हम vivo में कैंसर मेटास्टेसिस की ट्रैकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । यह सोडियम आयोडाइड symporter के संयोजन एक रेडियोन्यूक्लाइड-प्रतिदीप्ति संवाददाता पर आधारित है, गैर इनवेसिव द्वारा पता लगाया [18F] tetrafluoroborate-पीईटी, और सुव्यवस्थित पूर्व vivo पुष्टि के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन । विधि ट्यूमर जीव विज्ञान से परे वीवो सेल ट्रैकिंग में नैदानिक के लिए लागू है ।
मेटास्टेसिस सबसे अधिक कैंसर मौतों के लिए जिंमेदार है । व्यापक अनुसंधान के बावजूद, जटिल प्रक्रियाओं शासी मेटास्टेसिस की यंत्रवत समझ अधूरी रहती है । vivo में मॉडल मेटास्टेसिस अनुसंधान के लिए सर्वोपरि हैं, लेकिन शोधन की आवश्यकता होती है । गैर द्वारा सहज मेटास्टेसिस ट्रैकिंग विवो में इनवेसिव अब संभव है, लेकिन यह लंबे समय अवलोकन और उच्च संवेदनशीलता की आवश्यकता के रूप में चुनौतीपूर्ण रहता है. हम एक अनुदैर्ध्य संयुक्त रेडियोन्यूक्लाइड और ट्यूमर प्रगति और सहज मेटास्टेसिस ट्रैकिंग के लिए vivo इमेजिंग दृष्टिकोण में प्रतिदीप्ति पूरे शरीर का वर्णन. इस रिपोर्टर जीन पद्धति सोडियम आयोडाइड symporter (NIS) एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FP) से जुड़े कार्यरत हैं । कैंसर की कोशिकाओं को छुरा प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छंटाई के आधार पर चयन के बाद NIS-FP व्यक्त करने के लिए इंजीनियर हैं । इसी ट्यूमर मॉडल चूहों में स्थापित कर रहे हैं. nis-FP एक्सप्रेस कैंसर कोशिकाओं पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) द्वारा पूरे शरीर के स्तर पर vivo में गैर इनवेसिव ट्रैक कर रहे हैं NIS रेडियो ट्रेसर का उपयोग [18 F] BF 4-. पीईटी वर्तमान में इस पैमाने पर उपलब्ध vivo इमेजिंग प्रौद्योगिकी में सबसे संवेदनशील है और विश्वसनीय और निरपेक्ष ठहराव सक्षम बनाता है । वर्तमान तरीके या तो पशुओं के बड़े साथियों कि समय अंक बदलती है, या बमुश्किल quantifiable 2d इमेजिंग पर भरोसा मेटास्टेसिस आकलन के लिए euthanized रहे है पर भरोसा करते हैं । वर्णित विधि के लाभ हैं: (i) अति संवेदनशील गैर vivo में इनवेसिव 3 डी पीईटी इमेजिंग और ठहराव, (ii) स्वचालित पीईटी अनुरेखक उत्पादन, (iii) दोहराने इमेजिंग विकल्प के कारण आवश्यक पशु संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी, (iv) क्रमिक इमेजिंग सत्र से युग्मित डेटा के अधिग्रहण बेहतर सांख्यिकीय डेटा प्रदान करने, और (v) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या cytometry द्वारा ऊतकों में कैंसर की कोशिकाओं के पूर्व vivo पुष्टि के लिए आंतरिक विकल्प. इस प्रोटोकॉल में, हम सभी चरणों का वर्णन नियमित NIS-FP-में गैर इनवेसिव vivo कैंसर सेल ट्रैकिंग पीईटी का उपयोग करते हुए/ vivo परिणामों में की और सीटी की पुष्टि । इस प्रोटोकॉल कैंसर अनुसंधान से परे आवेदन किया है जब भी vivo में स्थानीयकरण, विस्तार और लंबे समय से एक सेल की आबादी की निगरानी ब्याज की है ।
मेटास्टेटिक रोग सबसे अधिक कैंसर से संबंधित मौतों के लिए कारण है 1। मेटास्टेटिक प्रक्रियाओं में व्यापक अनुसंधान के बावजूद, पशु मॉडल प्रणालियों में कैंसर मेटास्टेसिस की विश्वसनीय निगरानी को प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । पूरे शरीर इमेजिंग प्रौद्योगिकियों और बहु-मोडल इमेजिंग दृष्टिकोण में हाल ही में अग्रिमों vivo सेल ट्रैकिंग2,3,4,5 में गैर इनवेसिव सक्षम है । बाद एक जीवित पशु या एक मानव में उपस्थिति, वितरण, मात्रा, और कोशिकाओं की व्यवहार्यता, गैर इनवेसिव और बार निगरानी करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
