Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

doi: 10.3791/57088 Published: March 13, 2018

Summary

Beschrijven we een protocol voor preklinische in vivo volgen van kanker uitzaaiingen. Het is gebaseerd op een verslaggever van de radionuclide-fluorescentie combineren de natrium jodide symporter, ontdekt door niet-invasieve [18F] Zilvertetrafluorboraat-PET, en een fluorescente proteïne voor gestroomlijnde ex vivo bevestiging. De methode is toepasbaar voor preklinische in vivo cel bijhouden dan tumor biologie.

Abstract

Metastase is verantwoordelijk voor de meeste kankersterfgevallen. Ondanks uitgebreid onderzoek blijft het mechanistische begrip van de complexe processen die metastase onvolledig. In vivo modellen staan voor metastase onderzoek, maar vereisen verfijning. Spontane metastase bijhouden door een niet-invasieve in vivo imaging is nu mogelijk, maar blijft uitdagend aangezien het vereist lange tijd observatie en hoge gevoeligheid. We beschrijven een longitudinale gecombineerde radionuclide en fluorescentie gehele lichaam in vivo imaging aanpak voor het bijhouden van de progressie van de tumor en spontane metastase. Deze verslaggever gene methodologie maakt gebruik van het natrium jodide symporter (NOS) gesmolten aan een fluorescente proteïne (FP). Kankercellen zijn ontworpen om stabiel uitdrukkelijke NIS-FP gevolgd door selectie op basis van de fluorescentie-geactiveerde cel sorteren. Overeenkomstige tumor modellen zijn gevestigd in muizen. NIS-FP waarin kankercellen zijn niet-gebeurt bijgehouden in vivo op het niveau van de gehele lichaam door positron emissie tomografie (PET) met behulp van de NOS radiotracer [18F] BF4-. PET is momenteel de meest gevoelige in vivo imaging technologie die beschikbaar is op deze schaal en maakt van betrouwbare en absolute kwantificering. Huidige methoden afhankelijk zijn van grote cohorten van dieren die voor metastase beoordeling op verschillende tijdstippen zijn euthanized of vertrouwen op nauwelijks meetbare 2D beeldvorming. De voordelen van de beschreven methode zijn: (i) gevoelige niet-invasieve in vivo 3D PET beeldvorming en kwantificering, (ii) geautomatiseerd PET tracer productie, (iii) een significante vermindering van vereiste dierlijke nummers als gevolg van imaging herhaalopties, (iv). de overname van de gekoppelde gegevens van de latere imaging sessies verstrekken van betere statistische gegevens, en (v) de intrinsieke optie voor ex vivo bevestiging van kankercellen in weefsels door fluorescentie microscopie of cytometry. In dit protocol beschrijven we alle stappen die nodig zijn voor routinematige NIS-FP-geboden niet-invasieve in vivo kanker cel bijhouden met behulp van PET/CT en ex vivo bevestiging van in vivo resultaten. Dit protocol heeft toepassingen buiten kankeronderzoek wanneer in vivo lokalisatie, expansie en lange tijd bewaking van een celpopulatie is van belang.

Introduction

Gemetastaseerde ziekte is de oorzaak voor de meeste sterfgevallen ten gevolge van kanker 1. Ondanks uitgebreid onderzoek naar uitgezaaide processen is betrouwbare bewaking van kanker uitzaaiingen in diermodel systemen moeilijk te bereiken. Recente vooruitgang in het gehele lichaam beeldtechnologieën en multimodale imaging benaderingen hebben niet-invasieve in vivo cel2,3,4,5bijhouden ingeschakeld. De laatste kan worden gebruikt als een hulpmiddel voor de monitoring van de aanwezigheid, de distributie, het aantal en de levensvatbaarheid van cellen, niet-gebeurt en herhaaldelijk in een levend dier of een mens.

Het doel van de hier beschreven methode is voor het overlangs en niet-gebeurt bijhouden van kankercellen in 3D in levende knaagdieren tumor modellen. Met behulp van deze methode, zal onderzoekers zitten kundig voor tumor progressie met inbegrip van metastatische verspreiding in 3D nauwkeurig te kwantificeren. Vergeleken met traditionele niet-gebaseerde imaging technieken, biedt deze methode de overname van kwantitatieve gegevens met grotendeels verminderde dierlijke cijfers. Een ander kenmerk van deze methode is dat het mogelijk maakt van correlatie van in vivo imaging met gestroomlijnde downstream ex vivo analyse bijgehouden cellen in geoogste weefsels door histologie of cytometry3,6.

De reden voor de ontwikkeling van deze methode was om een in vivo -instrument voor het toezicht op en de kwantificering van de hele metastatische proces in knaagdier tumor modellen. Nog belangrijker is, werd het ontworpen om te minimaliseren van dierlijke gebruik terwijl tegelijkertijd de vermindering van de spreiding over de dieren. Longitudinale niet-invasieve beeldvorming van het gehele lichaam is uitermate geschikt voor het informeren over metastatische uitgroei, voor welke per se is het moeilijk om nauwkeurig te voorspellen de tijd en de locatie van het ontstaan ervan. Gehele lichaam 3D-beeldbewerking is derhalve in het midden van methode-ontwikkeling. Om de omvang van de kloof tussen het gehele lichaam in vivo imaging en potentieel downstream ex vivo histologische bevestiging, een Multi-Scale imaging aanpak gebaseerd op een dual-mode-radionuclide-fluorescentie-verslaggever was aangenomen3, 6.

Positron emissie tomografie (PET) is de meest gevoelige 3D gehele lichaam imaging technologie die momenteel beschikbaar is voor het aanbieden van uitstekende diepte penetratie en absolute kwantificering7 met een resolutie van < 1 mm8,9. Op dit moment kunt preklinische cel bijhouden op het niveau van het gehele lichaam door radionuclide imaging betrouwbaar detecteren cellen op dichtheden van ~ 1000 cellen per volume van een miljoen cellen3,,6 , met resoluties in de regio sub millimeter. In tegenstelling tot intravital microscopie, op één verspreiden kankercellen kan niet speurder, maar het vereist geen chirurgische ingrepen (bv venster chambers), is niet beperkt tot een kleine gezichtsveld, en niet door lage weefsel penetratie en scatter. Bioluminescentie imaging is biedt een goedkoop alternatief, maar gekoppeld aan de scatter, evenals lichte absorptie problemen en slechte diepte penetratie en dus ernstig beperkt in kwantificering2. Fluorescentie gehele lichaam imaging is gebruikt voor de verwerving van 3D-beelden, maar het is veel minder gevoelig vergeleken met bioluminescentie of radionuclide technologieën2. Niettemin, fluorescentie biedt de mogelijkheid om de ex vivo downstream weefsel analyses door cytometry of microscopie uit te voeren. Het laatste sluit de schaal-kloof tussen macroscopische gehele lichaam beeldvorming (mm resolutie) en fluorescentie microscopische weefsel analyse (µm resolutie)3. Daarom complementair radionuclide en fluorescentie modaliteiten, variërend van het gehele lichaam niveau tot de (sub-) cellulaire-schaal.

