Summary
Detta arbete presenterar ett protokoll för tillverkning natrium volframhaltigt och natrium molybdat mikrokapslar via bakterier och deras motsvarande nanopartiklar.
Abstract
Vi presenterar en metod, bakteriell mineral utsöndring (BME), för syntes två typer av mikrokapslar, natrium volframhaltigt och natriummolybdat och de två metalloxider motsvarande nanopartiklar — den förra är så liten som 22 nm och senare 15 nm. Vi matas två stammar av bakterier, Shewanella alger och Pandoraea sp., med olika koncentrationer av volframhaltigt eller molybdat joner. Koncentrationerna av volframhaltigt och molybdat justerades för att göra mikrokapslar av olika längd-diameter nyckeltal. Vi fann att ju högre koncentration desto mindre nanopartiklarna var. Nanopartiklarna kom in med tre längd-diameter nyckeltal: 10:1, 3:1 och 1:1, som uppnåddes genom utfodring bakterierna respektive med en låg koncentration, en medellång koncentration och en hög koncentration. Bilder av ihåliga mikrokapslarna togs via den scanning electron microsphere (SEM). Deras kristallen strukturerar kontrollerades av röntgendiffraktion (XRD) — kristallstrukturen av molybdat mikrokapslarna är Na2MoO4 och som av volframhaltigt mikrokapslarna är Na2WO4 med Na2W2O7. Dessa synteser som alla var fulländat under ett nära omgivande villkor.
Introduction
Metalloxid nanopartiklar utnyttjas för drogen leverans1, konstruktion konstgjorda ben2, heterogen katalys3, fältet utsläpp4,5, solceller6, gas sensorer7, och Lithium batterier8. För praktiska tillämpningar, den mekaniska styrkan hos både nanokristaller och deras mikrostruktur är avgörande. Bland mikrostrukturer, kan ihåliga skal strukturer användas för att skapa lätta, mekaniskt robust material9. Bland ihåliga skal strukturer, är en sfärisk form kända för att vara styvare än ett elliptiskt form; den senare har större längd diameter förhållande än tidigare10,11. Detta arbete beskriver ett protokoll för syntetisera sfäriska mikrokapslar via bakterier med en giftfri metod under en omgivande tillstånd, som kontrasterar med alternativa metoder, bland annat Mall syntes metod12, Ultraljud-spray-assisted syntes metod13 och hydrotermiska metod14. Några av de alternativa metoderna kräver mallar12, några en temperatur så högt som 500 ° C13, och några en hög tryck14. När det gäller strukturen, syntes Mallmetoden utnyttja mallen jäst medför en core-shell struktur15, istället för en med en enda vägg, och den som använder mallen E. coli ger en struktur med längd-diameter förhållandet mellan 1.7:0.8, och inte är sfäriska. 16.
I detta arbete, har vi gjort metalloxid mikrokapslar med en enda vägg och sfärisk form en omgivande villkor genom att utnyttja bakteriell ämnesomsättning. I bakteriell glykolys, en kemisk process som metaboliserar kolkällor, som glukos och laktos, anses kolkällor vara ursprunget till att minska kraften som genereras däri. Vi manipuleras bakteriell ämnesomsättning genom justering av koncentrationen av kolkällor att uppnå önskat mål. Denna metod är miljövänlig, använda giftfria agenter och förbrukar mycket mindre el-energi. Slutligen, denna metod tillåter massproduktion av mikrokapslar helt enkelt genom att öka volymen av buljong.
Innan metoden, har det varit en annan två metoder utnyttja bakteriell ämnesomsättning att göra mineraler: biologiskt inducerad mineralisering (BIM)17 och biologiskt kontrollerade mineralisering (BCM)18. Varken BIM eller BCM kan användas för att göra natrium volframhaltigt och molybdat volframhaltigt mikrokapslar som vår process, som betecknas som den bakteriella mineral utsöndring (BME)19. I detta experiment, form av mikrokapslar kan kontrolleras för att ha ett längd-diameter-förhållande från 10:1 till 1:1 och storleken på nanopartiklar korn som bildar skalen kan justeras mellan 15 nm till 110 nm.