यहां वर्णित विधि के प्रयोजन के लिए longitudinally और गैर इनवेसिव में 3 डी में कैंसर की कोशिकाओं को ट्रैक कुतर ट्यूमर मॉडल रहने में है । इस विधि का प्रयोग, शोधकर्ताओं को सही 3 डी में मेटास्टेटिक फैल सहित ट्यूमर प्रगति मात्रा में सक्षम हो जाएगा । पारंपरिक गैर इमेजिंग आधारित तकनीक की तुलना में, इस विधि काफी हद तक कम पशु संख्या के साथ मात्रात्मक डेटा के अधिग्रहण प्रदान करता है । इस विधि की एक और विशेषता यह है कि यह प्रोटोकॉल या cytometry3,6द्वारा काटा ऊतकों में ट्रैक किए गए कोशिकाओं के सुव्यवस्थित बहाव पूर्व vivo विश्लेषण के साथ vivo इमेजिंग में सहसंबंध की अनुमति देता है ।
इस विधि के विकास के लिए तर्क को कुतर ट्यूमर मॉडल में पूरे मेटास्टेटिक प्रक्रिया की निगरानी और ठहराव के लिए एक vivo में उपकरण प्रदान किया गया था । महत्वपूर्ण बात, यह पशु उपयोग को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि एक ही समय में अंतर-पशु परिवर्तनशीलता को कम करने । अनुदैर्ध्य गैर इनवेसिव पूरे शरीर इमेजिंग उत्कृष्ट मेटास्टेटिक वृद्धि पर सूचित करने के लिए अनुकूल है, जिसके लिए प्रति यह सही समय और इसकी घटना के स्थान की भविष्यवाणी करने के लिए मुश्किल है । पूरे शरीर 3 डी इमेजिंग इसलिए विधि विकास के केंद्र में किया गया है । vivo इमेजिंग और संभावित बहाव पूर्व vivo ऊतकवैज्ञानिक पुष्टिकरण में पूरे शरीर के बीच स्केल अंतर को बंद करने के लिए, एक दोहरे मोड रेडियोन्यूक्लाइड-प्रतिदीप्ति रिपोर्टर पर आधारित एक बहु-स्केल इमेजिंग दृष्टिकोण3को अपनाया गया था, 6.
पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) सबसे संवेदनशील 3 डी पूरे शरीर इमेजिंग प्रौद्योगिकी वर्तमान में उत्कृष्ट गहराई पैठ और पूर्ण ठहराव7 के एक संकल्प के साथ < 1 mm8,9की पेशकश उपलब्ध है । वर्तमान में, रेडियोन्यूक्लाइड इमेजिंग द्वारा पूरे शरीर स्तर पर नैदानिक सेल ट्रैकिंग मज़बूती से एक लाख कोशिकाओं की मात्रा प्रति ~ 1,000 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं का पता लगा सकते हैं3,6 उप मिलीमीटर क्षेत्र में संकल्प के साथ. intravital माइक्रोस्कोपी के विपरीत, यह एक फैल कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने नहीं कर सकते, लेकिन यह शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है (जैसे खिड़की कक्षों), देखने के एक छोटे से क्षेत्र तक ही सीमित नहीं है, और कम ऊतक पैठ और बिखराव से नहीं. Bioluminescence इमेजिंग एक सस्ता विकल्प प्रदान करता है, लेकिन तितर बितर और प्रकाश अवशोषण मुद्दों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गरीब गहराई पैठ के साथ जुड़ा हुआ है, और फलस्वरूप गंभीर ठहराव में सीमित2। प्रतिदीप्ति पूरे शरीर इमेजिंग 3 डी छवियों के अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह bioluminescence या रेडियोन्यूक्लाइड टेक्नोलॉजीज2की तुलना में बहुत कम संवेदनशील है । बहरहाल, प्रतिदीप्ति cytometry या माइक्रोस्कोपी द्वारा पूर्व vivo बहाव ऊतक विश्लेषण प्रदर्शन करने का अवसर प्रदान करता है. बाद macroscopic पूरे शरीर इमेजिंग (मिमी संकल्प) और प्रतिदीप्ति सूक्ष्म ऊतक विश्लेषण (µm संकल्प)3के बीच पैमाने-अंतर को बंद कर देता है । इसलिए, रेडियोन्यूक्लाइड और प्रतिदीप्ति रूपरेखा एक दूसरे के पूरक हैं, पूरे शरीर के स्तर से लेकर (उप) सेलुलर पैमाने पर ।
रिपोर्टर जीन इमेजिंग आदर्श मेटास्टेसिस अनुसंधान में आवश्यक के रूप में लंबे समय तक सेल ट्रैकिंग के लिए अनुकूल है । इस आवेदन में यह सीधे सेल लेबलिंग के रूप में यह है (मैं) लेबल कमजोर पड़ने से प्रभावित नहीं है और इस तरह समय पर नज़र रखने में सीमित नहीं है, और (ii) बेहतर लाइव सेल संख्या को दर्शाता है । नतीजतन, पूरे शरीर सेल ट्रैकिंग अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जिसमें ट्रेस करने योग्य कोशिकाओं पैदा करना या विस्तार में vivo, उदाहरण के लिए कैंसर अनुसंधान में 3, 6, स्टेम में teratoma गठन का पता लगाने के लिए सेल अनुसंधान, या प्रतिरक्षा सेल विस्तार के ठहराव के लिए5।
