Vi beskriver en protokol for prækliniske i vivo sporing af kræft metastaser. Det er baseret på en radionukleid-fluorescens reporter kombinerer natrium Iodid symporter, opdaget af non-invasiv [18F] tetrafluoroborate-PET, og en fluorescerende proteiner for strømlinet ex vivo bekræftelse. Metoden er anvendelig for prækliniske i vivo celle tracking uden for tumor biology.
Metastaser er ansvarlig for de fleste kræftdødsfald. Trods omfattende forskning, den mekanistiske forståelse af de komplekse processer for metastaser er stadig ufuldstændig. In vivo modeller er altafgørende for metastaser forskning, men kræver raffinement. Sporing spontan metastase af non-invasiv i vivo billeddannelse er nu muligt, men er fortsat udfordrende, da det kræver lang tid observation og høj følsomhed. Vi beskriver en langsgående kombineret radionuklid og fluorescens hele kroppen i vivo billeddannelse tilgang til sporing af tumor progression og spontane metastaser. Denne reporter gen metode beskæftiger natrium Iodid symporter (NIS) smeltet til en fluorescerende proteiner (FP). Kræftceller er manipuleret til stabilt udtrykkelige NIS-FP efterfulgt af valg baseret på fluorescens-aktiveret celle sortering. Tilsvarende tumor modeller er etableret i mus. NIS-FP udtrykker kræftceller er spores ikke-invasivt i vivo på niveauet hele kroppen af positron emissions tomografi (PET) ved hjælp af NIS radiotracer [18F] BF4–. PET er i øjeblikket den mest følsomme i vivo imaging-teknologi tilgængelig på denne skala og giver mulighed for pålidelige og absolut kvantificering. Nuværende metoder enten er afhængige af store kohorter af dyr, der er aflivet for metastaser vurdering på varierende tidspunkter, eller stole på knapt målbare 2D billeddannelse. Fordelene ved den beskrevne metode er: (i) meget følsomme ikke-invasive i vivo 3D PET imaging og kvantificering, (ii) automatiseret PET tracer produktionen, (iii) en betydelig reduktion i kræves animalske numre på grund af gentagne billeddannelse muligheder, (iv). erhvervelse af parrede data fra efterfølgende imaging sessioner giver bedre statistiske data, og (v) den iboende mulighed for ex vivo bekræftelse af kræftceller i væv af Fluorescens mikroskopi eller flowcytometri. I denne protokol beskrive vi alle foranstaltninger for rutinemæssig NIS-FP-ydes non-invasiv i vivo kræft celle sporing ved hjælp af PET/CT og ex vivo bekræftelse af i vivo resultater. Denne protokol har applikationer uden for kræftforskning, når i vivo lokalisering, ekspansion og mangeårige overvågning af en celle population er af interesse.
Metastatisk sygdom er årsag til de fleste cancer-relaterede dødsfald 1. Trods omfattende forskning i metastatisk processer er pålidelig overvågning af kræft metastaser i dyremodel systemer vanskeligt at opnå. De seneste fremskridt i hele kroppen billeddannelsesteknologier og multimodale imaging tilgange har aktiveret non-invasiv i vivo celle tracking2,3,4,5. Sidstnævnte kan bruges som et redskab til at overvåge tilstedeværelsen, fordeling, antal og levedygtighed af celler, ikke-invasivt og gentagne gange i et levende dyr eller et menneske.
Formålet med metoden beskrevet her er på langs og ikke-invasivt spore kræftceller i 3D i levende gnavere tumor modeller. Brug denne metode, vil forskere være i stand til nøjagtigt kvantificere tumor progression herunder metastatisk spredning i 3D. Sammenlignet med traditionelle ikke-imaging-baserede teknikker, giver denne metode erhvervelse af kvantitative data med stort set reduceret animalske numre. En anden funktion i denne metode er, at det giver mulighed for korrelation af i vivo billeddannelse med strømlinede downstream ex vivo analyse af de registrerede celler i høstede væv af histologi eller flowcytometri3,6.