Protocol
Varning: Använd latex handskar, skyddsglasögon och laboratorierock för att utföra experimentet. När du använder skåpet biosäkerhet, slå på skåp fläkten och hålla skåpdörren halvslutna.
1. beredning av glaspärlor
- Placera 100 glaspärlor med 3 mm diameter i en 100 mL laboratorium flaska och sedan råga tätt.
- Autoklav innehållet vid 120 ° C i 10 min.
- Låt flaskan svalna till rumstemperatur, sedan placera den i biosäkerhet skåp.
2. förberedelse av Lysogeny buljong (LB)
- Lös 8 g pulver av LB-Lennox buljongen i en 500 mL-laboratorium-flaska med 400 mL vatten.
- Rör om innehållet med PTFE magnetisk omrörning bar i 20 min och sedan råga tätt.
- Autoklav innehållet vid 120 ° C i 10 min.
- Låt lösningen svalna till rumstemperatur och placera den i biosäkerhet skåp.
- Med pipett alikvotens buljong till åtta 15 mL centrifugrör i biosäkerhet skåp (12,5 mL vardera).
- Alikvot resterande buljongen i tre 100 mL laboratorium flaskor i biosäkerhet skåp (100 mL). Cap de tre flaskorna tätt. Hålla dem i biosäkerhet skåp.
3. kultur av Shewanella alger
- Använd den djupfrysta frysförvarade stammen.
- I biosäkerhet skåp, plocka ut 1 mL av det frusna materialet från frysta röret med rostfritt stål spatel och placera den i ett centrifugrör som bereddes i steg 3.5.
- Inkubera kulturerna för 24 h i en 37 ° C inkubator.
4. beredning av LB-Lennox (buljong med Agar) petriskålar
- Lös två tabletter av LB-Lennox (buljong med agar) till en 100 mL laboratorium flaska med 100 mL vatten.
- Rör om innehållet med PTFE magnetisk omrörning bar i 20 min och sedan locket det tätt.
- Autoklav innehållet vid 120 ° C i 10 min.
- I biosäkerhet skåp få alikvot av handen 100 mL lösning i 4 petriskålar, säkerställa varje ~ 25 mL. Låt lösningen svalna till rumstemperatur.
5. beredning av monoklonala bakterier
- I biosäkerhet skåp, etikett de tre flaskor som bereddes i steg 2,6, #1, #2 och #3, respektive.
- Pipettera 0,1 mL av den resulterande bakteriesuspensionen i steg 3.3 i flaska #1. Förslut flaskan och svinga det för hand för 1 min att få en homogen lösning.
- Pipettera 0,1 mL av den resulterande bakteriella vätskan i steg 5.2 i flaska #2. Förslut flaskan och svinga det för hand för 1 min att få en homogen lösning.
- Pipettera 0,1 mL av den resulterande bakteriella vätskan i steg 5.3 i flaska #3. Förslut flaskan och skaka den för hand för 1 min att få en homogen lösning.
- Pipettera vätskan i flaska #3 i de 4 Petriskålarna som bereddes i steg 4.4, med en volym på 0,02 mL vardera.
- Sätta de glaspärlor som bereddes i steg 1.3 i de 4 petriskålar som används, 4 pärlor i varje maträtt.
- Stäng locken på Petriskålarna och skaka dem för hand i 1 min.
- Vänd Petriskålarna uppochned och inkubera i en 37 ° C inkubator för 24 h.
6. multiplikation av monoklonala bakterier
- Hämta 7 rör bereddes i steg 2.5.
- Plocka ut de resulterande monoklonala bakterierna från de 4 petriskålar som bereddes i steg 5,8 med rostfritt stål-spatel, och sätta dem i 7 rör separat.
- Lämna de 7 rör i en 37 ° C inkubator för 24 h.