विभिन्न रेडियोन्यूक्लाइड-आधारित रिपोर्टर जीन उपलब्ध हैं2. इनमें दाद सिंप्लेक्स वायरस HSV11 thymidine कळेनासे (HSV1-tk), ट्रांसपोर्टर्स जैसे सोडियम आयोडाइड symporter (NIS) या norepinephrine ट्रांसपोर्टर (NET) जैसे एंजाइम शामिल हैं, साथ ही कोशिका की सतह रिसेप्टर्स जैसे कि डोपामाइन D2 रिसेप्टर ( D2R) । NIS एक ग्लाइकोसिलेटेड ट्रांस-झिल्ली प्रोटीन है कि सक्रिय रूप से मध्यस्थता आयोडाइड, उदाहरण के लिए थायरॉयड ग्रंथि में थायराइड हार्मोन के बाद के संश्लेषण के लिए10। इस प्रक्रिया को ना+ के symport से प्रेरित है और सेलुलर सोडियम ढाल, जो ना+/K+-ATPase11द्वारा बनाए रखा है पर निर्भर करता है । नतीजतन, NIS बेहतर आयोडाइड/रेडियो ट्रेसर के रूप में अंय पत्रकारों की तुलना में रहने वाले सेल संख्या को दर्शाता है एक सक्रिय न +/K + ढाल के बजाय ट्रांसपोर्टर की मात्र उपस्थिति से जुड़ा हुआ है । परंपरागत रूप से, radioiodide NIS इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है । सेल ट्रैकिंग के लिए, वैकल्पिक NIS radiotracers है कि थायराइड में चयापचय फंस नहीं कर रहे है6बेहतर होने की सूचना दी गई है । यह हाल ही में विकसित पीईटी रेडियो ट्रेसर [18 f] tetrafluoroborate ([18 f] BF 4-) 12, 13 radioiodide 6 की तुलना में बेहतर फार्माकोकाइनेटिक्स दिखाता है जबकि जटिल radiochemistry सुविधाओं के लिए आवश्यकता के बिना उच्च विशिष्ट गतिविधियों में14 उपलब्ध है । [18F] BF4– दो अलग तरीके के माध्यम से संश्लेषित किया जा सकता है । पहली विधि में गैर रेडियोधर्मी 19एफ के आइसोटोप एक्सचेंज पर आधारित है BF4– रेडियोधर्मी 18एफ12के साथ । दूसरी विधि 18एफ के लिए गैर रेडियोधर्मी बोरान trifluoride14के अलावा के माध्यम से है । उत्तरार्द्ध विधि उच्च विशिष्ट गतिविधियों14 उपज के लिए रिपोर्ट की गई थी और नैदानिक इमेजिंग के लिए पसंद की विधि है ।
NIS अत्यधिक थायराइड ऊतकों में व्यक्त की है । यह भी लार में व्यक्त किया जाता है, lachrymal और स्तनपान कराने वाली स्तन ग्रंथियों के रूप में अच्छी तरह से पेट, लेकिन कम स्तर पर के रूप में थायरॉयड ग्रंथि की तुलना में10. इसलिए, अंय शरीर क्षेत्रों में उत्कृष्ट कंट्रास्ट इमेजिंग NIS का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । यह मानव, चूहा और माउस के बीच भी अत्यधिक मुताबिक़ है10. इसके अलावा, वहां अस्थानिक पर विषाक्तता की कोई रिपोर्ट नहीं है गैर थायरॉयड कोशिकाओं में NIS अभिव्यक्ति । महत्वपूर्ण बात, NIS भी मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ संबद्ध नहीं किया गया है, न तो मनुष्यों में और न ही कुतर में । NIS एक रिपोर्टर जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया है प्रमोटर गतिविधि को मापने के लिए15,16,17 और जीन अभिव्यक्ति18,19,20,21,22 ,कई अलग संदर्भों में23 . यह भी गैर इनवेसिव इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है जीन थेरेपी वैक्टर24,25, और हृदय4, टेम26, सूजन5, और तंत्रिका अध्ययन में कोशिकाओं को ट्रैक27। हाल ही में, NIS भी vivo3,6 मेंकैंसर मेटास्टेसिस ट्रैक करने के लिए एक रिपोर्टर जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया है ।
सारांश में, पिछले तकनीक पर इस पद्धति का मुख्य लाभ कर रहे हैं: (i) vivo स्थानीयकरण और मेटास्टेटिक प्रसार के ठहराव में अति संवेदनशील गैर इनवेसिव 3 डी, (ii) के स्वचालित उत्पादन [18F] BF4– पर उच्च दाढ़ कार्यकलाप, (iii) अनुदैर्ध्य इमेजिंग के माध्यम से आवश्यक पशुओं में उल्लेखनीय कमी, (iv) क्रमिक इमेजिंग सत्रों से युग्मित डेटा का अधिग्रहण, जिसके परिणामस्वरूप सांख्यिकीय डेटा में सुधार होता है, जो बदले में पशु उपयोग को कम करता है, और (v) cytometry या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा ऊतकों में कैंसर की कोशिकाओं के पूर्व vivo पुष्टि के लिए आंतरिक विकल्प ।