Reporter gene imaging is bij uitstek geschikt voor langdurige cel bijhouden zoals vereist in de metastase onderzoek. In deze toepassing het is superieur aan direct cel labelen want het is (i) niet beïnvloed door label verdunning en dus niet beperkt in de tijd bijhouden, en (ii) beter weerspiegelt levende cel nummers. Bijgevolg, hele lichaam cel bijhouden is vooral handig voor toepassingen waarin traceerbaar cellen vermenigvuldigen of in vivouitbreiden, bijvoorbeeld bij kanker onderzoek3,6, voor de detectie van Teratoom vorming in stengel cel onderzoek of voor de kwantificering van immuun cel expansie5.

Verschillende radionuclide gebaseerde reporter genen zijn beschikbaar2. Deze omvatten enzymen zoals het herpes simplex virus HSV11 thymidinekinase (HSV1 -tk), vervoerders zoals de natrium jodide symporter (NIS) of de noradrenaline vervoerder (NET), alsmede cel oppervlakte receptoren zoals de dopamine D2 receptor) D2R). NIS is een geglycosyleerde trans-membraan eiwit dat actief jodide opname, bijvoorbeeld in de folliculaire cellen in de schildklier voor de latere synthese van schildklierhormonen10 bemiddelt. Dit proces wordt aangestuurd door de symport van de nb+ en afhankelijk van het verloop van de cellulaire natrium, dat wordt bijgehouden door de nb+/K+-ATPase11. Bijgevolg, NIS beter weerspiegelt levende cel nummers dan andere verslaggevers, zoals de opname van jodide/radiotracer is gekoppeld aan een actieve nb+/K+ verloop in plaats van de loutere aanwezigheid van de vervoerder. Traditioneel radioiodide is gebruikt voor NIS imaging. Voor het bijhouden van de cel, zijn alternatieve NIS-radiotracers die metabolisch niet in de schildklier gevangen zijn bij superieure6gemeld. Dit recent ontwikkelde PET radiotracer [18F] Zilvertetrafluorboraat ([18F] BF4-)12,13 toont superieure farmacokinetiek in vergelijking met radioiodide6 terwijl ze beschikbaar bij hoge specifieke activiteiten14 zonder de behoefte aan complexe radiochemie faciliteiten. [18F] BF4- kan worden gesynthetiseerd via twee verschillende manieren. De eerste methode is gebaseerd op de isotoop uitwisseling van niet-radioactieve 19F in BF4- met radioactieve 18F12. De tweede methode is door toevoeging van 18F tot en met niet-radioactieve boor trifluoride14. De laatste methode werd gemeld aan opbrengst hoger specifieke activiteiten14 en is de methode van keuze voor preklinische beeldvorming.

NIS wordt sterk uitgedrukt in de weefsels van de schildklier. Het komt ook tot uiting in de borstklieren speeksel, lachrymal en zogende evenals de maag, maar op een lager niveau in vergelijking met de schildklier10. Daarom kan uitstekend contrast imaging in andere gebieden van het lichaam worden bereikt met behulp van NIS. Het is ook zeer homologe tussen mens, rat en muis10. Bovendien zijn er geen meldingen van toxiciteit bij ectopische NIS expressie in niet-thyroidal cellen. Bovenal NIS heeft ook niet in verband gebracht met host immuunrespons, noch bij knaagdieren als bij de mens. NIS is gebruikt als een verslaggever gen voor het meten van de promotor activiteit15,16,17 en gen expressie18,19,20,21,22 ,23 in verscheidene verschillende contexten. Het is ook gebruikt voor niet-invasieve beeldvorming van gene therapie vectoren24,25, en om bij te houden van de cellen in de cardiale4, hematopoietische26, ontsteking5en neurale studies27. Onlangs, NIS is ook gebruikt als een verslaggever gen voor het bijhouden van kanker uitzaaiingen in vivo3,6.

In het kort, de belangrijkste voordelen van deze methode ten opzichte van de voorgaande technieken zijn: (i) gevoelige niet-invasieve 3D in vivo lokalisatie en kwantificering van metastatische verspreid, (ii) geautomatiseerde productie van [18F] BF4- op hoge molaire activiteiten, (iii) een significante vermindering van vereiste dieren door longitudinale imaging, (iv) de overname van de gekoppelde gegevens van de latere imaging sessies, wat resulteert in verbeterde statistische gegevens, die op zijn beurt verder dierlijke gebruik, en (v vermindert) de intrinsieke optie voor ex vivo bevestiging van kankercellen in weefsels door cytometry of fluorescentie microscopie.

Protocol

Dit protocol voldoet aan alle eisen die aan de wetgeving van het Verenigd Koninkrijk (UK) en de lokale ethische evaluatie paneel. Wanneer dit protocol, zeker de procedures voldoen aan alle vereisten ingegeven door nationale en lokale ethische evaluatie paneel. Zorgen elk experiment met radioactiviteit is volgzaam met wetgeving en plaatselijke regels en veilig uitgevoerd.

1. engineering en karakterisering van kankercellen te spreken van de radionuclide-fluorescentie fusion verslaggever NIS-FP

Opmerking: Om redenen van eenvoud mEGFP A206K wordt afgekort als "GFP", en mCherry als "RFP" in de volgende secties van dit protocol.

