Summary
Este trabajo presenta un protocolo para la fabricación de microcápsulas de molibdato de sodio tungstato y sodio a través de las bacterias y sus correspondientes nanopartículas.
Abstract
Se presenta un método, la excreción mineral bacteriana (BME), para sintetizar dos clases de microcápsulas, tungstato de sodio, molibdato de sodio y nanopartículas correspondientes de los dos óxidos metálicos, el primero siendo tan pequeño como 22 nm y los 15 últimos nm. Nos alimenta dos cepas de bacterias, algas de Shewanella y Pandoraea SP., con diferentes concentraciones de iones tungstato o de molibdato. Las concentraciones de tungstato y molibdato se ajustaron para microcápsulas de diferentes proporciones de longitud a diámetro. Encontramos que cuanto mayor sea la concentración más pequeña las nanopartículas fueron. Las nanopartículas llegaron con tres proporciones de longitud a diámetro: 10:1, 3:1 y 1:1, que fueron alcanzados por las bacterias de la alimentación respectivamente con una baja concentración media concentración y una alta concentración. Las imágenes de las microcápsulas hueco fueron tomadas a través de la microesfera escaneo de electrones (SEM). Fueron verificados sus estructuras cristalinas por difracción de rayos x (DRX), la estructura cristalina de microcápsulas de molibdato es Na2MoO4 y de microcápsulas de tungstato Na2WO4 Na2W2O7. Estas síntesis todos fueron logrados bajo condición ambiente cercana.
Introduction
Nanopartículas de óxido de metal son explotadas para drogas entrega1, construcción artificial huesos2, catálisis heterogénea3, emisión de campo4,5, células solares6, sensores de gas7, y las baterías de litio8. Para aplicaciones prácticas, la resistencia mecánica de nanocristales y su microestructura son cruciales. Entre las microestructuras, estructuras de cascarón vacío pueden utilizarse para crear materiales ligeros y mecánicamente robusto9. Entre estructuras de cascarón vacío, una forma esférica es conocida por ser más rígido que una forma elipsoidal; el último tiene una relación de longitud a diámetro más grande que el anterior10,11. Este trabajo describe un protocolo para la síntesis de microcápsulas esféricas por las bacterias con un método no tóxico bajo una condición ambiental, que contrasta con los métodos alternativos, incluyendo el método de síntesis de plantilla de12, síntesis asistida por aerosol ultrasónico método13 y método hidrotermal14. Algunos de los métodos alternativos requieren plantillas12, algunos una temperatura tan alta como 500 º C13y algunos14a una alta presión. En cuanto a la estructura resultante, el método de síntesis de plantilla utilizando la plantilla de la levadura produce una estructura core-shell15, en vez de uno con una sola pared, y la utilización de la plantilla de e. coli produce una estructura con relación longitud a diámetro de 1.7:0.8 y no es esférica. 16.
En este trabajo, hemos hecho microcápsulas de óxido de metal con una sola pared y de forma esférica bajo una condición ambiental por explotación de metabolismo bacteriano. En glucólisis bacteriana, un proceso químico que metaboliza las fuentes de carbono, como la glucosa y la lactosa, se consideran fuentes de carbono como el origen del poder reductor generado en el mismo. Manipulamos el metabolismo bacteriano mediante el ajuste de la concentración de fuentes de carbono para lograr fines deseados. Este método es favorable al medio ambiente, utilizando a agentes no tóxicos y consume mucho menos electricidad. Por último, este método permite la producción en masa de las microcápsulas simplemente incrementando el volumen de caldo.
Antes el método, ha habido otros dos métodos utilizando metabolismo bacteriano para minerales: inducida biológicamente mineralización (BIM)17 y controlados biológicamente mineralización (BCM)18. BIM ni BCM puede utilizarse para la fabricación de sodio tungstato y molibdato de microcápsulas de tungstato como nuestro proceso, que se señala como la excreción mineral bacteriana (BME)19. En este experimento, la forma de las microcápsulas puede controlarse para tener una relación longitud a diámetro de 10:1 a 1:1, y el tamaño de nanopartícula granos que forman las conchas se pueden ajustar de 15 nm a 110 nm.
