIST).

Remarque : La procédure d’acquisition du signal VEP d’une souris in vivo consiste en quatre étapes : ensemble de capteur (1), la préparation (2) animaux, VEP (3) mesure et traitement du signal (4).

1. ensemble capteur

  1. Préparer 16 broches à une électrode non invasif.
    Remarque : Chaque électrode encliquetables se compose de trois parties : un piston tête de sonde, un ressort interne et un canon comme le montre la Figure 1 a. La longueur de chaque broche est de 13 mm et la longueur de précharge du ressort réglable est de 1 mm.
  2. Coupez deux morceaux de substrats de fibre de verre (épaisseur : 1,5 mm) avec une taille de 15 × 17 mm (largeur × hauteur).
    Remarque : Les fonctions de substrat en fibre de verre non conductrice comme isolant, qui sépare les signaux multiples acquises simultanément de cuir chevelu de la souris.
  3. Faire seize trous de diamètre 1,2 mm chacun en utilisant une machine de gravure de précision, comme illustré dans la Figure 1C.
    1. Étaler la coordination sonde uniformément à un intervalle de 2 mm sur le substrat plat : + 7/0, + 2 /-2, + 2/0, + 2 / + 2, 0 /-4, 0 /-2, 0/0 (bregma), 0 / + 2, 0 / + 4, -2 /-3, -2 /-1, -2 / + 1, -2 / + 3, -4 /-2, -4/0 , -4 / + 2 (antéro-postérieure latérale avec base de bregma, en mm)24,25,26.
  4. Deux substrats de la pile et appliquez une goutte de colle à action rapide entre les couches du substrat, produisant une double couche de 3 mm d’épaisseur supportant seize électrodes stables et parallèles au cours de l’acquisition du signal.
  5. Assembler les seize électrodes sur le substrat par un manuellement.
    NOTE : Le diamètre des trous plus petit s’arrête chaque électrode à la même longueur. Le diamètre de chaque trou est légèrement plus petit que le diamètre plus épais d’un baril dans la broche unique (1,3 mm) qui permet la fixation serré d’électrodes sans tout desserrage.
  6. Souder et lier une partie de soudure-coupe fin de chacune des électrodes sur le connecteur de preuve touch.
  7. Couvrir et cacher les jonctions nues avec tube thermorétractable pour l’isolation électrique.

2. animale préparation

  1. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale (i.p.) ketamine:xylazine 100:10 (100 mg / mL:10 mg/mL) mélange avec la quantité de 10 µL/g de poids corporel.
    Remarque : Vérifier que l’anesthésie de l’animal est suffisante en tirant une jambe ou tordre la queue avant de commencer la préparation.
  2. Appliquer la pommade ophtalmique pour garder la cornée de la souris humide avec un coton-tige.
  3. Enlever les poils autour de la tête et des épaules avec une tondeuse à cheveux, puis diffuser commercialement disponible crème dépilatoire et garder sur cette zone pendant 3-4 min.
  4. Retirer le dépilatoire appliquée avec une spatule et puis essuyer le reste avec des lingettes humides, appliquer l’eau plusieurs fois.

3. mesure VEP

Remarque : La VEP tout processus de mesure ont eu lieu dans une cage de Faraday sombre (largeur × profondeur × hauteur : 61 x 61 x 60 cm).