Begrundelsen for udviklingen af denne metode var at give en in vivo -værktøj til overvågning og kvantificering af den hele metastatisk proces i gnavere tumor modeller. Vigtigere er, var det designet til at minimere brug af dyr samtidig reducere Inter animalske variabilitet. Langsgående non-invasiv hele kroppen imaging er glimrende egnet til at informere på metastatisk udvækst, for hvilke i sig selv er det svært at forudsige nøjagtigt tidspunkt og sted for dens forekomst. Hele kroppen 3D imaging har derfor været i centrum for metodeudvikling. For at lukke skala kløften mellem hele kroppen i vivo vedtaget billeddannelse og potentiale downstream ex vivo histologiske bekræftelse, en multi-skala imaging tilgang baseret på en dual-mode radionukleid-fluorescens reporter blev3, 6.
Positronemissionstomografi (PET) er den mest følsomme 3D hele kroppen imaging-teknologi i øjeblikket tilgængelige tilbyder fremragende dybde penetration og absolut kvantificering7 med en opløsning på < 1 mm8,9. I øjeblikket, kan prækliniske celle sporing på hele kroppen niveau af radionuklid imaging pålideligt registrere celler ved tætheder af ~ 1.000 celler pr. volumen af en million celler3,6 med beslutninger i regionen sub millimeter. I modsætning til intravital mikroskopi, det kan ikke afsløre enkelt sprede kræftceller, men det kræver ikke kirurgiske procedurer (fx vindue kamre), er ikke begrænset til et mindre synsfelt, og ikke af lav væv penetration og scatter. Bioluminescens imaging er giver et billigt alternativ, men forbundet med scatter og lysabsorption spørgsmål samt ringe dybde penetration, og derfor alvorligt begrænset i kvantificering2. Fluorescens hele kroppen imaging har været anvendt til erhvervelse af 3D-billeder, men det er langt mindre følsomme i forhold til bioluminescens eller radionukleid teknologier2. Ikke desto mindre tilbyder fluorescens mulighed for at udføre ex vivo downstream væv analyse ved flowcytometri eller mikroskopi. Sidstnævnte lukker skala-kløften mellem makroskopisk hele kroppen imaging (mm opløsning) og fluorescens mikroskopiske væv analyse (µm opløsning)3. Derfor, radionukleid og fluorescens modaliteter supplerer hinanden, lige fra hele kroppen niveau (sub-) cellulære-skala.
Reporter gen imaging er ideelt egnet til langvarig celle sporing som krævet i metastase forskning. I dette program det er overlegen i forhold til direkte celle mærkning som det er (i) ikke er berørt af etiketten fortynding og dermed ikke begrænset i at spore tid, og (ii) bedre afspejler levende celle numre. Derfor er hele kroppen celle tracking især nyttigt for programmer som spores celler formere eller udvide i vivo, for eksempel i kræft forskning3,6, til påvisning af teratom dannelse i stilken celle forskning, eller til kvantificering af immun celle ekspansion5.
Forskellige radionukleid-baserede reporter gener er tilgængelig2. Disse omfatter enzymer såsom herpes simplex virus HSV11 thymidine kinase (HSV1 –tk), transportører som natrium Iodid symporter (NIS) eller noradrenalin transporter (netto), samt celle overfladen receptorer som dopamin D2-receptoren ( D2R). NIS er et glykosyleret trans-membran protein, der aktivt medierer Iodid optagelsen, for eksempel i follikulære celler i skjoldbruskkirtlen til efterfølgende syntese af thyreoideahormoner10. Denne proces er drevet af symport af Na+ og afhængig af den cellulære natrium graduering, som vedligeholdes af Na+/K+-ATPase11. Derfor, NIS bedre afspejler levende celle numre end andre journalister som Iodid/radiotracer udbredelse er knyttet til en aktiv Na+/K+ gradient snarere end den blotte tilstedeværelse af transportøren. Traditionelt har radioiodide har været brugt til NIS billeddannelse. For celle tracking, er alternative NIS radiotracers, der ikke er metabolisk indesluttet i skjoldbruskkirtlen blevet rapporteret at være overlegen6. Dette nyligt udviklede PET radiotracer [18F] tetrafluoroborate ([18F] BF4–)12,13 viser overlegen farmakokinetik i forhold til radioiodide6 samtidig være tilgængelige på høje specifikke aktiviteter14 uden behov for komplekse radiokemi faciliteter. [18F] BF4– kan syntetiseres via to forskellige måder. Den første metode er baseret på isotop udveksling af ikke-radioaktive 19F i BF4– med radioaktivt 18F12. Den anden metode er gennem tilsætning af 18F til ikke-radioaktive boron trifluoride14. Sidstnævnte metode blev rapporteret til at give højere enkeltforanstaltninger14 og er den foretrukne metode for prækliniske billeddannelse.