Protocol
PRECAUCIÓN: Use guantes de látex, gafas protectoras y una capa del laboratorio para realizar el experimento. Siempre usando el gabinete de seguridad, encienda el ventilador gabinete y mantenga la puerta del gabinete cerrado de media.
1. preparación de perlas de vidrio
- 100 perlas de vidrio de 3 mm de diámetro en una botella de 100 mL laboratorio y luego la tapa firmemente.
- Autoclave el contenido a 120 ° C durante 10 minutos.
- Deje la botella a enfriar a temperatura ambiente y luego coloque en la bioseguridad gabinete.
2. preparación del caldo de lisogenia (LB)
- Disolver 8 g de polvo de caldo LB-Lennox en una botella de 500 mL laboratorio con 400 mL de agua.
- Mezclar el contenido con una barra de agitación magnética de PTFE por 20 min y luego la tapa firmemente.
- Autoclave el contenido a 120 ° C durante 10 minutos.
- Dejar la solución enfriar a temperatura ambiente y colóquelo en la bioseguridad gabinete.
- Mediante una pipeta, alícuota del caldo en ocho tubos de centrífuga de 15 mL en el gabinete de seguridad biológica (12,5 mL de cada una).
- Parte alícuota el caldo restante en botellas de 100 mL laboratorio tres en el gabinete de seguridad biológica (100 mL). Tapa firmemente las tres botellas. Mantenerlos en la bioseguridad gabinete.
3. cultura de la alga de Shewanella
- Utilizar la cepa criopreservada congelada.
- En el gabinete de bioseguridad, seleccionar 1 mL del material congelado del tubo congelado con una espátula de acero inoxidable y colóquelo en un tubo de centrífuga preparado en el paso 3.5.
- Incubar los cultivos durante 24 h en una incubadora de 37 ° C.
4. elaboración de platos de Petri LB-Lennox (caldo con Agar)
- Disolver dos tabletas de LB-Lennox (caldo con agar) en una botella de 100 mL laboratorio con 100 mL de agua.
- Remover el contenido con una barra de agitación magnética de PTFE por 20 min y luego la tapa firmemente.
- Autoclave el contenido a 120 ° C durante 10 minutos.
- En el gabinete de bioseguridad, alícuota de mano 100 mL de solución en 4 placas de Petri, asegurando a cada uno recibir ~ 25 mL. Dejar la solución enfriar a temperatura ambiente.
5. preparación de bacterias Monoclonal
- En el gabinete de bioseguridad, etiqueta las tres botellas de preparado en el paso 2.6, #1, #2 y #3, respectivamente.
- Pipetear 0,1 mL de la suspensión bacteriana resultante en el paso 3.3 en botella #1. Tapa la botella y gire a mano durante 1 minuto obtener una solución homogénea.
- Pipetear 0,1 mL del líquido bacteriano resultante en el paso 5.2 en botella #2. Tapa la botella y gire a mano durante 1 minuto obtener una solución homogénea.
- Pipetear 0,1 mL del líquido bacteriano resultante en el paso 5.3 en botella #3. Tapa la botella y agitar manualmente durante 1 minuto obtener una solución homogénea.
- Pipeta el líquido en botella #3 en las 4 cajas Petri preparada en el paso 4.4, usando un volumen de 0,02 mL.
- Poner los granos de cristal, preparados en el paso 1.3 en las 4 cajas Petri utilizado, 4 granos en cada plato.
- Cierre las tapas de las cajas Petri y sacudirlas a mano durante 1 minuto.
- Invierta las placas de Petri e incubar en una incubadora de 37 ° C durante 24 h.
6. multiplicación de las bacterias Monoclonal
- Buscar 7 tubos preparados en el paso 2.5.
- Seleccionar las bacterias monoclonales resultantes de las 4 cajas Petri preparada en el paso 5.8 con una espátula de acero inoxidable y los puso en 7 tubos por separado.