  1. Monter la tête de la souris sur le cadre stéréotaxique en plaçant des barres d’oreilles dans les canaux d’oreille de la souris et les serrer avec précision en place.
  2. Monter le capteur dans le porte-électrode sur mesure (Figure 1 b) et fixez le support de capteur sur le cadre stéréotaxique, comme illustré à la Figure 1 d.
  3. Localiser le capteur EEG flexible, tenant compte aussi bien la position d’électrode de référence et le bregma poste27. Ensuite, abaissez très soigneusement le capteur dans le sens vertical afin que les plongeurs de l’électrode en contact du cuir chevelu de la souris uniformément sur la marge incurvée.
    Remarque : La distance abaissée est inférieure à 1 mm, ce qui correspond à la longueur réglable du plongeur.
  4. Vérifier que les impédances dans la plage correcte de 100 kΩ à 2 MΩ. Repositionner l’électrode lorsque n’importe quelle valeur de l’impédance de la goupille est hors de la gamme28.
  5. Positionner le stimulateur photo 20 cm des yeux de la souris.
  6. Avant de commencer l’expérience, adapter la souris pendant 10 min dans la sombre cage d’adaptation visuelle sombre.
    1. Définissez les paramètres des dispositifs expérimentaux comme suit : fréquence d’échantillonnage : 500 Hz ; Encoche de filtrage : 60 Hz ; Intervalle de relance inter : 10 s ; Flash Durée : 10 ms ; nombre de stimuli flash : 100 essais/sujet.
      NOTE : La lumière du flash est une lumière blanche, éclairage à LED qui a 550 ± 20 % lx avec une distance de 20 cm.

4. procédures de traitement du Signal réponses VEP

  1. Epoching
    1. Pour mesurer en continu les données série, extrait de chaque époque pour créer single-trial VEP segments de la période de stimulation préalable (ms-300) pour la période après stimulation (600 ms), basés sur l’apparition de stimulation flash.
      Remarque : Étant donné que nous fournissons à plusieurs reprises la stimulation flash plus de 100 essais pour chaque sujet, un total de 100 époques VEP pour chaque souris sont tirées dans cette étape. Epoching de l’EEG est un processus dans lequel des fenêtres de temps spécifiques sont extraites des données mesurées en continu du signal EEG.
  2. Re-référence (référence moyenne)
    1. Calculer la moyenne des signaux EEG à travers toutes les électrodes quatorze canaux lors de chaque point et puis soustraire la valeur moyenne de chaque canal. Répétez cette procédure pour toutes les époques VEP.
  3. Effectuer passe-bande filtrage du signal de ~ 1 à 100 Hz à l’aide d’une réponse impulsionnelle finie (FIR) filtre.
  4. Correction de la ligne de base
    1. Calculer la moyenne des signaux EEG durant la période de stimulation préalable (période de référence, -300 ~ 0 ms) pour chaque canal, puis soustraire cette moyenne à partir de chaque point de l’onde (-300 ~ 600 ms). Cela permet d’ajuster l’axe de l’amplitude des réponses VEP pour faciliter l’observation des ondes cérébrales changements après la stimulation. Répétez cette étape pour toutes les époques VEP.
  5. Réponses de grand VEP
    1. Moyenne les époques VEP single-procès pour créer le sujet unique en moyenne des formes d’ondes VEP pour chaque canal. Puis, calculer la moyenne du grand ensemble de réponses VEP pour chaque canal à l’égard de tous les sujets.

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Representative Results

Nous avons calculé la moyenne de l’ensemble des réponses VEP des onze souris tel qu’illustré à la Figure 2. Ce résultat montre les réponses VEP obtenues par le biais de cette expérience de la période de stimulation préalable (ms-300) pour la période après stimulation (600 ms), que la stimulation a été donnée à l’heure 0 s. Il est à noter que le signal fluctue seulement pendant un certain temps (moins de 300 ms) après la stimulation, alors que le signal se stabilise progressivement au fil du temps au cours de la période de stimulation après. En outre, les quatorze canaux peuvent être classés en plusieurs groupes fondés sur les réponses VEP, révélant des morphologies semblables et modèles29. Cette méthode permet de mieux comprendre la compréhension des ondes cérébrales dynamique avec respecte les qualités spatiales et temporelles.