- Plocka ut en med den största ljusspridning med visuella kolorimetrisk metod.
7. förberedelse av LB-Lennox buljong med glukos och Salt
- Sätta 10 g av LB-Lennox buljong, 10 g NaCl och 10 g glukos i en 500 mL-laboratorium-flaska. Tillsätt vatten tills volymen nått 450 mL.
- Rör om innehållet med PTFE magnetisk omrörning bar i 20 min.
- Autoklav innehållet vid 120 ° C i 10 min.
8. beredning av natrium volframhaltigt
- Sätta 16,5 g natrium volframhaltigt Na2WO4.2H2O till en 100 mL laboratorium flaska med rostfritt stål spatel. Tillsätt vatten tills volymen nått 50 mL.
- Rör om innehållet med PTFE magnetisk omrörning bar i 20 min.
- Autoklav innehållet vid 120 ° C i 10 min.
- I biosäkerhet skåp, få filtratet via ett vakuum glasfiber filter med porer 1 µm.
9. beredning av LB med glukos, Salt och natrium volframhaltigt
- I biosäkerhet skåp, häll filtratet fick i steg 8,4 för hand i lösningen med glukos och salt som bereddes i steg 7,3.
- I biosäkerhet skåpet, alikvotens med pipett 500 mL resulterande lösningen i steg 9,1 till 10 x 50 mL centrifugrör.
10. kultur av bakterier
- I biosäkerhet skåp, hämta den vätska som bereddes i steg 6,4 och alikvotens det med en pipett till de 10 provrör som bereddes i steg 9,2, med varje tub får 0,05 mL.
- Inkubera i 10 tuber i en 37 ° C inkubator för 120 h.
11. skörden av BME mineraler
- Ultrasonicate var och en av de 10 tuberna i steg 9,2 vid 20 KHz med 150 W för 1 h.
- Centrifugera rören vid 2 025 x g för 1 h.
- Avlägsna den klara vätskan i rören med en pipett, tillsätt vatten och upprepa sedan steg 11.1 och 11.2 ännu en gång.
- Avlägsna den klara vätskan i rören med en pipett, lägga till alkohol och sedan ultrasonicate dem vid 20 KHz med 150 W för 1 h.
- Centrifugera rören vid 2 025 x g för 1 h.
- Upprepa steg 11.4 och 11.5 en gång
- Skörda BME mineraler genom att ta bort den klara vätskan i rören med en pipett; därefter omedelbart cap rören utan att köra någon torkningen.
12. pendlande temperatur med Pandoraea sp. och molybdat
- Kultur Pandoraea sp. på samma sätt som i steg 2, 3, 4, 5 och 6 för Shewanella alger. Resultatet av detta steg motsvarar steg 6,4.
- Gör LB buljong med både glukos och salt på samma sätt som i steg 7, 8 och 9, förutom att den 16,5 g natrium volframhaltigt i steg 7,1 ersätts med 12 g natriummolybdat, Na2MoO4 · 2H2O. Resultatet av detta steg motsvarar steg 9,2.
- I biosäkerhet skåp, Hämta vätskan beredd i steg 12,1 och alikvotens det med en pipett till de 10 tuber som bereddes i steg 12,2, med varje rör mottagande 0,05 mL.
- Inkubera i 10 tuber i steg 12,3 under pendlande temperaturer för 120 h i en reciprocal skakar bad, oscillerande temperaturen 5 gånger mellan 25 ° C och 37 ° C, med varje temperatur som varar i 12 h.