इस विधि द्वारा vivo में ट्रेस करने में कैंसर की कोशिकाओं को रेंडर करने के लिए पहला कदम उन्हें NIS-FP फ्यूजन रिपोर्टर एक्सप्रेस करने के लिए इंजीनियरिंग की आवश्यकता है । फ्यूजन रिपोर्टर में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की पसंद oligomerizing फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में महत्वपूर्ण है कृत्रिम रिपोर्टर क्लस्टरिंग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जिससे नकारात्मक अपने कार्य को प्रभावित । हम ऐसे mEGFP के रूप में सिद्ध monomeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ सफलता मिली है (monomerizing उत्परिवर्तन A206K36,37), mTagRFP, या mCherry के साथ । NIS या तो मानव या माउस मूल का हो सकता है (एचएनआई या msNIS) प्रयोग और कैंसर मॉडल के उद्देश्य के आधार पर । Transduction क्षमता आम तौर पर अलग कैंसर सेल लाइनों के बीच बदलती हैं । हालांकि, जनित कैंसर सेल लाइनों बाद में इस प्रोटोकॉल में FACS द्वारा शुद्ध कर रहे हैं, जिससे transduction शर्तों के अनुकूलन के लिए की जरूरत को कम करने । संक्रमण की उच्च बहुलता के साथ Transduction हमेशा उचित नहीं है के रूप में कई जीनोम में निर्माण एकीकरण के लिए उच्च निर्माण अभिव्यक्ति में ही नहीं बल्कि अधिक अवांछित/अनियमित जीनोम संशोधन में परिणाम होने की संभावना है । इसलिए, यह जाने के लिए महत्वपूर्ण है polyclonal transduced कोशिकाओं अभिव्यक्ति की स्थिरता के लिए विकसित (प्रवाह cytometry द्वारा निगरानी) और केवल FACS द्वारा प्रतिभाशाली क्लोन छंटाई से बचें । यह भी गैर रिपोर्टर सुविधाओं के कार्यात्मक मांयता प्रदान करता है महत्वपूर्ण इन कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए पहले vivo प्रयोगों में । वायरल जीन डिलिवरी के लिए हाल ही में विकसित एक विकल्प जीन संपादन प्रौद्योगिकी38है, जो वायरल एकीकरण साइटों पर और अधिक विशिष्ट नियंत्रण प्रदान करता है । प्रवाह cytometry और immunoblotting द्वारा अभिव्यक्ति विश्लेषण महत्वपूर्ण है । प्रवाह cytometry जनसंख्या के अधिग्रहण की अनुमति देता है आधारित एक सेल डेटा, उदाहरण के लिए जांच के लिए कि क्या वहां रिपोर्टर अभिव्यक्ति के स्तर में समय के साथ किसी भी बहाव है । यह केवल FP moiety पर निर्भर करता है, जब तक कि कोशिकाओं को भी एक एंटीबॉडी सतह या कुल NIS के खिलाफ निर्देशित के साथ दाग रहे हैं । प्रवाह cytometry फ्यूजन रिपोर्टर अखंडता पर सूचित नहीं करता है । इसके विपरीत, फ्यूजन रिपोर्टर की अखंडता पर immunoblotting रिपोर्ट । nis और fp के आण्विक वजन चुना nis-fp के अपेक्षित आणविक भार निर्धारित करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए । फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन फ्यूजन रिपोर्टर colocalization प्लाज्मा झिल्ली मार्कर गेहूं रोगाणु agglutinin के साथ सभी नव सेल लाइंस बना दी । यह प्रोटीन के अधिकांश के लिए अपेक्षित सेलुलर स्थान था और बाद में कार्यात्मक सत्यापन के लिए एक जाना आगे मील का पत्थर संकेत दिया । यदि ंयूनतम/कोई NIS-FP प्लाज्मा झिल्ली पर पाया गया था (केवल आंतरिक सेलुलर डिब्बों मेंउदा ), यह इस सेल लाइन में फ्यूजन रिपोर्टर, या फ्यूजन रिपोर्टर के एक संभावित उत्परिवर्तन को प्रभावित करने के साथ एक सेल जैविक मुद्दे का संकेत होगा इसके intracellular ्े । यह उल्लेखनीय है कि हम कैंसर कोशिकाओं हम अब तक परीक्षण में से किसी में ऐसा मामला नहीं देखा है, जो शामिल थे: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/बी (मानव मेलेनोमा); MCF-7, एमडीएस-एमबी-231, एमडीए-एमबी-436 (मानव स्तन कैंसर); NCI-H1975 (मानव फेफड़ों के कैंसर); SK-Hep1 (मानव जिगर कैंसर); 4T1, 4t 1.2, 66cl4, 67NR, FARN168 (murine भड़काऊ स्तन कैंसर); B16F0, B16F3, B16F10 (murine मेलेनोमा); MTLn3 (मूषक स्तन ग्रंथिकर्कटता) ।