NIS er stærkt udtrykt i skjoldbruskkirtlen væv. Det kommer også til udtryk i mælkekirtlerne spyt, lachrymal og ammende samt maven, men på et lavere niveau i forhold til skjoldbruskkirtlen10. Derfor, fremragende kontrast imaging i andre regioner, kroppen kan opnås ved hjælp af NIS. Det er også yderst homologe mellem menneskelige, rotte og mus10. Desuden er der ingen rapporter om toksicitet ved ektopisk NIS udtryk i ikke-thyroidal celler. Vigtigere er, har NIS heller ikke været forbundet med værten immunrespons, hverken hos mennesker eller i gnavere. NIS har været brugt som en reporter gen for at måle promotor aktivitet15,16,17 og gen expression18,19,20,21,22 ,23 i flere forskellige sammenhænge. Det har også været brugt til ikke-invasive billeddannelse gen terapi vektorer24,25, og til at spore celler i hjerte4, hæmatopoietisk26, inflammation5og neurale studier27. For nylig, NIS er også blevet brugt som en reporter gen for at spore kræft metastaser i vivo3,6.
Sammenfattende er de vigtigste fordele ved denne metode over tidligere teknikker: (i) meget følsomme ikke-invasiv 3D i vivo lokalisering og kvantificering af metastatisk sprede, (ii) automatiseret produktion af [18F] BF4– på stor kindtand aktiviteter, (iii) en betydelig reduktion i kræves dyr gennem langsgående imaging, (iv) erhvervelse af parrede data fra efterfølgende imaging sessioner resulterer i forbedrede statistiske data, som igen yderligere reducerer brug af dyr, og (v) den iboende mulighed for ex vivo bekræftelse af kræftceller i væv ved flowcytometri eller Fluorescens mikroskopi.
Det første skridt til at gengive kræft celler kan spores i vivo ved denne metode kræver engineering dem for at udtrykke NIS-FP fusion reporter. Valget af de fluorescerende proteiner i fusion reporter er kritisk, da oligomerizing fluorescerende proteiner kan føre til kunstige reporter klyngedannelse, dermed negativt påvirker dens funktion. Vi har haft succes med dokumenteret monomere fluorescerende proteiner som mEGFP (med monomerizing mutationen A206K36,37), mTagRFP eller mCherry. NIS kan enten være af menneskelige eller museoprindelse (hNIS eller msNIS) afhængigt af formålet med forsøget, og kræft model. Transduktion effektivitet generelt varierer mellem forskellige kræft cellelinjer. Imidlertid er genereret kræft cellelinjer efterfølgende renset af FACS i denne protokol, hvilket reducerer behovet for at optimere transduktion betingelser. Transduktion med høj mangfoldighed af infektion er ikke altid tilrådeligt, da flere konstruere integration i genomet kan forventes at resultere i højere konstruere udtryk, men også i flere uønskede/ureguleret genom ændring. Det er derfor vigtigt at lade polyklonale transduced celler vokse til stabiliteten i udtrykket (overvåges ved flowcytometri) og undgå sortering de lyseste kloner kun af FACS. Det også gør funktionelle validering af ikke-reporter funktioner afgørende før disse celler skal bruges til i vivo eksperimenter. En nyligt udviklede alternativ til virale gen levering er gen redigering teknologi38, som tilbyder mere specifik kontrol over viral integration websteder. Udtrykket analyse ved flowcytometri og immunoblotting er vigtige. Flowcytometri giver mulighed for erhvervelse af befolkningen-baserede enkelt celledata, for eksempel at undersøge, om der er nogen drift i reporter udtryk niveauer over tid. Den bygger på FP gruppe kun, medmindre celler også farves med et antistof rettet mod overfladen eller samlede NIS. Flowcytometri informerer ikke om fusion reporter integritet. Derimod rapporter immunoblotting om integriteten af fusion reporter. Molekylevægt af NIS og FP skal føjes til at bestemme den forventede molekylvægt af den valgte NIS-FP. Konfokal Fluorescens mikroskopi demonstreret fusion reporter colocalization med plasma-membran markør hvedekim agglutinin i alle nyligt lavet cellelinjer. Dette var den forventede cellular placering for de fleste af protein og angivet en grønt lys milepæl for efterfølgende funktionelle validering. Hvis minimal/nej NIS-FP blev fundet på plasma membran (f.eks. kun i intern cellulære rum), dette ville betyde en celle biologiske problem med fusion reporter i denne cellelinje, eller en potentiel mutation af fusion reporter påvirker dens intracellulære handel. Det er bemærkelsesværdigt, at vi ikke har observeret en sådan i nogen af kræftceller vi testet indtil videre, som omfattede: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (menneskelige melanom); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (human brystkræft); NCI-H1975 (human lungekræft); SK-Hep1 (human leverkræft); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (murine Inflammatorisk brystkræft); B16F0, B16F3, B16F10 (murine melanom); MTLn3 (rotte bryst adenocarcinom).