Representative Results
Figur 1 visar äkta sfäriskt mikrokapslar. Båda två stammar av bakterien, Shewanella alger och Pandoraea sp., ursprungligen har längd-diameter förhållandet 3:1. För att uppnå längd diameter förhållandet 1:1, en hög koncentration (> 100 mM) av metall oxyanions krävs. En låg koncentration (< 5 mM) av oxyanions kan resultera i en längd diameter förhållandet 10:1, som att i figur 2, som resultera från inflödet av den oxyanions, blockerar den binär fissionen av bakterier. Slutligen, för att uppnå en längd diameter förhållandet 3:1, som i figur 3, en medellång koncentration (~ 20 mM) av oxyanions behövs. Bildandet av sfäriska skal, med en längd diameter förhållandet 1:1, kan åstadkommas genom bakteriell enheter som gör själva krympa deras yta för att balansera intaget av oxyanions samtidigt sprida oxyanions genom cellmembranet. Tre siffrorna visar tillsammans längd diameter förhållandet kan stämmas till 10:1 till 1:1 enkelt genom justering av koncentrationen av oxyanions.
Figur 4 och figur 5 visar nanopartikelportföljen korn av natriummolybdat i olika storlekar: det mindre som 15 nm, och den större en 110 nm. Observera att i figur 5, på icke-krossade skalen, partiklar av 110 nm kan fortfarande vara kedjad till varandra, bildar porösa skal. Den största som har vunnits genom oscillerande temperaturen av culturing buljongen 5 gånger mellan 25 ° C och 37 ° C, med varje temperatur som varar i 12 h. Under temperatur svängning, korn av olika storlekar inte endast kan framställas utan också upprätthålla mikro-sfäriska struktur, vilket innebär att vi kan göra mikrokapslar med olika kornstorlekar, från 15 nm till 110 nm, bara genom att kontrollera buljong temperaturen .
Figur 6 visar sönder väggen med större korn bor bredvid öppningen av väggen. Väggtjockleken är ca 22 nm och större säden är ca 40-60 nm. Skillnaden i storlek kan resultera från olika metaboliska processer, som ännu inte identifierats.
Figur 1: The SEM-bild av ihåliga sfäriska skal med längd-diameter förhållandet 1:1. Denna struktur var gjord av natrium volframhaltigt utsöndras av Shewanella alger med glukos som kolkälla. Omtryckt med tillåtelse från ECS J. av Solid State Sci. och Tech., 6.3, N3113 (2017). Copyright 2017, elektrokemiska samhället. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: The SEM-bild av ihåliga lång glödtråden skal med längd-diameter förhållandet 10:1. Denna struktur var gjord av natriummolybdat utsöndras via Pandoraea sp. med glukos som kolkälla. Omtryckt med tillåtelse från ECS J. av Solid State Sci. och Tech., 6.3, N3113 (2017). Copyright 2017, elektrokemiska samhället. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: The SEM-bild av trasiga ihåliga stavformade skal med längd-diameter förhållandet 3:1. Denna struktur var gjord av natrium volframhaltigt utsöndras av Shewanella alger med glukos som kolkälla. Omtryckt med tillåtelse från ECS J. av Solid State Sci. och Tech., 6.3, N3113 (2017). Copyright 2017, elektrokemiska samhället. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: The SEM-bild av krossade natrium molybdat skal med en partikel kornstorlek 15 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: The SEM-bild av sönderslagna och icke-krossat natrium molybdat skal med en partikel kornstorlek på 110 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: The SEM-bild av trasiga ihåliga skal med längd-diameter förhållandet 1:1. Denna struktur var gjord av natrium volframhaltigt utsöndras av Shewanella alger med glukos som kolkälla. Granulat med en storlek om 40-60 nm hänga utanför skalet alldeles intill ett stort hål, medan skalet själv är gjord av korn med en storlek ca 22 nm. Omtryckt med tillåtelse från ECS J. av Solid State Sci. och Tech., 6.3, N3113 (2017). Copyright 2017, elektrokemiska samhället. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
När det gäller bärkraften av experimentella resultat är förberedelse och multiplikation av monoklonala bakterier kritiska. Detta experiment, skiljer sig från mall syntes experiment15,16, anställd bioaktiva gramnegativa bakterier. För att få en enda vägg, valde vi prokaryota bakterier istället för eukaryota bakterier som jäst15. För att uppnå en sfärisk form med längd-diameter förhållandet 1:1, i stället för en större baserat på längd-diameter16, matade vi bakterier med en mycket högre koncentration av oxyanions för att manipulera dem att krympa till en sfärisk form, att göra mikrokapslar med en enda, runda och tunna vägg (< 30 nm).