  1. Generatie van lentivirale deeltjes
    1. Voor de productie van lentivirus deeltjes, co transfect 293T cellen met de volgende vier plasmiden met behulp van een geschikte transfectie methode: (i) het gen van de verslaggever plasmide-codering (pLNT SFFV NIS-GFP of pLNT SFFV NIS-RFP (Zie aanvullende informatie), (ii) de derde generatie lentivirale verpakking plasmiden pRRE en (iii) pRSV-Rev, en (iv) een virus envelop met plasmide, bijvoorbeeld, pMD2.G. Pre-mix plasmiden voordat u deze toevoegt aan de transfectie mix. Uitvoeren van transfectie in een cel cultuur kap.
      Opmerking: Extra transfectie informatie wordt verstrekt in aanvullendeinformatie.
    2. Beoordelen transfectie succes na 48u door standaard breed-gebied fluorescentie microscopie met filterinstellingen die geschikt is voor de gekozen fusion verslaggever (NIS-GFP of NIS-RFP).
      Opmerking: Fluorescentie signalen zijn indicatief van reporter gene transfectie en daarom alleen een surrogaat voor succesvolle co transfectie, niet een indicator van de succesvolle virus productie.
    3. Oogst van het virus deeltje-bevattende supernatant met behulp van een injectiespuit en zwevende cellen en cel puin door filteren door middel van een 0,45 µm steriele polyethersulfon (PES) filter verwijderen. Overbrengen naar een steriele 1,5 mL polypropyleen reactiebuis. Werken met het virus in een cel cultuur kap en ervoor te zorgen dat geen levend virus verlaat de omgeving.
  2. Transductie en selectie van NIS-FP waarin kanker cellijnen
    1. Gebruik pure verse virus vanuit stap 1.1.3 gemengd 1:1 (v/v) met het optimale groeimedium van elke kanker cel regel (DMEM voor MDA-MB-231 cellen en RPMI 1640 voor 4T1 cellen; zie tabel materialen voor media samenstelling). Signaaltransductie in een cel cultuur kap uitvoeren.
      Opmerking: Een meer algemene protocol is in bedoelde aanvullendeinformatie.
    2. Transduce van de kankercellen met virus-bevattende medium in een broedmachine met bevochtigde sfeer met 5% (v/v) CO2 bij 37 ° C gedurende 72 uur (werk op 6-well of 12-well schaal met behulp van 1 mL of 0.4 mL van het mengsel van het virus uit stap 1.2.1).
    3. Target cel NIS-FP expressie door fluorescentie microscopie volgen.
    4. Uitbreiden met succes getransduceerde cellen op een schaal van 3-10 miljoen cellen met behulp van standaard kweekomstandigheden (Zie ATCC voor cellijnen MDA-MB-231 en 4T1).
    5. Fluorescentie-activated cell sorting (FACS) gebruiken voor het zuiveren van NIS-FP waarin cellen uit niet-getransduceerde cellen.
      Opmerking: FACS kunnen een bron van mycoplasma infecties; het is raadzaam om te controleren of mycoplasma vóór virus productie en transductie maar ook na FACS en vóór stap 1.3.
  3. Karakterisering van het NIS-FP waarin kanker cellijnen
    1. Bevestig verslaggever expressie door standaard stroom cytometry zoals elders beschreven28.
    2. Bevestig verslaggever integriteit door standaard immunoblotting zoals beschreven elders29.
    3. Analyseren van intracellulaire fusion verslaggever lokalisatie door confocal fluorescentie microscopie.
      Opmerking: Kleuring met of co uitdrukking van een plasmamembraan marker6 en latere co lokalisatie analyse30 vergemakkelijkt deze stap.
    4. Radiotracer opname in NIS-FP cellijnen waarin analyseren.
      Opmerking: Alle radioactieve NIS substraat compatibel met bestaande apparatuur is geschikt, bijvoorbeeld de isotopen jodide (123ik-, 124ik-, 125ik-, 131ik-), 99 m TcO4-, 188ReO4-, [18F] zo3F- of [18F] BF4-.
      1. Zaad 106 gezuiverd cellen in 6-Wells-platen in hun optimale groeimedium (zie tabel van materialen) één dag voorafgaand aan het experiment. Bereiden van alle monsters in drievoud en controlemonsters omvatten: (i) "specificiteit controls", d.w.z. NIS-FP waarin cellen vooraf geïncubeerd met een concurrerende NIS substraat voor het testen van de specificiteit van de opname; (ii) "ouderlijke cel controle", dat wil zeggen de cellen niet uiten NIS-FP maar het ontvangen van radiotracer om te testen van basale opname in ouderlijke cellen.
      2. Op de volgende ochtend wassen cellen eenmaal met serumvrij groeimedium.
      3. Incubeer de cellen in serumvrij groeimedium in aanwezigheid van 50 kBq 99 mTcO4- of [18F] BF4- gedurende 30 minuten bij 37 ° C (1 mL totale volume). Voor specificiteit besturingselementen, vooraf Incubeer de cellen gedurende 30 minuten met de concurrerende substraat NaClO4- (eindconcentratie is 12,5 µM). Houd de concurrerende substraat concentratie gedurende het gehele experiment constant.
      4. De bovendrijvende vloeistof verzamelen en breng 100 µL tot een bereid collectie koker met het label "supernatant".
      5. Wassen van de cellen tweemaal met 1 mL ijskoud-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met Ca2 +/Mg2 +. Verzamelen van elke wassen-oplossing en breng 100 µL van elk in een voorbereide collectie buis met het label "wash1" of "wash2", respectievelijk.
      6. Til de cellen door 500 µL PBS met 0,25% (m/v) trypsine en 0.53 mM EDTA en incuberen bij 37 ° C, totdat de cellen los (Controleer visueel met behulp van een Microscoop) toe te voegen. Spoel de suspensie in een voorbereide collectie buis met het label "cellen". Was de putjes met 500 µL ijskoude PBS met Ca2 +/Mg2 + en toevoegen aan de buis "cellen". Pellet de cellen door middel van centrifugeren (250 x g, 4 min, 4 ° C).
      7. Aantal alle vier typen van het monster uit elk goed met een gamma tegen op de juiste manier ingesteld voor de isotoop van keuze (hier: 99 mTc of 18F).
        Opmerking: Vanwege het grote aantal monsters in deze test, is het aanbevolen om gebruik van een geautomatiseerde γ-teller staat van verval van de automatische correctie.
      8. Gegevens analyseren door optelling van de verkregen gamma graven van monsters van elk putje te bepalen van een telling van de totale radioactiviteit per putje.
        Opmerking: Neem aliquoting in stappen 1.3.4.4 en 1.3.4.5 rekening door vermenigvuldigend getallen door de 10 voor "supernatant", en "wassen" breuken.
      9. Cellulaire radiotracer opname wordt uitgedrukt als % opname zoals aangegeven in Equ.1. Het berekenen van gemiddelden en standaardafwijkingen van de drievoudige experimenten.
        Equation 1(Equ.1)
        Opmerking: Hier, verslaggever validatie experimenten worden beschreven, maar niet-verslaggever-gerelateerde cellulaire functies (b.v. proliferatie, kanker cel invasie, genexpressie etc.) zijn uiteindelijk toepassingsspecifieke en de verantwoordelijkheid van elke gebruiker.

2. deinvoeringvan in vivo tumor modellen

  1. Gebruik alleen volledig gekenmerkt en gevalideerde cellen voor in vivo experimenten. Fluorescentie van cellen vóór de toediening controleren door een geschikte techniek (b.v. fluorescentie microscopie, stroom cytometry) op elke gelegenheid.
  2. Het model van de tumor in 5-6 weken oud young-adult vrouwelijke muizen vast. BALB/cAnNCrl of BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu (BALB/c naakt) muizen gebruiken voor het 4T1 tumor model en knik. CG-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ (NSG) muizen voor de tumor MDA-MB-231-gebaseerde model. Scheren van dieren lokaal en aseptische techniek gebruiken. Rechtstreeks injecteren 50 µL van een schorsing met 106 NIS-FP waarin kanker cellen/mL in de borstklier vet pad tussen de vierde en de vijfde tepel31.
    Opmerking: Ter verbetering van nauwkeurigheid van de injectie, is het aanbevolen de injectie onder narcose met behulp van een inhaleerbare verdoving zoals Isofluraan (1-2% (v/v) in O2) uitvoeren.
    Opmerking: Chirurgische implantatie van tumor stukken uit NIS-FP waarin tumoren is een alternatieve benadering tumor model vestiging31.
  3. Fluorescentie van cellen op injectie sites na toediening en in de vroege dagen post injectie te controleren. Gebruik een fluorescentie torch en filter glazen geschikt voor de FP keuze.
  4. Bewaken van tumorgroei en controleer of geen klinische symptomen (met name op latere tijdstippen).
    Opmerking: Voor oppervlakkige tumoren, d.w.z. de orthotopic borstkanker tumoren in dit protocol, gebruik remklauwen en de formule voor de gemiddelde tumor diameter (MTD) = ½· (L + W) 32.