Figure 1
Figure 1 : Description capteur de souris EEG et instructions pour l’utilisation du capteur de souris EEG. a électrode de EEG 16 broches (b) le porte-électrode personnalisés (c) la broche de tableau de seize électrodes carte ; l’électrode de masse (GND) et l’électrode de référence (Ref) est surligné en noir (d), in vivo souris EEG mesure utilisant le capteur proposé et le support personnalisé sur le cadre stéréotaxique. Ce chiffre a été modifié par 29. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Visual représentant évoquée par éventuels résultats expérimentaux des quatorze canaux. Grand était en moyenne de signaux potentiels évoqués visuels d’onze de tous les sujets et tous les essais de la période de stimulation préalable (ms-300) pour la période après stimulation (600 ms). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Tout d’abord, nous nous sommes concentrés sur la conception du capteur, de prioriser la praticité en réduisant au minimum les interventions chirurgicales complexes. Le capteur d’EEG déformable est composé de seize broches : quatorze ans d’enregistrement, un pour le sol et le dernier pour électrodes de référence. Chaque électrode a la structure de piston-ressort-barrel, qui s’applique sur la surface de contact de l’électrode, la déformabilité donc ils facilitent l’acquisition de signal homogène et stable du cuir chevelu de la souris incurvé et tendre. Si l'on considère le bien-être des animaux, nous avons tenté de minimiser la douleur encourue par la force du ressort en allégeant la pression appliquée sur la peau en élargissant la zone de contact de la peau-électrode interface29.

Les broches individuelles composées de l’ensemble des canaux multiples électrode peuvent avoir diverses spécifications pour l’épaisseur, longueur, types de piston et force de printemps. Conviendrait d’envisager ces différentes options pour la conception de l’électrode pour soulager la souffrance du sujet. En outre, le tableau de carte NIP et le nombre d’électrodes peuvent être modifiés selon le but de l’expérience. Le substrat de titulaire et fibre de verre d’électrode est possible par d’autres méthodes et conceptions différentes, comme une impression de méthode30,31de 3D.

En général, l’impédance d’une électrode sèche a montré plus haut impédance et provoquant une qualité de signal abaissée par rapport à une électrode humide32,33. Nous avons pu confirmer les emplacements appropriés des seize électrodes sous la même force sur le cuir chevelu par la vérification de l’impédance dans un intervalle approprié du 100 kΩ à 2 MΩ : la gamme est comparable à l’électrode d’EEG type sec commercialisé pour un être humain33 . L’impédance valeurs vont de 296.2 KΩ à KΩ 1,522.6 (moyenne ± écart-type : 825.2 ± 443,2 KΩ). Pendant ce temps, la pression mécanique sur le cuir chevelu causée par des ressorts internes peut-être abaissé impédance de l’électrode, par conséquent, cela peut affecter le signal amélioration34. Bien qu’il soit possible d’améliorer la qualité du signal en appliquant le gel conducteur sur la surface de la têtes de pin, cela peut provoquer des interférences signal parmi les pins adjacentes à cause du cuir chevelu de la souris confiné.

Afin de prouver l’utilité in vivo de la sonde d’EEG nouvellement conçue, nous avons implémenté le paradigme enregistrement potentiels liés à l’événement VEP, qui est l’un des paradigmes EEG typiques passives. Bien que nous avons mesuré VEP signaux sur le cuir chevelu de la souris sans tout gel conducteur humide, le signal était comparable au résultat de l’epicranial EEG VEP précédent du même souris espèces27. Au cours de la VEP, processus de mesure, la mise à la terre de toutes les parties individuelles, telles que le cadre stéréotaxique et le porte-électrode, est un processus essentiel pour minimiser le bruit électrique de l’extérieur. Nous avons également maintenu souris pendant 10 min avant de commencer l’expérience VEP, sombre adaptation visuelle et adaptation sensorielle primaire35,36.