Eftersom BME bygger främst på justering av koncentrationen av oxyanions att styra metabolismen av bakterier, dragen den två begränsningar. För det första, koncentrationen av oxyanions begränsas av löslighet, om koncentrationen bör vara så högt som möjligt. Andra, mest bakteriell ämnesomsättning kommer att stanna vid en temperatur över 45 ° C eller under 5 ° C, respektive övre och nedre gränserna för vårt experiment.
Trots dessa två begränsningar har BME stor potential för att göra metalloxid material av praktiskt intresse. För att stärka detta påstående, vi kommer att prova denna metod för att göra zirkonium mikrokapslar och järn mikrokapslar — den förra är en bra kandidat material för konstgjorda ben, och den senare för drogen leverans.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Under detta arbete stöds av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan, Republiken Kina, bevilja nummer mest 105-2221-E-011-008, och även av avancerat-Connectek Inc., Taipei, Taiwan, ROC enligt avtal nummer RD Ref. nr 6749 och inst. Ref. nr 011 genom den Graderad Institute of Elektro-optiska Engineering, National Taiwan University of Science och teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB(Lennox)broth with agar tablets | Sigma-Aldrich | L7075 | 1 tablet for 50 mL broth with agar |
| LB (Lennox) broth | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | LB (Lennox) powder 1 kg |
| Dextrose anhydrous | Nihon Shiyaku Reagent | PL 78695 | glucose |
| Sodium Tungstate | Nihon Shiyaku Reagent | PL 76050 | Na2WO4 · 2H2O |
| Sodium Molybdate | Nihon Shiyaku Reagent | PL103564 | Na2MoO4 · 2H2O |
| Sodium Chloride | Nihon Shiyaku Reagent | PL 68131 | NaCl |
| Ethanol 99.5% | Acros organics | AC615090040 | CH3CH2OH |
| Water | Made in our university | de-ionlized water | |
| Autoclave | Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei City, Taiwan, ROC | TM-329 | heat to 120 °C for 10 min |
| Centrifuge | Digit System Laboratory System, New Taipei City, Taiwan, ROC | DSC302SD | centrifuge at 2025 x g |
| -80 °C Refrigerator | Panasonic | MDF-U3386S | Use to deep-freeze cryopreserve strain |
| Ultrasonic Homogenizer Sonicator Processor Cell Disruptor | Lenox | UPS-150 | frequency 20 KHz power 150 W |
| Incubator | Customer made | custom made | heat to 40 °C or cool to 18 °C with time cotrol |
| Reciprocal shaking baths | Kingtech Scientific Co., Ltd | WBS-L | |
| Digital Stirring Hot Plate | Corning | #6797-620D | use with PTFE magnetic stirring bar |
| Biosafety cabinet | Zong Yen co., LTD | ZYBH-420 | All bacteria related process are done here |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-6500F | SEM Images |
| 50 mL centrifudge tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 15 mL centrifudge tube | Falcon | 14-959-53A | |
| Laboratory bottle 100 mL | Duran | 21 801 24 5 | |
| Laboratory bottle 500 mL | Duran | 21 801 44 5 | |
| Stainless steel spatula | Chemglass | CG-1981-10 | |
| PTFE Disposable Stir Bars | Fisher | S68066 | |
| Plastic Petri Dishes | Fisher | S33580A | |
| Shewanella algae | Courtesy of author #3 | Courtesy of author #3 | |
| Pandoraea sp. | Courtesy of author #3 | Courtesy of author #3 |
References
- Chertok, B., Moffat, B. A., David, A. E., Yu, F., Bergemann, C., Ross, B. D., Yang, V. Iron Oxide Nanoparticles as a Drug Delivery Vehicle for MRI Monitored Magnetic Targeting of Brain Tumors. Biomaterials. 29 (4), 487 (2008).