nis समारोह रेडियोधर्मी NIS सब्सट्रेट के साथ ले लो परख का उपयोग कर मापा जाना चाहिए । कारण SPECT रेडियो ट्रेसर 99m TcO 4-जनरेटर का उत्पादन किया जा रहा है और इसलिए किसी भी रेडियो ट्रेसर संश्लेषण के लिए की आवश्यकता के बिना अस्पतालों में व्यापक रूप से उपलब्ध है और साथ ही एक और अधिक सुविधाजनक अब आधा जीवन (६.०१ एच के लिए 99m टीसी के रूप में 18एफ के लिए 110 मिनट की तुलना में), हम नई nis-FP एक्सप्रेस सेल लाइनों के नियमित कार्यात्मक सत्यापन के लिए इस NIS सब्सट्रेट इस्तेमाल किया । nis-एक्सप्रेस के साथ कोशिकाओं के पूर्व अवरुद्ध एनआईएस सोडियम perchlorate की उंमीद में कमी के परिणामस्वरूप/रेडियो ट्रेसर के समाप्त होने की संभावना है, जिससे रेडियो ट्रेसर की विशिष्टता का प्रदर्शन । यह NIS विशिष्टता परीक्षण एक महत्वपूर्ण मांयता चरण है । यदि कोई nis विशिष्टता प्रयोग कम रेडियो ट्रेसर में संबंधित पैतृक कोशिकाओं के लिए तुलनीय, या तो प्रयोग के दौरान एक तकनीकी त्रुटि उत्पन्न हुई है, या रेडियो ट्रेसर के लिए nis के कारण नहीं था परिणाम नहीं होगा । यह भी संभव है कि सोडियम perchlorate पूर्व अवरुद्ध एक पैतृक सेल लाइन में रेडियो ट्रेसर कम कर देता है; यह अंतर्जात कार्यात्मक NIS अभिव्यक्ति (जैसे उत्तेजित थायराइड कोशिकाओं6) के साथ सेल लाइनों की पहचान करेगा ।
इस इमेजिंग प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि जानकारी 3 डी में और समय के साथ एकत्र की है । यह समय के साथ एक ही जानवर से छवियों की तुलना की अनुमति देता है, जिससे युग्मित डेटा प्रदान करने और इस तरह अंतर-पशु परिवर्तनशीलता की वजह से मुद्दों पर काबू पाने । इस विरोधाभासों के साथ सबसे गैर इमेजिंग संबंधित मेटास्टेसिस आकलन तरीके है कि विभिंन प्रकार के समय पर विभिंन जानवरों के त्याग पर आधारित हैं । चित्र बी में यह स्पष्ट है कि कैसे मेटास्टेटिक प्रसार और एक व्यक्ति जानवर में समय के साथ प्रगति की वृद्धि हुई है । पीईटी/सीटी इमेजिंग द्वारा पता लगाया संकेतों मौलिक NIS अभिव्यक्ति की वजह से कर रहे हैं । यह सभी संकेतों exogenously nis-एक्सप्रेस कैंसर कोशिकाओं के साथ ही सभी अंगों endogenously nis व्यक्त करने से भी शामिल है । ठेठ अंतर्जात NIS संकेत थायराइड और लार ग्रंथियों में पाए जाते हैं, पेट, और, स्तन और lachrymal ग्रंथियों के कुछ भागों में निम्न स्तर पर. अंतर्जात nis अभिव्यक्ति के अलावा, nis रेडियो ट्रेसर [18 F] BF 4-भी गुर्दे के माध्यम से उत्सर्जित होता है, जिससे मूत्र से भरे मूत्राशय में रेडियो ट्रेसर को समझाते हैं । इस प्रोटोकॉल (45 मिनट पोस्ट रेडियो ट्रेसर इंजेक्शन 6) में अनुशंसित इमेजिंग समय बिंदु पर गुर्दे की अधिकता अब detectable है । यदि मूत्र से संकेत से भरा मूत्राशय संकेत करने वाली पृष्ठभूमि मुद्दों के लिए नेतृत्व करना चाहिए, मूत्राशय यांत्रिक रूप से इमेजिंग से पहले संज्ञाहरण के तहत खाली किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, अंतर्जात संकेतों जानवर उपभेदों के बीच भिंन हो सकते हैं । यह भी उल्लेखनीय है कि स्तन ग्रंथियों में अंतर्जात एनआईएस अभिव्यक्ति स्तनपान कराने की स्थिति के तहत अधिक हो सकता है10. प्रस्तुत मामले में और उन मेटास्टेटिक कक्ष पंक्तियों के मामलों में सफलतापूर्वक (cf. सूची के ऊपर) से पहले विशेषता है, हम अंतर्जात NIS अभिव्यक्ति काफी मेटास्टेसिस डिटेक्शन के साथ हस्तक्षेप करने के लिए नहीं मिला । यह उल्लेखनीय है, कि [18एफ] BF4– कैंसर के ऊतकों में आयोडाइड की तुलना में अधिक के लिए उपलब्ध रहता है, क्योंकि आयोडाइड थायराइड हार्मोन6में metabolized है । इस घटना को भी [18F] BF4-6की तुलना में रक्त प्रवाह में radioiodide की बड़ी मात्रा में योगदान हो सकता है । विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए (कैंसर सेल ट्रैकिंग अन्य कैंसर या गैर-कैंसर सेल ट्रैकिंग अनुप्रयोगों में), यह अलग हो सकता है, और इसलिए अंतर्जात NIS अभिव्यक्ति के माध्यम से संकेत-से-पृष्ठभूमि समस्याएँ पैदा करने के लिए संभावित है कि क्या का आकलन करने के लिए अनुशंसित है प्रारंभिक प्रयोगों । नैदानिक इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण पहलू रेडियो ट्रेसर की दाढ़ गतिविधि है । विधि यहां वर्णित का उपयोग करता है ~ 1.5 GBq 18एफ के रूप में शुरू सामग्री 14 और दाढ़ काफी पहले रिपोर्ट प्रतिस्थापन विधि12से ऊपर की गतिविधियों का उत्पादन दिखाया गया है । [18F] BF4– दाढ़ गतिविधियों पर उत्पादित ≤ 1 GBq/µmol12 NIS-व्यक्त ऊतकों में कम से अधिक नेतृत्व कर सकते हैं । यह विशेष महत्व का है जब प्रति किलोग्राम रेडियोधर्मिता की इंजेक्शन राशि अधिक है, अर्थात जब चूहों जैसे छोटे जानवरों39छवि है; यह मानव की स्थापना40में कम महत्वपूर्ण है । उच्च दाढ़ गतिविधियों उच्च गुणवत्ता वाले नैदानिक पीईटी इमेजिंग के लिए इसलिए आवश्यक हैं । बोरान trifluoride अलावा विधि द्वारा प्राप्त दाढ़ कार्यकलाप14, जो इस प्रोटोकॉल में अपने स्वचालित रूप में दिखाया गया है, इस समस्या को दूर करें । इसके अलावा, यह उल्लेखनीय है कि [18F] BF के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल4– संश्लेषण अच्छा विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) के साथ संगत नहीं है और इसलिए इस रूप में मानव नैदानिक परीक्षणों में उपयोग के लिए अनुपयुक्त । एक जीएमपी प्रोटोकॉल ( 18एफ प्रतिस्थापन विधि के द्वारा radiolabel BF के लिए4–) कहीं और40उपलब्ध है ।
पीईटी/सीटी इमेजिंग रेडियो ट्रेसर के दृश्य की अनुमति देता है, जो nis-मध्यस्थता रेडियो ट्रेसर के ऊपर के संकेत है nis-FP एक्सप्रेस कैंसर कोशिकाओं से स्टेमिंग । इससे भी महत्वपूर्ण बात, संबद्ध पालतू संकेतों quantified जा सकता है । यह किसी भी संभावित पृष्ठभूमि से प्रासंगिक संकेतों के एक सुसंगत और निष्पक्ष भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए विश्वसनीय थ्रेसहोल्ड प्रक्रियाओं को लागू करने के लिए आवश्यक है । के रूप में पृष्ठभूमि vivo मेंविभिन्न स्थानों में बदलता है, यह स्थानीय/क्षेत्रीय थ्रेसहोल्ड और विभाजन पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसा ही एक तरीका द्वारा विकसित किया गया था और Otsu34के बाद नाम, और उसके 3 डी कार्यांवयन प्राथमिक ट्यूमर और इस प्रोटोकॉल में मेटास्टेसिस के 3 डी प्रतिपादन के लिए कार्यरत है । आम तौर पर, पर्यवेक्षक नेत्रहीन द्वारा देखा छवि quantified% इंजेक्शन खुराक (% आईडी) मूल्यों के लिए सबसे अच्छा मेल खाती है । छवि आधारित ठहराव के लिए के रूप में, यह भी अपने संस्करणों के लिए विभिन्न ऊतकों की मापा रेडियोधर्मिता मूल्यों को सामान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है. सामान्य परिणाम व्यक्त करने के दो मुख्य रूप से उपयोग किए गए तरीके हैं, (i)% id प्रति वॉल्यूम (उदा. % id/एमएल), और (ii) मानक के अनुसार मान (एसयूवी35) । वे है कि% में अलग आईडी/एमएल खाते में व्यक्तिगत मात्रा में ही लेता है, जबकि एसयूवी एक उपाय है कि पूरे जानवर भर में औसत रेडियोधर्मिता के सापेक्ष है । यह भी महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि NIS इमेजिंग रेंडर करता लाइव ट्यूमर वॉल्यूम (एलटीवी), पहुंच योग्य नहीं है क्योंकि मृत/synthesizing एटीपी नहीं अब रेडियो ट्रेसर 10 आयात कर सकते हैं । यह प्राथमिक ट्यूमर के भीतर बड़े कम संकेत क्षेत्र बताते हैं (“डोनट के आकार का ट्यूमर) ट्यूमर कोशिका मृत्यु के क्षेत्रों का संकेत/ महत्वपूर्ण बात, एलटीवी कैलिपर माप द्वारा सुलभ क्रूड ट्यूमर मात्रा की तुलना में ट्यूमर के बोझ का एक बहुत अधिक विश्वसनीय उपाय था (जो खाते व्यवहार्यता में ले और केवल सतही ट्यूमर क्षेत्रों का आकलन नहीं करता है) ।
इस दोहरे मोड ट्रैकिंग रणनीति का एक प्रमुख लाभ स्पष्ट है जब पशु मुर्गियों के बाद ऊतकों की कटाई । vivo छवियों में द्वारा निर्देशित और पशु विच्छेदन के दौरान फ्लोरोसेंट कैंसर की कोशिकाओं द्वारा सहायता, छोटे और गहरे बैठे अंगों/मेटास्टेसिस भी मज़बूती से काटा जा सकता है । जमे हुए ऊतक संरक्षण/धारा एक विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ दाग के लिए आवश्यकता के बिना GFP के प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति इमेजिंग सक्षम बनाता है, लेकिन कम संरचनात्मक ऊतक संरक्षण की कीमत पर के रूप में formalin की तुलना में तय आयल-एंबेडेड पद्धति (FFPE) । बाद गंभीर भी विरोधी FP धुंधला करने की आवश्यकता है, क्योंकि FFPE विधि फ्लोरोसेंट प्रोटीन की