En conclusion, nous démontrons un protocole expérimental reproductible pour fournir des potentiels évoqués visuels en utilisant le capteur du cuir chevelu EEG non invasif sec multi-canal souris. La méthode décrite ici est non invasif, donc il ne nécessite aucune préparation chirurgicale supplémentaire, mais aussi réduire le temps de préparation de gel conducteur, si on utilise des électrodes de type sec. En outre, un capteur possédant plusieurs électrodes permet de mesurer les ondes cérébrales de zones du cuir chevelu différentes simultanément. La méthode proposée pour capteur non invasif cuir chevelu EEG peut contribuer aux domaines de recherche translationnelle connexion résultats des sciences fondamentales aux études chez l’homme avec des résultats comparables, fiables et efficaces. En fin de compte, une approche avec ces caractéristiques significatives offre commodité et sécurité aux utilisateurs et sujets. Pourtant, il existe encore des questions de recherche, tels que l’amélioration de la qualité du signal, en comparant la qualité du signal avec les autres méthodes d’acquisition ondes cérébrales et en appliquant ces méthodes dans la souris déplace librement. En outre, la méthode présentée a d’autres possibilités pour application à préclinique animal petit EEG études in vivo, à grande échelle cerveau réseau analyse sensorielle évoqué éventuels enregistrements et combinaisons avec stimulation de cerveau ou Méthodes d’enregistrement électrophysiologique surface profondeur.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par l’Institut de recherche GIST (GRI), le projet de Collaboration de recherche GIST-Caltech grâce à une subvention octroyée par GIST en 2017. Également soutenu par une subvention de recherche (FRO-2016R1A2B4015381) de la Fondation nationale recherche (NRF), financé par le gouvernement coréen (MEST) et par le programme de recherche fondamentale KBRI par le biais de Corée Brain Institute de recherche financé par le ministère de la Science, TIC et l’avenir Planification (17-BR-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine 50 Inj. (Vial) Yuhan - Ketamine HCl 57.68 mg
Zoletil 50 Inj. Virbac - Tiletamina 125 mg/ Zolazepam 125 mg
Rompun 2% Inj. BAYER - Xylazine hydrochloride 23.32mg/mL
Hycell solution 2% Samil - Hydroxypropylmethylcellulose 20 mg
Puralube Vet Ointment 3.5 mg Pharmaderm -
Saline solution Inj.  JW Pharmaceutical  - NaCl 9 g/1000 mL
Veet Hair Removal Cream – Legs & Body - Sensitive Skin Reckitt Benckiser - depilatory
Skins - Surgical Skin Marker Surgmed S-3000 STERILE - Multi-Tip Fine Marker with ruler and label set
Stainless Steel Micro Spatulas HEATHROW SCIENTIFIC HS15907  One Round Flat End, 2L x 5/16W"
cotton swap
Stereotaxic, Desktop Digi Single RWD Life Science 68025
Mouse Adapter RWD Life Science 68010
Ear Bar for Mouse Non-Rupture RWD Life Science 68306
Mitsar-EEG 202-24  MITSAR amplifier
EEGStudio EEG acquisition software MITSAR
White flash stimulator  MITSAR MITSAR Flash stimulator
BCI2000 software Schalk lab
g.USBamp g.tec 0216
g.Power-g.USBamp g.tec 0247
 441 style straight body Touch Proof connector PlasticsOne 441000PSW080001 441 - 000 PSW 80" (BLACK)
Standard probe LEENO SK100CSW http://www.globalinterpark.com/detail/detail?prdNo=2114277241&dispNo=001851006012
Precision engraving machine tools TINYROBO TinyCNC-6060C
Heat shirink 3M FP301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Des enregistrements de potentiels évoqués visuels chez les souris en utilisant un multicanal Non invasif de la sec du cuir chevelu EEG capteur
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Yeon, C., Kim, D., Kim, K., Chung,… More

Yeon, C., Kim, D., Kim, K., Chung, E. Visual Evoked Potential Recordings in Mice Using a Dry Non-invasive Multi-channel Scalp EEG Sensor. J. Vis. Exp. (131), e56927, doi:10.3791/56927 (2018).

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