3. productie van [18 F] BF 4- met behulp van een geautomatiseerde radiotracer synthese (ARS) platform.

Opmerking: Hier, de geautomatiseerde [18F] BF4- synthese op basis van de methode van 18F aanvulling op boortrifluoride wordt beschreven. Gebruikers van een grotere schaal beschikbaar ARS-platform (zie tabel of Materials), de bijbehorende Extensible Markup Language (XML)-bestand dat is vereist voor het uitvoeren van de automatische volgorde op dit platform (aanvullende bestand) kunt downloaden. Een gedetailleerde uitleg van de indeling van de cassette afgebeeld in Figuur 1 is (tabel 1) waarin naast een gedetailleerde beschrijving van elke stap in het xmldossier sequentie (tabel 2) ter ondersteuning van de vertaling naar een ander geautomatiseerde platform.

  1. Instellen van het ARS-platform zoals beschreven in tabel 1 en ervoor te zorgen is operationeel met de juiste XML-bestand geladen op de computer van de controle. Ervoor zorgen dat het ARS-platform wordt geplaatst in een chemische kap geschikt voor veilig werken met een GBq hoeveelheid radioactiviteit.
  2. Gecombineerd de cyclotron-geproduceerde [18F] F- (meestal 1,5-2 GBq in 2-7 mL [18O] H2O) via het inlaat reservoir (V6).
  3. Val de radioactiviteit op een anion uitwisseling hars (bijvoorbeeld quaternaire ammoniumzouten anion uitwisseling cartridge; V5 naar V4), herstellen de [18O] H2O in een aparte flesje (V1).
  4. Elueer de [18F] F- (omgekeerde elutie, V5 naar V4) in de reactor (V8) met 750 µL van zoutoplossing 0,9% (m/v) (V2), gevolgd door 1,5 mL acetonitril (V16).
  5. Verwijder het water door Azeotropisch verdamping onder vacuüm en stikstof stroom door verhitting op 105 ° C dan 120 ° C gedurende 5 minuten.
  6. Verlaag de temperatuur van de reactor tot 80 ° C.
  7. 800 µL van 15-kroon-5 in watervrij acetonitril (46 mg, 0.21 mmol) toevoegen aan de droge [18F] F- via de centrale poort van de reactor (V8).
  8. Voeg 850 µL van BF-3. OEt2 in watervrij acetonitril (0.16 mg, 1.13 µmol) naar de reactor.
  9. Reageren voor 5 min terwijl terug te keren naar kamertemperatuur.
  10. Pass het reactiemengsel door een cartridge aluminium oxide (V17 tot V18) te vangen van de trifluoroborate.
  11. Het reactiemengsel terug naar spuit S2 en Verdun met water (ca. 1,6 mL).
  12. Laat het reactiemengsel van de via een tweede anion uitwisseling cartridge (V19 naar V20) te vangen het [18F] BF4- product.
  13. Wassen van de reactor met water (ca. 5,5 mL).
  14. Laat de resulterende oplossing door de aluminiumoxide en tweede anion uitwisseling cartridges.
  15. Spuiten S2 en S3 met water spoelen.
  16. De tweede anion uitwisseling cartridge met water wassen en droog het met stikstofgas.
  17. Elueer van het product (V19 naar V20) met 1 mL 0.9% NaCl (V14) in syringe S3.
  18. Het product (400-500 µL) via de uitgang line (V21) naar een 1 mL glas collectie flacon overbrengen.
    Opmerking: Molaire activiteit is een belangrijk aspect van elke radiotracer. Echter vastbesloten routine is niet alleen tijdrovend maar vereist ook aanzienlijke bedragen van de vers gesynthetiseerde [18F] BF4-, zodanig dat er een beperkende factor voor het aantal dieren dat image kan worden gemaakt. Voor het testen van de reproduceerbaarheid en molaire activiteiten van de resulterende [18F] BF4-, het is aanbevolen om een paar speciale test-runs plannen voor dit doel. Voor meer informatie over molaire activiteiten, Raadpleeg de sectie discussie.

4. in vivo imaging NIS-FP uiting te geven aan cellen door nanoPET/CT

  1. Dierlijke voorbereiding
    1. Anesthetize muizen met 1,5-2,0% (v/v) Isofluraan in O2 op een debiet van 1.0-1.5 L/min bij een inductie-kamer. Om te controleren op voldoende verdoving zoekt in de afwezigheid van de pedaal reflex.
    2. Zorgen om toe te passen dierenarts zalf op dierlijke ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving
    3. Beweeg de muis naar een verwarming pad met de neus in een verdoving levering masker en warm de staart (bijvoorbeeld door dompelen het in 37 ° C water of gebruik een infraroodlamp licht).
    4. Verdun de vers bereide steriele gefiltreerd [18F] BF4- oplossing voor 5 MBq per 50 µL met steriele zoutoplossing 0,9%.
    5. Met behulp van een injectiespuit aangesloten op een hypodermische naald (gauge 29-31), trekken 100 µL van de oplossing [18F] BF4- , meten van de radioactiviteit in de spuit en noteer de waarde en de tijd van de meting.
    6. Intraveneus 50 µL van de [18F] BF4- -oplossing te beheren in de voorverwarmde staart ader.
    7. Meten van de resterende radioactiviteit in de spuit en noteer de waarde en de tijd van de meting. Het verschil tussen waarden gemeten op stap 4.1.7 en 4.1.5 is de ingespoten dosis (ID).
    8. Stel de timer af te tellen vanaf 45 min (begintijd voor PET imaging = 0 min).
    9. Plaatst u de muisaanwijzer op het bed van de nanoPET/CT-scanner en zorgen voor dat de verdoving levering is correct opnieuw aangesloten.
    10. Selectievakje verdoving blijft volledig door te testen voor de afwezigheid van de pedaal reflex.
    11. Zorgen dat de muis is geplaatst op het bed op de gewenste manier, bijvoorbeeld de "sfinx"-zoals positie.
    12. Dierlijke controle apparaten volgens de aanbevelingen van de fabrikant, bijvoorbeeld een rectale temperatuursonde, een sonde voor het meten van dierlijke ademhaling, of elektroden voor het opnemen van elektrocardiogrammen installeren. Controleer de werking van alle instrumenten.
      Opmerking: Voor de specificiteit van de in vivo tests met de NIS radiotracer [18F] BF4-, dieren zijn beeld zoals hierboven beschreven, en vervolgens rustte wakker totdat de radioactiviteit heeft voldoende verval om te worden beschouwd als te verwaarlozen, bv 48 h later als enige 1.3·106% resterende 18F radioactiviteit in het dier aanwezig zal zijn. In de daaropvolgende imaging sessie, de concurrerende substraat ClO4- wordt toegediend in een dosis van 200 mg/kg 30 minuten vóór de toediening van de radiotracer en beeldvorming wordt uitgevoerd zoals hierboven beschreven.
  2. Beeldvorming door nanoPET/CT
    1. De gewenste CT beeldvorming parameters instellen, bijvoorbeeld met behulp van de nanoPET/CT 55 kVp buis spanning, stelt u de belichtingstijd op 1200 ms met hoekige intensivering van een graden en 180 graden projecties.
    2. De parameters voor PET Beeldacquisitie instellen. Gebruik statische scan PET parameters met een duur van 30 min, 1:5 toeval modus en 400-600 keVp energie venster.
    3. Bij aftellen = 15 min begin CT Beeldacquisitie.
    4. Bij aftellen = 0 min begin PET Beeldacquisitie.
      1. Als seriële dierlijke beeldvorming is herstellen vereist, laat dieren volledig van anesthesie, d.w.z. herwinnen bewustzijn onder toezicht. Vervolgens overbrengen naar een eenheid van onderhoud.
      2. Als dit de terminal sessie imaging, gaat u verder met dierlijke euthanasie door beide verdoving overdosis, stijgende concentratie kooldioxide of dislocatie van de nek.