बरकरार संरक्षण के साथ असंगत है (निर्धारण/निर्जलीकरण के कारण)/। जबकि प्रतिदीप्ति संकेत ट्यूमर सेल उपस्थिति का संकेत है, यह सुनिश्चित करने के लिए इस वर्गीकरण की पुष्टि की है महत्वपूर्ण है पूर्व विवो ने काटा ऊतक के रेडियोधर्मिता मापन (‘ (‘ वितरण) । पूर्व vivo रेडियोधर्मिता माप प्रतिदीप्ति के दृश्य का पता लगाने की तुलना में अधिक संवेदनशील हैं, इसलिए कैंसर कोशिका पर निर्भर संकेतों की पहचान है कि अंयथा नहीं रह जाएगा अनुमति दे सकते हैं । एक टर्मिनल इमेजिंग सत्र के मामले में, यह सही इंजेक्शन रेडियो ट्रेसर मात्रा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रेडियो ट्रेसर रेडियोधर्मिता माप, पशु इंजेक्शन, पशु मुर्गियों के समय नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, और नपेed जुटाना काउंटर माप के ऊतकों को काटा । यह रेडियो ट्रेसर क्षय के लिए सुधार सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है और इस तरह विश्वसनीय वितरण विश्लेषण सक्षम करें ।
पीईटी/सीटी इमेजिंग एक पूरे शरीर के स्तर पर मेटास्टेटिक प्रसार के आकलन सहित ट्यूमर प्रगति की दोहराया गैर इनवेसिव 3 डी ठहराव सक्षम बनाता है । यह सुविधा पारंपरिक तरीकों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है, जो अक्सर समय अंक बदलती में ट्यूमर प्रगति के आकलन के लिए euthanized रहे हैं कि जानवरों के बड़े साथियों पर भरोसा करते हैं । इस इमेजिंग आधारित दृष्टिकोण का लाभ कर रहे हैं: (i) vivo ठहराव में अति संवेदनशील गैर इनवेसिव 3 डी, (ii) दोहराने इमेजिंग की संभावना के कारण पशु संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी, (iii) अनुदैर्ध्य युग्मित डेटा का अधिग्रहण बाद के इमेजिंग सत्र से अंतर-पशु परिवर्तनशीलता को छोड़कर आंकड़ों में सुधार, जो आगे की बारी में पशु संख्या कम कर देता है, (iv) स्वचालित उत्पादन की [18F] BF4उच्च विशिष्ट गतिविधियों पर– , और (v) इस तरह के सूक्ष्म या cytometry के रूप में प्रतिदीप्ति के तरीके से ऊतकों में पूर्व vivo पुष्टि के लिए आंतरिक विकल्प ।
vivo में सेल ट्रैकिंग एक बढ़ती हुई फ़ील्ड है । यह इमेजिंग प्रौद्योगिकी, जो बढ़ाया संकल्प, जांच सीमा और मल्टीप्लेक्स क्षमता (मल्टी मोडल इमेजिंग के माध्यम से) के परिणामस्वरूप में हाल ही में प्रगति के द्वारा ईंधन दिया गया है । इस प्रोटोकॉल में, हम दोहराने इमेजिंग द्वारा 3 डी में सहज कैंसर सेल मेटास्टेसिस सहित ट्यूमर प्रगति को ट्रैक करने के लिए इस अवधारणा लागू होते हैं । आवेदन सहज कैंसर कोशिका मेटास्टेसिस के तंत्र को खंडित करने के उद्देश्य से अध्ययन में शामिल हैं । उदाहरण के लिए, ट्रेसिंग ट्यूमर कोशिकाओं मेटास्टेटिक प्रक्रिया पर विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका घटकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (के रूप में वर्तमान/immunocompromisation के विभिन्न स्तरों के पशु उपभेदों में कार्यात्मक). इसी तरह व्यक्तिगत जीन का प्रभाव या तो पशु तनाव या फिर कैंसर सेल लाइन में, इसका अध्ययन किया जा सकता है । इसके अलावा, प्रस्तुत प्रोटोकॉल का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है/विशिष्ट दवाओं या ट्यूमर प्रगति पर चिकित्सीय अवधारणाओं की प्रभावकारिता को मांय । महत्वपूर्ण बात, इस रिपोर्टर जीन: पीईटी इमेजिंग के लिए रेडियो ट्रेसर जोड़ी (NIS: [18 F] BF 4) भी अलग सेल ट्रैकिंग अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कई सेल चिकित्सा वर्तमान में आशाजनक चिकित्सकीय दृष्टिकोण के रूप में उभर रहे हैं । इस कैंसर के इलाज के लिए सेलुलर चिकित्सकीय41 भी शामिल है लेकिन रोपाई42 और अपक्षयी चिकित्सा43,44 सेटिंग्स में । पूरे vivo सेल ट्रैकिंग में शरीर के विकास और सेलुलर चिकित्सीय चिकित्सा के नैदानिक अनुवाद के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है, उदाहरण के लिए, सुरक्षा के मूल्यांकन के लिए और चिकित्सा निगरानी के लिए ।
The authors have nothing to disclose.