- Mansur, C., Pope, M., Pascucci, M. R., Shivkumar, S. Zirconia-Calcium Phosphate Composites for Bone Replacement. Ceramics Int. 24, 11 (1998).
- Wang, Y., Arandiyan, H., Jason Scott, J., Bagheri, A., Dai, H., Amal, R. Recent advances in ordered meso/macroporousmetal oxides for heterogeneous catalysis: a review. J. Mater. Chem. A. 5, 8825 (2017).
- Kleshch, V. I., Rackauskas, S., Nasibulin, A. G., Kauppinen, E. I., Obraztsova, E. D., Obraztsov, A. N. Field Emission Properties of Metal Oxide Nanowires. J. of Nanoelectron. and Optoelectron. 7, 35 (2012).
- Ismagilov, R. R., Tuyakova, F. T., Kleshch, V. I., Obraztsova, E. A., Obraztsov, A. N. CVD nanographite films covered by ALD metal oxides: structural and field emission properties. Phys. Status Solidi C. 12 (7), 1022 (2015).
- Mor, G. K., Shankar, K., Paulose, M., Varghese, O. K., Grimes, C. A. Use of Highly-Ordered TiO2 Nanotube Arrays in Dye-Sensitized Solar Cells. NANO LETT. 6 (2), 215-218 (2006).
- Lee, J. -H. Gas sensors using hierarchical and hollow oxide nanostructures: Overview. Sensors and Actuators B. 140, 319 (2009).
- Poizot, P., Laruelle, S., Grugeon, S., Dupont, L., Tarascon Shankar, J. -M. Nano-sized transition-metal oxides as negative-electrode materials for lithium-ion batteries. Nature. 407, 496 (2000).
- Jang, D., Meza, L. R., Greer, F., Greer, J. R. Fabrication and deformation of three-dimensional hollow ceramic nanostructures. Nature Materials. 12, 893 (2013).
- Lazarus, A., Florijn, H. C. B., Reis, P. M. Geometry-Induced Rigidity in Nonspherical Pressurized Elastic Shells. PRL. 109, 144301 (2012).
- Vella, D., Ajdari, A., Vaziri, A., Boudaoud, A. Indentation of Ellipsoidal and Cylindrical Elastic Shells. PRL. 109, 144302 (2012).
- Xu, H., Wang, W. Template Synthesis of Multishelled Cu2O Hollow Spheres with a Single-Crystalline Shell Wall. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 1489 (2007).
- Li, B., Shao, X., Hao, Y., Zhao, Y. Ultrasonic-spray-assisted synthesis of metal oxide hollow/mesoporous microspheres for catalytic CO oxidations. RSC Adv. 5, 85640 (2015).
- Yu, J., Wang, G. Hydrothermal Synthesis and Photocatalytic Activity of Mesoporous Titania Hollow Microspheres. Powder Tech. 301, 96 (2016).
- Xu, G., Zhang, X., Cui, H., Zhang, Z., Ding, J., Wu, J. Facile synthesis of mesoporous SnO2 microspheres using bioactive yeast cell. Powder Tech. 301, 96 (2016).
- Nomura, T., Tanii, S., Ishikawa, M., Tokumoto, H., Konishi, Y. Synthesis of hollow zirconia particles using wet bacterial templates. Adv. Powder Tech. 24, 1013 (2013).
- Frankel, R. B., Bazylinski, D. A. Biologically Induced Mineralization by Bacteria. Rev. in Mineralogy and Geochem. 54 (1), 95 (2003).
- Bazylinski, D. A., Frankel, R. B. Biologically Controlled Mineralization in Prokaryotes. Rev. in Mineralogy and Geochem. 54 (1), 217 (2003).
- Lin, P. -H., Huang, Y. -T., Lin, F. -W. Sodium Tungstate and Sodium Molybdate Hollow Microspheres Biologically Controlled Mineralization in Prokaryotes. ECS J. of Solid State Sci. and Tech. 6 (3), N3113 (2017).