5. in vivo data-analyse

  1. De PET/CT-gegevens met behulp van Monte Carlo-based volledige 3D iteratief algoritme te reconstrueren. Ervoor zorgen dat de correcties voor demping, dode tijd en isotoop verval worden beschouwd. Voor details naar de instructies van de fabrikant van het instrument van de PET/CT in gebruik verwijzen.
  2. Selectievakje CT en huisdier beelden zijn mede correct geregistreerd en sla de gegevens in een geschikt uitwisselingsformaat zoals 'Digital Imaging and Communications in Medicine' (DICOM).
  3. Analyseren van beelden
    1. De gereconstrueerde DICOM-bestanden laden naar een geschikte afbeelding analysesoftware waarmee de erkenning en de afbakening van regio's van belang (ROIs) en de daaropvolgende kwantificering van PET signaal in deze ROIs.
    2. Het definiëren van ROIs33,34 met behulp van een geschikte softwarepakket met behulp van handmatige of adaptive thresholding ROIs segment. Anatomische beeldinformatie van de CT-scan helpt gids ROI toewijzing, bijvoorbeeld oppervlakkige tumoren of Long volumes.
    3. Gebruik de analysesoftware volgens de aanwijzingen van de fabrikant en zorgen voor gegevens zijn gekalibreerd om de dosis ingespoten radioactiviteit en gecorrigeerd voor demping en radioactief verval.
  4. Loting grafieken weergegeven: gegevens van deze in vivo kwantificering. Uitdrukkelijke gegevens als beide procent ingespoten dosis/volume (%ID/mL) of standaard opname waarde (SUV), dat wil een alternatieve maatregel zeggen overweegt de radioactiviteit in het hele lichaam van het onderwerp.
    1. Berekenen van de waarden van de %ID/g ervan uitgaande dat de dichtheid van het weefsel te zijn zoals water, d.w.z. ~ 1 g/L. Het is opmerkelijk dat deze veronderstelling ongeldige voor organen met aanzienlijk verschillende dichtheden, zoals Long of bot kunnen.
    2. Berekenen van verschillende SUV's voor het inschatten van de ware SUV (bv. SUVmean, SUVmax); SUVmax is meer betrouwbaar voor kleine objecten en is vaker gebruikt dan SUVmean35.

6. ex vivo analyses

De beursgenoteerde downstream-analyses uitvoeren: (i) fluorescentie beeldvorming van organen met fluorescerende kankercellen (primaire tumor en metastasen) tijdens een dierlijk dissectie, (ii) de meting van radiotracer weefsel distributie, en (iii) histologische of (iv) cytometrische beoordeling van kanker organen.

  1. Meting van radiotracer verdeling γ-tellen (ex vivo ook) en ex vivo fluorescentie beeldvorming van kanker weefsels.
    1. Meten van de radioactiviteit van het hele dode dier en noteer de waarde en de tijd.
    2. Ontleden van de dieren en de oogst van de volgende weefsels: longkanker, hart, bloed (met 20 mm glas haarvaten), lever, maag, nieren, milt, kleine en grote darmen, schildklier en speekselklieren, een stukje spier van het been en been van de achterzijde dijbeen, en relevante en dissectible lymfklieren en kanker weefsels.
    3. Meten van de radioactiviteit van het resterende karkas eerst inclusief en exclusief de staart en noteer de waarden en de tijden van de meting.
      Opmerking: Radioactiviteit in de staart kan worden beschouwd als gevolg van de radiotracer die verkeerd werd geïnjecteerd en dus haalde niet verkeer; Vandaar, was dit bedrag van radiotracer niet bijdragen aan de ingespoten dosis. De radioactiviteit van de staart fungeert ook als een retrospectieve parameter van injectie kwaliteit.
    4. Weeg alle weefsels (gebruik vooraf gewogen buizen).
    5. Fotograferen van kanker organen bij daglicht en onder fluorescentie licht.
      Opmerking: Gebruik een stand van de camera om de afstand tussen cameralens en orgel constant te houden (of een speciaal commercieel instrument hiervoor gebruiken).
    6. Insluiten van organen/weefsels die bestemd zijn voor downstream histologie in OCT, of dompel ze in formaline voor fixatie. Voor andere downstream toepassingen kan monstervoorbereiding verschillen.
    7. Voorbereiden radiotracer kalibratie standaarden in dubbele, zoals 0 tot en met 1000 kBq [18F] BF4-.
      Opmerking: Kalibratie standaarden zijn nodig om (i) hebben betrekking op de graven van de gemeten per min radioactiviteit waarden (in kBq), en (ii) vereenvoudigen verval correctie; 18 F- kunt vervangen [18F] BF4-.
    8. Het tellen van de radioactiviteit van alle geoogste weefsels met behulp van een γ-teller en radioactiviteit kalibratie standaarden uit stap 6.1.7. Opmerking de tijd van de meting. Als graaf tarieven te hoog zijn (d.w.z. buiten de lineariteit van kalibratie standaard of aangegeven door teveel detector dood keer), de twee monsters radiotracer helft-leven later opnieuw te tellen.
    9. Presenteren gegevens als %ID/g of standaard opname waarden (SUV) (Equ.2).
      SUV = Equation 2 (Equ.2)
    10. Gooi alle geoogste weefsels die niet vereist zijn voor verder stroomafwaarts analyses volgens lokale afvalbeheer regels.
  2. Analyseren van kanker weefsels door cytometry of histologie volgens de voorkeuren van de gebruiker en de standaard protocollen (zoals elders beschreven3,6,28).