NIS funktion skal måles ved hjælp af optagelsen assays med radioaktivt NIS substrater. På grund af den SPECT radiotracer 99 mTcO4– at være generator-produceret og derfor bredt tilgængelige på hospitaler uden behov for nogen radiotracer syntese samt at have en mere bekvem længere halveringstid (6.01 h for 99 m TC i forhold til 110 min. 18F), vi brugte denne NIS substrat for rutinemæssig funktionelle validering af nye NIS-FP udtrykker cellelinjer. Pre blokering af NIS-udtrykker celler med NIS Co substrat natrium perchlorat resulterede i den forventede begrænsning/afskaffelse af radiotracer udbredelse, hvilket viser specificitet for radiotracer optagelse. Denne NIS specificitet test er en kritisk valideringstrinet. Hvis en NIS specificitet eksperiment ikke ville resultere i reducerede radiotracer optagelse svarende til de respektive forældre celler, der er opstået en teknisk fejl under eksperimentet, eller radiotracer udbredelse var ikke på grund af NIS. Det er også muligt at natrium perchlorat pre blokering reducerer radiotracer optagelse i en parental cellelinie; Dette ville identificere cellelinjer med endogene funktionelle NIS udtryk (fx stimuleret skjoldbruskkirtlen celler6).
En afgørende fordel ved denne billeddannelse protokol er at oplysninger er indsamlet i 3D og over tid. Dette giver mulighed for sammenligning af billeder fra de samme dyr over tid, hvilket giver parrede data og dermed overvinde de problemer forårsaget af indbyrdes animalske variabilitet. Dette er i kontrast med de fleste ikke-imaging relaterede metastase vurderingsmetoder, der er baseret på at ofre forskellige dyr på forskellige tidspunkter. Figur 3B er det tydeligt, hvordan metastatisk spredning og udvækst skred over tid i et bestemt dyr. Signaler registreres af PET/CT billeddannelse er fundamentalt forårsaget af NIS udtryk. Dette omfatter alle signaler fra NIS-udtrykker eksogent kræftceller og alle organer endogent udtrykker NIS. Typiske endogene NIS signaler er fundet i skjoldbruskkirtlen og spytkirtlerne, mavesækken, og på et lavt niveau i nogle dele af brystkirtler og lachrymal kirtler. Ud over endogene NIS udtryk, er NIS radiotracer [18F] BF4– også udskilles via nyrerne, dermed forklarer radiotracer optagelse i urin-fyldt blærer. Nyre optagelse er ikke længere kan påvises for den billeddiagnostiske tidspunkt anbefalet i denne protokol (45 min post radiotracer injektion6). Hvis signalerne fra urin-fyldt blærer bør føre til signal-til-baggrund spørgsmål, kan blæren tømmes mekanisk under anæstesi før billeddannelse. Vigtigere, kan de endogene signaler variere mellem dyr stammer. Det er også bemærkelsesværdigt at endogene NIS udtryk i mælkekirtlerne kan være højere under ammende betingelser10. I sagen præsenteres og i tilfælde af disse metastatisk cellelinjer held karakteriseret før (jf. ovenstående liste), fandt vi ikke endogene NIS udtryk væsentligt forstyrre metastase påvisning. Det er bemærkelsesværdigt, at [18F] BF4– er stadig mere tilgængelige for optagelse i kræft væv i forhold til Iodid, fordi Iodid metaboliseres i thyreoideahormoner6. Dette fænomen kan også bidrage til større mængder af radioiodide i blodet i forhold til [18F] BF4– 6. Til forskellige applikationer (kræftcelle