अनुसंधान राजा कॉलेज लंदन और UCL व्यापक कैंसर इमेजिंग सेंटर, MRC और डोह (इंग्लैंड) के सहयोग से कैंसर अनुसंधान ब्रिटेन और EPSRC द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया था; नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च (NIHR) ने लड़के और सेंट थॉमस ‘ एन एच एस फाउंडेशन ट्रस्ट और राजा कॉलेज लंदन में स्थित बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर; अनुदान संख्या WT 088641 के अंतर्गत वेलकम ट्रस्ट और EPSRC द्वारा वित्तपोषित मेडिकल इंजीनियरिंग में उत्कृष्टता का केंद्र/z/ एक कैंसर अनुसंधान ब्रिटेन Multidisciplinary परियोजना पुरस्कार के लिए गोफ और PJB, और एक राजा के स्वास्थ्य भागीदारों के लिए अनुदान गोफ । nanoPET/सीटी और nanoSPECT/सीटी स्कैनर खरीदे गए थे और वेलकम ट्रस्ट से एक उपकरण अनुदान द्वारा बनाए रखा । व्यक्त विचार लेखकों के उन और एन एच एस, NIHR, या डोह के उन जरूरी नहीं हैं ।
Step 1) Engineering and characterization of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP. | |||
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole | Thermo Scientific | H3570 | Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water. |
4T1 murine breast cancer cell line | ATCC | CRl-2539 | for details see ATCC website |
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter | Roche Diagnostics GmbH | 5651697001 | CASY Model TT Cell Counter and Analyzer |
CASYclean Cleaning Reagent | Sedna Scientific | 2501036 | |
CASYton Isotonic Diluent | Sedna Scientific | 2501037 | |
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis | |
Cover slips No. 1.5 thickness | VWR International | 631-0150 | |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
DMEM | Sigma | D5546 | Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells. |
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III | BD Biosciences | Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) – cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead. |
L-glutamine | Sigma | G7513 | Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered |
Linear polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line. |
MDA-MB-231 human breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | for details see ATCC website |
Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
pLNT SFFV NIS-mEGFP | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pLNT SFFV NIS-mCherry | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pMD2.G | Addgene | #12259 | plasmids encoding for the VSV-G envelope |
pRRE | Addgene | #12251 | packaging plasmid |
pRSV-Rev | Addgene | #12253 | packaging plasmid |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P43330 | Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride |
Poly(vinyl alcohol – vinyl acetate) | Polysciences | 17951 | Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5 |
Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833 | From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water |
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge | Hettich Lab Technology | ||
RPMI 1640 | Sigma | R0883 | Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells. |
SFCA Syringe filter 0.45 μm | Corning | ||
Syringes 10 mL | BD Emerald | Disposable non-sterile syringes | |
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL | Life Technologies | Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera | |
Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma | 59418C | (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red |
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate | Life Technologies | W21404 | Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence |
Step 2) Establishment of in vivo tumor models. | |||
Digital caliper | World Precision Instruments | 501601 | |
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm | |
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance | |||
Step 3) Production of [18F]BF4– using an automated radiotracer synthesis platform. | |||
15-crown-5 | Sigma-Aldrich | 188832 | CAS 33100-27-5 |
Acetonitrile (anhydrous) | Acros Organics | 326811000 | |
Boron trifluoride diethyl etherate | Sigma-Aldrich | 216607 | BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7 |
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab | GE Healthcare | ||
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes | GE Healthcare | FASTlab Developer pack | |
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets | Macherey-Nagel | 802021 | RadioTLC plates, 40×80 mm |
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light | Waters | WAT023525 | Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL) |
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light | Waters | WAT023561 | Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL) |
Water for injection USP | GE Healthcare | ||
Nitrogen filter | Millipore | SE2M049I05 | Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm |
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT. | |||
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Rodent anesthesia induction chamber | Vet-Tech | AN010R | With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m) |
Rodent anesthesia system | Vet-Tech | AN001B | Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer |
Sterile physiological saline | Thermo Scientific Oxoid | BO0334B | |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer | |
Veterinary Scavenger | Vet-Tech | AN200 | VetScav filter weighing mechanism – 240 V with automatic temperature compensation and LED system |
5) In vivo data analysis. | |||
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
VivoQuant Software | Invicro LLC., Boston, USA | ||
6) Ex vivo analyses | |||
2-Methylbutane | Sigma | 59070-1L-D | Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 85040C | |
Cover slips 22×50 mm | VWR International | SMITMCQ211022X50 | |
Cryostat, e.g. Cryostat MNT | SLEE Medical | two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate | |
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson/Stratech | 111-175-144 | Used at 1:500 (2 µg/mL) |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
Microtome blades, e.g. Feather S35 | CellPath | ||
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5 | |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | |
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters |
O.C.T. compound | VWR international | 361603E | |
Wax pen, e.g. PAP-PEN | Dako UK Ltd | Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes | |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence |
Microscope slides, e.g. Superfrost slides | VWR, Lutterworth, UK | ||
Tris-buffered saline (TBS) | available from various suppliers. | Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4 |