Representative Results

De eerste stap vereist genetische manipulatie van de kankercellen van belang. Hier, de resultatenvan lentivirale transductie van metastatische lymfkliertest inflammatoire 4T1 borstkankercellen en menselijke metastatische MDA-MB-231 cellen met lentivirus deeltjes die DNA codering NIS-GFP of NIS-RFP worden weergegeven. Transductie efficiëntie varieerde tussen kanker cellijnen (figuur 2A, linkerkolom). Echter alle resulterende getransduceerde kankercel lijnen werden geselecteerd door FACS zuiverheid (figuur 2A, rechts). Confocale fluorescentie microscopie (figuur 2B) aangetoond juiste plasmamembraan lokalisatie van NIS-FPs. NIS-FP functie werd gekwantificeerd aan de hand van de NIS-geboden radiotracer opname (figuur 2C-2E) en NIS functie gedemonstreerd en specificiteit. Met name geen significante verschillen tussen 4T1. NIS-GFP en 4T1. NIS-RFP waarin cellijnen met vergelijkbare NIS expressie bleken (figuur 2C).

Na volledige in vitro cel lijn karakterisering, tumor modellen werden opgericht met de nieuw gegenereerde traceerbaar kanker cellijnen. Als voorbeeld, de 4T1. NIS-GFP tumor model, een model voor inflammatoire borstkanker, is hier weergegeven (Figuur 3). In tumor-dragende dieren longitudinale gehele lichaam PET-imaging dan op de hoogte van de progressie van de tumor met inbegrip van metastatische verspreiding (figuur 3B). De PET radiotracer [18F] BF4- was nodig voor imaging en vers geproduceerd in de ochtend van elk huisdier imaging sessie. Synthese van [18F] BF4- werd uitgevoerd met behulp van de beschreven methode van ARS. ~1.6 GBq 18F- werd meestal gebruikt als input en verkregen ~ 244 MBq [18F] BF4- in 40.5±3.9 min (N = 17). Het product was geanalyseerd door radio Dunnelaagchromatografie of ion-chromatography en toonde een radiochemische zuiverheid van 94.7±1.4%. De radiochemische opbrengst was 19.4±4.0% (verval-gecorrigeerd).

Op dag 19 na inoculatie van de tumor, de primaire tumor was duidelijk geïdentificeerd met behulp van PET, maar vond geen metastasen. Tien dagen later (dag 29), de dezelfde tumor-dragende muizen waren opnieuw verbeelde en verre metastase op verschillende locaties in alle dieren (Long metastase, uitzaaiing naar verschillende Lies en/of axillaire lymfeklieren) werden geïdentificeerd. Het voorbeeld in Figuur 3 toonde uitgebreide Long metastase met verschillende duidelijk herkenbare en meetbare knobbeltjes in de longen (figuur 3B-3E). Bovendien, het dier aangeboden met regionale verspreiding van de tumor in de peritoneale muur evenals metastase de inguïnale en beide oksellymfeklieren. % Id-waarden van afzonderlijke metastasen in de longen (figuur 3E) verschilde sterk, maar dat deed de bezette delen van de onderliggende metastatische knobbeltjes. %ID/mL volume-genormaliseerde waarden (figuur 3E) waren daarentegen veel meer uniform. Dit was begrijpelijk voor verschillende metastasen in soortgelijke ontwikkelingsstadia (dwz ontwikkeld tussen dagen 19 en 29; Figuur 3B). In tegenstelling, was de waarde van het genormaliseerde %ID/mL voor de primaire tumor lager dan die voor de Long metastasen, die strookt met de massa van een tumor die had meer tijd om vooruitgang en remodelleren met inbegrip van de toestroom van andere celtypes (stromale cellen, immune cellen) , met name in dit model van inflammatoire borstkanker.

Geleid door de in vivo afbeeldingen en de fluorescentie van kankercellen (zichtbaar tijdens een dierlijk dissectie onder fluorescentie licht), kleine diepliggende organen zoals lymfeklieren waren betrouwbaar geoogst en op hetzelfde moment, beoordeeld voor kanker knobbeltje inhoud ( Figuur 4A). Terwijl het signaal van de fluorescentie tijdens dierlijke dissectie werd indicatief tumor cel aanwezigheid, was het belangrijk om ervoor te zorgen dat deze classificatie werd vergezeld door ex vivo radioactiviteit metingen van de geoogste weefsels. Figuur 4B toont standaard opname (SUV) verkregen waarden voor de verschillende weefsels in een cohort van drie dieren, die allemaal gepresenteerd met metastase. Endogeen NIS-uiten organen zoals de schildklier en de speekselklieren (geoogst gecombineerd) of de maag bleek ook de opname van de verwachte hoge radiotracer. Bovendien, deze NIS-FP-benadering toegestaan eenvoudig kanker cel identificatie tijdens histologie (figuur 4C). Deze immunofluorescentie histologie voorbeeldgegevens toonde vascularisatie van de tumor in de 4T1. NIS-GFP tumor model. Deze gegevens toonde ook aan dat de verslaggever van de NIS-GFP verbleven vooral in de membranen van het plasma van de tumor ook in vivo (figuur 4C) cellen, waardoor de opname resultaten te valideren.