sporing i andre kræftformer eller ikke-kræft celle registreringsprogrammer), dette kan være meget forskellig, og det anbefales derfor at vurdere, om endogene NIS udtryk er tilbøjelige til at give signal til baggrund problemer gennem foreløbige forsøg. Et vigtigt aspekt i prækliniske imaging er de molar aktivitet af radiotracer. Metoden beskrevet her bruger ~1.5 GBq 18F– som udgangspunkt materielle14 og har vist sig at producere kindtand aktiviteter betydeligt over de tidligere rapporterede substitution metode12. [18F] BF4– produceret på kindtand aktiviteter ≤1 GBq/µmol12 kan føre til nedsat optagelse i NIS-udtrykker væv. Dette er af særlig betydning, når den injiceres mængden af radioaktivitet pr. kilogram er høj, dvs når små dyr som mus er afbildet39; Det er mindre vigtigt i den menneskelige indstilling40. Stor kindtand aktiviteter er derfor bydende nødvendigt for høj kvalitet prækliniske PET billeddannelse. Kindtand aktiviteter fremstillet ved den boron trifluoride tilsætning metode14, som er vist i sin automatiseret form i denne protokol, overvinde dette problem. Desuden er det bemærkelsesværdigt, at den præsenterede protokol for [18F] BF4– syntese ikke er kompatibel med god fremstillingspraksis (GMP) og derfor uegnet til brug i humane kliniske forsøg i denne form. Et GMP-protokollen (via metoden 18F substitution til radiolabel BF4–) er tilgængelig andetsteds40.
PET/CT billeddannelse giver mulighed for visualisering af radiotracer udbredelse, som er vejledende for NIS-medieret radiotracer optagelse stammer fra NIS-FP udtrykker kræftceller. Endnu vigtigere, kan de tilknyttede PET signaler kvantificeres. Det er nødvendigt at anvende pålidelige tærskel procedurer for at sikre en ensartet og objektiv differentiering af relevante signaler fra enhver potentiel baggrund. Da baggrunden varierer i forskellige steder i vivo, er det vigtigt at overveje lokale/regionale tærskel og segmentering. En sådan metode blev udviklet af og opkaldt efter Otsu34, og dens 3D gennemførelse er ansat for 3D-gengivelse af den primære tumor og metastaser i denne protokol. Generelt svarer billede set observatøren visuelt bedst til kvantificerede % injiceres dosis (% ID) værdier. Som for image-baserede kvantificering er det også vigtigt at normalisere de målte radioaktivitet værdier af de forskellige væv til deres diskenheder. Der er to overvejende brugt måder at udtrykke normaliserede resultater, a % ID pr. volumen (f.eks. %ID/mL), og (ii) standard optagelse værdi (SUV35). De adskiller sig ved at %ID/mL tager hensyn til de enkelte bind kun, mens SUV er en foranstaltning, der er i forhold til den gennemsnitlige radioaktivitet på tværs af hele dyret. Det er også vigtigt at bemærke, at NIS imaging gengiver live tumor volumen (LTV) tilgængeligt, fordi død/døende celler ikke syntetisere ATP kan ikke længere importere radiotracer10. Dette forklarer det store lav-signal område inden for den primære tumor (“doughnut formet” tumor) angiver områder af tumor celle død/nekrose. Vigtigere, var LTV en langt mere pålidelig måling af tumor byrde i forhold til den rå tumor volumen tilgængeligt med skydelære målinger (som tager ikke hensyn levedygtighed og vurderer kun overfladisk tumor regioner).