- Dejar los 7 tubos en una incubadora de 37 ° C durante 24 h.
- Seleccionar con la mayor dispersión de la luz mediante el método colorimétrico visual.
7. preparación de caldo LB-Lennox con glucosa y sal
- Poner 10 g de caldo LB-Lennox, 10 g de NaCl y 10 g de glucosa en un laboratorio de 500 mL botella. Añadir agua hasta que el volumen llegue a 450 mL.
- Mezclar el contenido con una barra de agitación magnética de PTFE por 20 min.
- Autoclave el contenido a 120 ° C durante 10 minutos.
8. preparación de tungstato de sodio
- Poner 16,5 g de tungstato de sodio Na2WO4.2 h2O en una botella de 100 mL laboratorio con una espátula de acero inoxidable. Añadir agua hasta el volumen 50 mL.
- Mezclar el contenido con una barra de agitación magnética de PTFE por 20 min.
- Autoclave el contenido a 120 ° C durante 10 minutos.
- En el gabinete de bioseguridad, haz filtrado mediante un filtro de fibra de vidrio vacío con poros de 1 μm.
9. preparación de LB con tungstato de sodio, glucosa y sal
- En el gabinete de bioseguridad, vierta el filtrado obtenido en paso 8.4 a mano en la solución con glucosa y sal preparado en el paso 7.3.
- En el gabinete de seguridad de la biotecnología, alícuota con una pipeta de la solución resultante de 500 mL en el paso 9.1 en tubos de centrífuga de 10 x 50 mL.
10. cultivo de bacterias
- En el gabinete de bioseguridad, recoger el líquido preparado en el paso 6.4 y alícuota con una pipeta en los 10 tubos de ensayo preparados en el paso 9.2, con cada tubo recibir 0,05 mL.
- Incubar los 10 tubos en una incubadora de 37 ° C durante 120 h.
11. cosecha de minerales BME
- Ultrasonicate cada uno de los tubos de 10 paso 9.2 a 20 KHz con 150 W durante 1 hora.
- Centrifugar los tubos a 2.025 x g durante 1 hora.
- Retire el líquido claro en los tubos con una pipeta, añadir agua y repita los pasos 11.1 y 11.2 una vez más.
- Retire el líquido claro en los tubos con una pipeta, añadir alcohol y luego los ultrasonicate a 20 KHz con 150 W durante 1 hora.
- Centrifugar los tubos a 2.025 x g durante 1 hora.
- Repita los pasos 11.4 y 11.5 una vez más
- Minerales BME de cosecha mediante la eliminación de líquido claro en los tubos con una pipeta; Luego, tapa los tubos inmediatamente sin ejecutar ningún proceso de secado.
12. oscilación de la temperatura con Pandoraea SP. y molibdato
- Cultura Pandoraea SP. de la misma manera como en los pasos 2, 3, 4, 5 y 6 para la alga de Shewanella. El resultado de este paso corresponde a la de paso 6.4.
- Hacer caldo LB con glucosa y sal de la misma manera como en los pasos 7, 8 y 9, excepto que se sustituye el 16,5 g de tungstato de sodio en el paso 7.1 con 12 g de molibdato de sodio, Na2MoO4 · 2H2O. El resultado de este paso corresponde a la de paso 9.2.
- En el gabinete de bioseguridad, fetch el líquido preparado en paso 12.1 y alícuotas con una pipeta en los 10 tubos preparados en el paso 12.2, con cada tubo de recepción 0.05 mL.
- Incubar los tubos de 10 paso 12.3 bajo temperaturas oscilantes de 120 h en una recíproca sacudida baño, oscilando la temperatura 5 veces entre 25 ° C y 37 ° C, con cada temperatura durante 12 h.