Figure 1
Figuur 1. Regeling waarin de opzet van de geautomatiseerde radiotracer synthese platform voor de productie van [18F] BF4- via de methode van de toevoeging fluor-18-naar-boortrifluoride. Reagens namen worden afgedrukt op de respectieve buizen in de regeling. QMA is de afkorting voor quaternaire ammoniumzouten anion uitwisseling en geeft het materiaal gebruikte solid-phase chromatografische scheiding. Meer details zijn beschikbaar in de tabellen 1 en 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. De resultaten van de karakterisering van het typische van kanker cellijnen stabiel uiting van NIS-GFP of NIS-RFP. (A) de aangegeven cellijnen werden gemaakt met behulp van lentivirussen overdracht van NIS-GFP of NIS-RFP. De linkerkolom toont de getransduceerde bevolking (groen of rood fluorescerende) in vergelijking met de respectieve ouderlijke cellen (grijs, 4T1 en MDA-MB-231 cellen, respectievelijk). Percentages weergeven transductie efficiencyverbeteringen zoals bepaald door de stroom cytometry De rechterkolom toont de resultaten van stroom cytometrische analyses na FACS zuivering van de gemengde bevolking in de linkerkolom. Alle cellijnen bleken > 99% zuiver voor NIS-uiten cellen (door stroom cytometry) aangegeven. (B) Confocal fluorescentie microscopie van gezuiverde cellijnen toont plasmamembraan lokalisatie van NIS-GFP of NIS-RFP in de respectieve cellijnen. WGA-Alexa633 werd gebruikt als een marker plasmamembraan. (C, D) Functionele validering van NIS-FP eiwit uitgedrukt in de aangegeven nieuw gegenereerde kanker cellijnen. NIS functie werd gemeten met behulp van de radiotracer 99 mTcO4- (50 kBq per miljoen cellen). Als besturingselementen, werden ouderlijke cellen gebruikt evenals fusion verslaggever waarin cellen die werden behandeld met de NIS co substraat perchloraat vóór en tijdens de test (specificiteit control). Resultaten tonen duidelijk aan NIS-FP functie en specificiteit in alle cellijnen. (E) functionele validering van 4T1. NIS-FP cellijnen gebruik [18F] BF4- als een radiotracer voor NIS. Alle andere voorwaarden waren identiek aan (C). Bovenal rechtvaardigen zeer vergelijkbaar relatieve opname resultaten werden bekomen voor beide 4T1-afgeleide cellijnen met beide radiotracers (figuur 2C en E), waardoor het verwisselbare gebruik van zowel voor in vitro functionele karakterisering van NIS-FP waarin cellijnen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Representatief resultaat van metastase tracking door [18F] BF4--PET/CT beeldvorming in een muis met een 4T1. NIS-GFP tumor. (A) één miljoen 4T1. NIS-GFP cellen waren geïnjecteerd in de borstklier dikke pads van 5-6 weken oud BALB/c CanN.Cg-Foxn1nu/Crl muizen en tumorgroei werd gevolgd in de tijd met behulp van de remklauwen. Als gevolg van het GFP-fluorescentie van de kankercellen was ruwe visuele identificatie/groei beoordeling ook mogelijk met een fakkel fluorescentie en geschikte filter glazen (zie inzet). (B/links) Op dag 19 post tumor inoculatie, was de primaire tumor (gele stippellijn) duidelijk maar geen metastase. Het beeld gepresenteerd is een projectie van maximale intensiteit (MIP) van de afbeelding van de PET. Endogene NIS signalen (witte descriptoren) werden ook geregistreerd, dat wil zeggen de schildklier en speekselklieren (Th + SG), de maag (S), en, op een zeer laag niveau, sommige delen van de borstklier en lachrymal klieren. Het signaal van de blaas (B) vloeit voort uit de tracer uitscheiding. (B/rechts) Op dag 29 post tumor inoculatie, metastase was duidelijk: meerdere uitzaaiingen in de longen (gele stippellijn) evenals metastatische lymfklieren (ILN, AxLN; gele pijlpunten). Het beeld gepresenteerd is een MIP van de PET/CT-afbeelding. De primaire tumor (gele stippellijn) groeide niet alleen in een bolvormige vorm op dit punt van tijd, maar ook in de peritoneale muur was binnengevallen. (C) een 3D uitvoeringvan de Otsu drempelmethode techniek ingeschakeld 3D-oppervlak rendering van de kanker weefsels; Deze zijn bovenop op de MIP van een huisdier. Long metastasen staan in wit, gemetastaseerde axillaire lymfeklieren in het rood, de metastatische inguïnale lymfeklieren in geel en de primaire tumor die in de peritoneale muur in turkoois binnengevallen. (D) een blow-up afbeelding van de PET/CT MIP in (B/rechts) om aan te geven van individuele Long metastasen. (E) Radiotracer opname in kanker weefsels was gekwantificeerd van 3D-beelden (% ID) en genormaliseerd door hun respectieve volumes (%ID/mL). Individuele Long metastasen komen overeen met de nummering in (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Typische voorbeelden van ex vivo gegevens toegankelijk van NIS-FP tumor-dragende muizen. (A) tijdens het weefsel oogsten voor downstream analyses, de fluorescerende eigenschappen van de tumorcellen uit de NIS-FP-waarin diende als een indicator dierlijke dissectie begeleiden. Exemplaren, weefsels uit het dier in Figuur 3, dat wil zeggen de longkanker met diverse metastatische laesies en twee positieve lymfeklieren zijn vermeld. Daglicht fotografie evenals fluorescentie beelden worden getoond. De fluorescentie-beelden werden genomen met dezelfde camera als de daglicht beelden maar onder blauw licht excitatie (450±10 nm bandfilter filter) met een groene emissie-filter (530±30 nm bandfilter filter) voor de lens van de camera geplaatst. (B) verdeling van de radiotracer in verschillende organen ('ook') van dieren met 4T1. NIS-GFP tumoren (N = 3, dag 29 post tumor inoculatie; 5 MBq [18F] BF4-). Standaard opname waarden (SUV) werden berekend en waarden > 1 geven specifieke accumulatie van radiotracer in de respectieve organen. De gegevens wijzen specifieke radiotracer opname kanker weefsels, d.w.z. primaire tumor, gemetastaseerde lymfklieren (zoals aangegeven door beeldvorming en dissectie onder fluorescentie licht), Long (werd ontleed als een geheel zonder te scheiden van de individuele metastasen), evenals organen endogeen uiting van NIS, d.w.z. schildklier en speekselklieren en maag. (C) immunofluorescentie histologie van de primaire tumor van de dezelfde muis zoals afgebeeld in Figuur 3. De primaire tumor was geoogst, ingebed in de OCT en bevroren voordat ze verdeelde (10 µm) en verwerkt voor de kleuring. NIS-GFP waarin kankercellen waren rechtstreeks geïdentificeerd zonder de noodzaak van het antilichaam kleuring. Bloedvaten werden gekleurd met een konijn antilichaam tegen muis PECAM-1/CD31 (2 µg/mL) en een geit Cy5-geconjugeerde anti-konijn secundair antilichaam. Kernen werden gekleurd met 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole (1 µg/mL) en het monster gemonteerd in poly (vinylalcohol - vinylacetaat) met 2,5% (m/v) Dabco als een antifade. Confocale beelden werden verkregen met behulp van een confocal microscoop met instellingen geschikt zijn voor 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole, GFP en Cy5. Deze voorbeeldgegevens duidelijk tonen aan dat de 4T1. NIS-GFP tumor is gevacuoliseerd maar dat vascularisatie verschilt ook de omvang ervan (Zie linksboven met de onderkant midden). Het toont ook aan dat de NIS-GFP-verslaggever overwegend bevindt zich in de membranen van het plasma van de tumor cellen in vivo (inzet), waardoor de opname in vitro resultaten te valideren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