En stor fordel ved denne dual-mode tracking strategi er indlysende, når hovedkød væv efter dyr nedslagtning. Styret af i vivo billeder og bistået af fluorescerende kræftceller under animalske dissektion, kan små og dybtliggende organer/metastaser også være pålideligt høstet. Frossen væv bevarelse/skæring metode giver mulighed for direkte fluorescens billeddannelse af normal god landbrugspraksis uden behov for farvning med et antistof, anti-normal god landbrugspraksis, men på bekostning af reduceret strukturelt væv bevarelse sammenlignet med formalin-fast paraffin-embedded metode (FFPE). Sidstnævnte kræver kritisk også anti-FP farvning, fordi metoden FFPE er uforenelig med intakt bevarelse af fluorescerende proteiner (på grund af fiksering/dehydrering/rehydrering). Mens fluorescens signal er vejledende af tumor celle tilstedeværelse, er det vigtigt at sikre denne klassificering er bekræftet af ex vivo radioaktivitet målinger af de høstede væv (‘biodistribution’). Ex vivo radioaktivitet målinger er mere følsomme end visuel genkendelse af fluorescens, dermed kan tillade identifikation af kræft celle-afhængige signaler, der ellers ville forblive uopdaget. I tilfælde af en terminal imaging session, er afgørende for præcist Bemærk de injicerede radiotracer beløb samt gange af radiotracer radioaktivitet målinger, animalsk injektion, animal nedslagtning og kalibreret scintillation counter målinger af høstede væv. Det er afgørende at sikre korrektion for radiotracer forfald og dermed muliggøre pålidelige biodistribution analyse.
PET/CT imaging giver gentagne non-invasiv 3D kvantificering af tumor progression herunder vurdering af metastatisk spredning på en hel-krops niveau. Denne funktion er en betydelig fordel i forhold til konventionelle metoder, som ofte er afhænger af store kohorter af dyr, der er aflivet for vurdering af tumor progression på varierende tidspunkter. Fordelene ved denne imaging-baseret tilgang er: (i) meget følsomme ikke-invasiv 3D i vivo kvantificering, (ii) en betydelig reduktion i animalsk numre på grund af muligheden for Gentag imaging, (iii) erhvervelse af langsgående parrede data fra efterfølgende imaging sessioner forbedre statistik ved at udelukke Inter animalske variabilitet, som igen yderligere reducerer animalske numre, (iv) automatiseret produktion af [18F] BF4– på høje specifikke aktiviteter, og (v) den iboende mulighed for ex vivo bekræftelse i væv ved metoder, Fluorescens mikroskopi eller flowcytometri.
In vivo celle tracking er et voksende område. Det har fået næring af de seneste fremskridt i imaging-teknologi, hvilket resulterede i forbedret opløsning, detektionsgrænser og multiplex kapacitet (via multimodale imaging). I denne protokol anvender vi dette begreb til at spore tumor progression herunder spontan kræft celle metastase i 3D ved at gentage billeddannelse. Applikationerne omfatter undersøgelser med henblik på optrevling mekanismerne for spontan kræft celle metastaser. For eksempel kunne spores tumorceller bruges til at studere virkningerne af forskellige immun celle komponenter (som dag/funktionelle i animalske stammer af forskellige niveauer af immunocompromisation) på metastatisk processen. Ligeledes, effekten af enkelte gener, enten i den animalske stamme eller cancer cellelinie, kunne undersøges. Derudover kunne præsenteres protokollen bruges til at vurdere/validere effekten af specifikke stoffer eller terapeutiske begreber på tumor progression. Vigtigst, denne reporter gen: radiotracer par for PET imaging (NIS: [18F] BF4–) kan også bruges til forskellige celle registreringsprogrammer. Eksempelvis flere celle behandlinger i øjeblikket nye så lovende terapeutiske tilgange. Dette omfatter cellulære therapeutics for kræft behandling41 , men også i transplantation42 og regenerativ medicin43,44 indstillinger. Hele kroppen i vivo celle tracking bliver stadig vigtigere for udviklingen og kliniske oversættelse af cellulære therapeutics, for eksempel, for at vurdere sikkerhed og for overvågning af terapi.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen blev støttet af King’s College London og UCL omfattende Cancer Imaging Center, finansieret af Cancer Research UK og EPSRC i forening med MRC og DoH (England); det nationale Institut for sundhed Research (NIHR) Biomedical Research Centre baseret på fyr og St Thomas’ NHS Foundation Trust og King’s College London; Centre of Excellence i medicinsk Engineering finansieres af Wellcome Trust og EPSRC grant nummer WT 088641/Z/09/Z; en Cancer Research UK tværfaglige projekt Award GOF og PJB og en konge sundhed partnere tilskud til GOF. NanoPET/CT og nanoSPECT/CT-scannere blev købt og vedligeholdes af en udstyr tilskud fra the Wellcome Trust. De fremsatte synspunkter er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis NHS, NIHR eller DoH.