Representative Results
La figura 1 muestra genuino microcápsulas esféricas. Las dos cepas de la bacteria, alga de Shewanella y Pandoraea sp., originalmente tienen una relación longitud a diámetro de 3:1. Para el logro de la relación longitud a diámetro de 1:1, una alta concentración (> 100 mM) de oxianiones metal se requiere. Una concentración baja (< 5 mM) de oxianiones puede resultar en una longitud al cociente del diámetro de 10:1, como que en la figura 2, que puede resultar de la afluencia de los oxianiones, bloqueando la fisión binaria de las bacterias. Por último, para lograr una relación de longitud a diámetro de 3:1, como en la figura 3, se necesita una concentración media (~ 20 mM) de oxianiones. La formación de conchas esféricas, con una relación longitud a diámetro de 1:1, puede ser provocada por unidades bacterianas que se hacen reducir su área superficial para equilibrar la ingesta de oxianiones mientras difunde oxianiones a través de la membrana celular. Las tres figuras juntas indican que la relación longitud a diámetro puede ajustarse de 10:1 a 1:1 simplemente ajustando la concentración de oxianiones.
Figura 4 y figura 5 muestran la nanopartícula granos de molibdato de sodio en diferentes tamaños: el ser 15 nm y el más grande uno de 110 nm. Tenga en cuenta que en la figura 5, en las cáscaras no roto, partículas de 110 nm puede todavía ser encadenados entre sí, formando depósitos porosos. La fue ganada a través de la oscilación de la temperatura del caldo cultivo 5 veces entre 25 ° C y 37 ° C, con cada temperatura durante 12 h. Durante la oscilación de temperatura, granos de diferentes tamaños pueden no sólo producir sino también mantener la estructura micro-esférica, que significa que podemos hacer microcápsulas con tamaños de grano diferentes, de 15 nm a 110 nm, sólo mediante el control de la temperatura del caldo .
La figura 6 muestra la pared rota con granos más grandes, está al lado de la abertura de la pared. El grueso de pared es de aproximadamente 22 nm y el grano más grande es de 40-60 nm. La diferencia de tamaño puede deberse a diferentes procesos metabólicos, que aún no son identificados.
Figura 1: imagen de la SEM de cáscaras esféricas huecas con una relación longitud a diámetro de 1:1. Esta estructura fue hecha de tungstato de sodio excretado por Shewanella algas con glucosa como fuente de carbono. Reimpreso con permiso de ECS J. al estado sólido y la tecnología, 6(3), N3113 (2017). Copyright 2017, la sociedad electroquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imagen de la SEM de cáscaras de filamento largo hueco con una relación longitud a diámetro de 10:1. Esta estructura fue hecha de molibdato de sodio excretado por Pandoraea SP con glucosa como fuente de carbono. Reimpreso con permiso de ECS J. al estado sólido y la tecnología, 6(3), N3113 (2017). Copyright 2017, la sociedad electroquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: imagen de la SEM de rotas cáscaras huecos en forma con una relación longitud a diámetro de 3:1. Esta estructura fue hecha de tungstato de sodio excretado por Shewanella algas con glucosa como fuente de carbono. Reimpreso con permiso de ECS J. al estado sólido y la tecnología, 6(3), N3113 (2017). Copyright 2017, la sociedad electroquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: imagen de la SEM de cáscaras de molibdato de sodio destrozada con un tamaño de partícula del grano de 15 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: imagen de la SEM de cáscaras de molibdato de sodio roto y no roto con un tamaño de partícula del grano de 110 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: imagen de la SEM de cáscaras huecos rotos con una relación longitud a diámetro de 1:1. Esta estructura fue hecha de tungstato de sodio excretado por Shewanella algas con glucosa como fuente de carbono. Granulado con un tamaño de 40-60 nm colgar fuera de la concha junto a un gran agujero, mientras que la cáscara sí mismo está hecha de gránulos con un tamaño de unos 22 nm. Reimpreso con permiso de ECS J. al estado sólido y la tecnología, 6(3), N3113 (2017). Copyright 2017, la sociedad electroquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
En cuanto a la uno mismo-consistencia de los resultados experimentales, la preparación y la multiplicación de bacterias monoclonales son críticos. Este experimento, diferente de la plantilla síntesis experimentos15,16, empleados bioactivas bacterias Gram-negativas. Para obtener una sola pared, elegimos procariotas bacterias en lugar de bacterias eucariotas como la levadura15. Para conseguir una forma esférica con una relación longitud a diámetro de 1:1, en lugar de una mayor relación longitud a diámetro16, nos alimenta las bacterias con una mucho mayor concentración de oxianiones para manipularlos para reducir en forma esférica, fabricación de microcápsulas con una pared sola, redonda y fina (< 30 nm).
Desde BME se basa principalmente en ajustar la concentración de oxianiones para controlar el metabolismo de las bacterias, tiene dos limitaciones. En primer lugar, la concentración de oxianiones está limitada por la solubilidad, la concentración debe ser tan alta como sea posible. En segundo lugar, más bacteriana metabolismo se detendrá a una temperatura superior a 45 ° C o menos 5 ° C, respectivamente de la parte superior y límites inferiores de nuestro experimento.
A pesar de estas dos limitaciones, BME tiene un gran potencial para la fabricación de materiales de óxido de metal de interés práctico. Para fundamentar esta afirmación, vamos a probar este método para hacer microcápsulas de circonio y microcápsulas de hierro — el primero ser un buen candidato material para huesos artificiales y el segundo para el suministro de medicamentos.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
En este trabajo es apoyado por el Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán, República de China, otorga número más 105-2221-E-011-008, y también por Advanced-Connectek Inc., Taipei, Taiwán, ROC bajo contrato número RD Ref. Nº 6749 y Departamento Ref no. 011 a través de la Instituto de ingeniería electro-óptica, Universidad Nacional de Taiwán de la ciencia y tecnología.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB(Lennox)broth with agar tablets | Sigma-Aldrich | L7075 | 1 tablet for 50 mL broth with agar |
| LB (Lennox) broth | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | LB (Lennox) powder 1 kg |
| Dextrose anhydrous | Nihon Shiyaku Reagent | PL 78695 | glucose |
| Sodium Tungstate | Nihon Shiyaku Reagent | PL 76050 | Na2WO4 · 2H2O |
| Sodium Molybdate | Nihon Shiyaku Reagent | PL103564 | Na2MoO4 · 2H2O |
| Sodium Chloride | Nihon Shiyaku Reagent | PL 68131 | NaCl |
| Ethanol 99.5% | Acros organics | AC615090040 | CH3CH2OH |
| Water | Made in our university | de-ionlized water | |
| Autoclave | Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei City, Taiwan, ROC | TM-329 | heat to 120 °C for 10 min |
| Centrifuge | Digit System Laboratory System, New Taipei City, Taiwan, ROC | DSC302SD | centrifuge at 2025 x g |
| -80 °C Refrigerator | Panasonic | MDF-U3386S | Use to deep-freeze cryopreserve strain |
| Ultrasonic Homogenizer Sonicator Processor Cell Disruptor | Lenox | UPS-150 | frequency 20 KHz power 150 W |
| Incubator | Customer made | custom made | heat to 40 °C or cool to 18 °C with time cotrol |
| Reciprocal shaking baths | Kingtech Scientific Co., Ltd | WBS-L | |
| Digital Stirring Hot Plate | Corning | #6797-620D | use with PTFE magnetic stirring bar |
| Biosafety cabinet | Zong Yen co., LTD | ZYBH-420 | All bacteria related process are done here |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM-6500F | SEM Images |
| 50 mL centrifudge tube | Falcon | 14-432-22 | |
| 15 mL centrifudge tube | Falcon | 14-959-53A | |
| Laboratory bottle 100 mL | Duran | 21 801 24 5 | |
| Laboratory bottle 500 mL | Duran | 21 801 44 5 | |
| Stainless steel spatula | Chemglass | CG-1981-10 | |
| PTFE Disposable Stir Bars | Fisher | S68066 | |
| Plastic Petri Dishes | Fisher | S33580A | |
| Shewanella algae | Courtesy of author #3 | Courtesy of author #3 | |
| Pandoraea sp. | Courtesy of author #3 | Courtesy of author #3 |
References
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