Step 1) Engineering and characterization of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP. | |||
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole | Thermo Scientific | H3570 | Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water. |
4T1 murine breast cancer cell line | ATCC | CRl-2539 | for details see ATCC website |
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter | Roche Diagnostics GmbH | 5651697001 | CASY Model TT Cell Counter and Analyzer |
CASYclean Cleaning Reagent | Sedna Scientific | 2501036 | |
CASYton Isotonic Diluent | Sedna Scientific | 2501037 | |
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis | |
Cover slips No. 1.5 thickness | VWR International | 631-0150 | |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
DMEM | Sigma | D5546 | Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells. |
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III | BD Biosciences | Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) – cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead. |
L-glutamine | Sigma | G7513 | Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered |
Linear polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line. |
MDA-MB-231 human breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | for details see ATCC website |
Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
pLNT SFFV NIS-mEGFP | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pLNT SFFV NIS-mCherry | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pMD2.G | Addgene | #12259 | plasmids encoding for the VSV-G envelope |
pRRE | Addgene | #12251 | packaging plasmid |
pRSV-Rev | Addgene | #12253 | packaging plasmid |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P43330 | Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride |
Poly(vinyl alcohol – vinyl acetate) | Polysciences | 17951 | Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5 |
Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833 | From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water |
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge | Hettich Lab Technology | ||
RPMI 1640 | Sigma | R0883 | Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells. |
SFCA Syringe filter 0.45 μm | Corning | ||
Syringes 10 mL | BD Emerald | Disposable non-sterile syringes | |
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL | Life Technologies | Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera | |
Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma | 59418C | (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red |
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate | Life Technologies | W21404 | Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence |
Step 2) Establishment of in vivo tumor models. | |||
Digital caliper | World Precision Instruments | 501601 | |
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm | |
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance | |||
Step 3) Production of [18F]BF4– using an automated radiotracer synthesis platform. | |||
15-crown-5 | Sigma-Aldrich | 188832 | CAS 33100-27-5 |
Acetonitrile (anhydrous) | Acros Organics | 326811000 | |
Boron trifluoride diethyl etherate | Sigma-Aldrich | 216607 | BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7 |
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab | GE Healthcare | ||
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes | GE Healthcare | FASTlab Developer pack | |
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets | Macherey-Nagel | 802021 | RadioTLC plates, 40×80 mm |
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light | Waters | WAT023525 | Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL) |
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light | Waters | WAT023561 | Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL) |
Water for injection USP | GE Healthcare | ||
Nitrogen filter | Millipore | SE2M049I05 | Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm |
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT. | |||
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Rodent anesthesia induction chamber | Vet-Tech | AN010R | With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m) |
Rodent anesthesia system | Vet-Tech | AN001B | Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer |
Sterile physiological saline | Thermo Scientific Oxoid | BO0334B | |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer | |
Veterinary Scavenger | Vet-Tech | AN200 | VetScav filter weighing mechanism – 240 V with automatic temperature compensation and LED system |
5) In vivo data analysis. | |||
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
VivoQuant Software | Invicro LLC., Boston, USA | ||
6) Ex vivo analyses | |||
2-Methylbutane | Sigma | 59070-1L-D | Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 85040C | |
Cover slips 22×50 mm | VWR International | SMITMCQ211022X50 | |
Cryostat, e.g. Cryostat MNT | SLEE Medical | two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate | |
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson/Stratech | 111-175-144 | Used at 1:500 (2 µg/mL) |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
Microtome blades, e.g. Feather S35 | CellPath | ||
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5 | |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | |
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters |
O.C.T. compound | VWR international | 361603E | |
Wax pen, e.g. PAP-PEN | Dako UK Ltd | Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes | |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence |
Microscope slides, e.g. Superfrost slides | VWR, Lutterworth, UK | ||
Tris-buffered saline (TBS) | available from various suppliers. | Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4 |