FASTlab inlaatspruitstuk klep Reagens, oplosmiddel, cassette of leidingen * Details
V1 Silicone slangen tot [18O] H2O afval fles 14 cm
V2 0.9% NaCl-oplossing, 750 µL 11 mm flacon
V3 Spuit S1 1 mL
V4 anion uitwisseling cartridge C1, vooraf geconditioneerd met 1 M NaCl (10 mL) en H2O (10 mL) bv Sep-Pak Accell Plus QMA Plus licht (wateren, kat. Nr. WAT023525)
V5 Silicone slangen aan anion uitwisseling patroon C1 14 cm
V6 [18O] H2O /18F inlaat reservoir Max 5 mL
V7 Silicone slangen op reactor vaartuig (linkerzijde; gas inlaat) 14 cm
V8 Silicone slangen op reactor vaartuig (centrale poort; vloeibare inlaat/uitlaat) 14 cm
V9 Gesloten
V10 Gesloten
V11 Spuit S2 5 mL
V12 kroon-5-15, 46 mg in 800 µL acetonitril 11 mm flacon
V13 Trifluoroborate diethyl etherate, 0,14 µL in 850 µL acetonitril (verdund 14 µL van BF-3. OEt2 met 1 mL acetonitril. Verdun 10 µL van deze oplossing tot 850 µL met MeCN). 13 mm flacon
V14 0.9% NaCl-oplossing, 1 mL 13 mm flacon
V15 Waterzak spike
V16 Acetonitril (MeCN), 1,5 mL 13 mm flacon
V17 Silicone slangen aan aluminiumoxide neutrale patroon C2 14 cm
V18 Aluminiumoxide neutrale cartridge C2, vooraf geconditioneerd met H2O (10 mL), aceton (10 mL) en lucht (20 mL) bv Sep-Pak Alumina N Plus licht (wateren, kat. Nr. WAT023561)
V19 Silicone slangen aan anion uitwisseling patroon C3 14 cm
V20 anion uitwisseling cartridge C3, vooraf geconditioneerd met 1 M NaCl (10 mL) en H2O (10 mL) bv Sep-Pak Accell Plus QMA Plus licht (wateren, kat. Nr. WAT023525)
V21 Silicone slangen aan collectie flacon 40 cm
V22 Gesloten
V23 Gesloten
V24 Spuit S3 5 mL
V25 Silicone slangen op reactor vaartuig (rechterkant; vacuüm poort) 40 cm
* Let op: Vanwege de kunststof spikes, de dood volume voor flesjes van 11 mm en 13 mm flesjes is ongeveer 0.35 mL en 0.4 mL, respectievelijk. Daarom is de werkelijke bedragen van reagentia overgebracht naar de reactor zijn iets anders. Alle hoeveelheden aangegeven in deze methode refereren aan de werkelijke bedragen in elk reagens flesje geïntroduceerd.

Tabel 1. Beschrijving van de indeling van de cassette voor de synthese van de geautomatiseerde [18F] BF4- via de fluor-18-naar-boortrifluoride toevoeging methode (Zie Figuur 1).

Reeks stappen Commentaar
[1 - 2] Druk uitoefenen op het systeem en spoelen de variëteit met N2
[3-15] Spoelen spuit S3 tweemaal met H2O (V15), spoelen de variëteit met N2
[16-23] Druk uitoefenen flesjes van de reagens in posities V16, V14 en V12, V13 afboeken van de variëteit met N2 tussen elke flacon
[24-26] Open de inlaat van de activiteit (V6)
Sluit de flacon met 18F. Als het totale volume > 5 mL is, alleen invoegen de naald halfweg de flacon voordat u verdergaat.
[27-39] Sluit de activiteit inlaat (V6), val 18F in QMA cartridge C1 (V5), verzamelen de [18O] H2O in de afval fles (V1). Als het totale volume > 5 mL is, de opeenvolgende stap 37, terug te keren naar stap 26, plaats de naald in de flacon met 18F, onderbreken en hervatten van het proces.
[40] Sluit de [18O] H2O afval fles (V1), spoelen de variëteit met N2
[41] Druk uitoefenen op de flacon van de elutievloeistof in positie V2
[42-44] Open reactor ventiel V8, gecombineerd eluens van V2 in spuit S1
[45-50] Elueer QMA cartridge C1 in reactor (V8) met behulp van zout uit spuit S1, stelt u de temperatuur reactor op 90 ° C
[51] QMA cartridge C1 met N2 spoelen en verhogen de reactor temperatuur tot 105 ° C
[52-53] Acetonitril trekken V16 in spuit S2
[54-57] Acetonitril uit spuit S2 overbrengen in de reactor (V8)
[58-60] Verwarm de reactor bij 120 ° C gedurende 5 min. Evaporate het oplosmiddel met een stroom van N2 bij de reactor (V7).
[61-65] Stel de temperatuur op 105 ° C, droog spuit S1 met N2
[66-69] De 15-kroon-5 oplossing trekken V13 in spuit S2, verhogen de temperatuur van de reactor tot 120 ° C
[70-71] Verlaag de temperatuur tot 105 ° C, de variëteit met N2 spoelen
[72] De reactor (set de temperatuur tot 40 ° C) gedurende 5 minuten afkoelen
[73-78] De reactor temperatuur ingesteld op 80 ° C, de 15-kroon-5 oplossing uit spuit S2 overbrengen in de reactor (V8)
[79-81] Trekken de BF-3. OEt2 oplossing vanaf V14 in spuit S2
[82-87] Overdracht van de BF-3. OEt2 oplossing uit spuit S2 de reactor (V8), de regel van de reactor met N2 doorsturen
[88] Spoelen van de variëteit met N2
[89] Reageren voor 5 minuten, laat de temperatuur terug naar RT
[90-95] Het reactiemengsel (V8) overbrengen spuit S2
[96-104] Het reactiemengsel door Alumina N cartridge C2, overgaan in spuit S3
[105] Spoelen van de variëteit met N2
[106-109] Het reactiemengsel terugkomen spuit S2
[110-112] Lege spuit S3, H2O (V15) trekken in spuit S2 om te verdunnen het reactiemengsel
[113-115] Laden van het reactiemengsel op QMA cartridge C3
[116-118] H2O (V15) trekken in spuit S2
[119-124] Spoel de reactor (V8) met H2O uit spuit S2, gecombineerd het waswater in spuit S2
[125-128] Doorgeven van het waswater via cartridges C2 en C3
[129-130] Droog de cartridges en de variëteit met N2
[131-136] Wash spuit S1 met H2O (V15)
[137-142] Wash spuit S2 met H2O (V15)
[143] Spoelen van de variëteit met N2
[144-147] H2O (V15) trekken in spuit S2
[148-151] QMA cartridge C3 met H2O spoelen uit spuit S2
[152-153] QMA cartridge C3 met N2 droog en spoel de variëteit met N2
[154-157] Elueer QMA cartridge C3 met 0,9% NaCl (V14) in spuit S3
[158-161] Het product uit spuit S3 overbrengen in de collectie flacon (V21)
[162-163] QMA cartridge C3 met N2 naar de collectie flacon (V21) doorsturen
[164-166] Spoelen van de variëteit met N2
[167-170] Flush cartridges C2 en C3 (om afval fles) en de variëteit met N2
[171] Spoelen van de collectie buis (V21) met N2

Tabel 2. Beschrijving van de stappen in het xmldossier volgorde.

Discussion

De eerste stap om te renderen kanker cellen traceerbaar in vivo door deze methode vereist hen om uit te drukken van de NIS-FP fusion verslaggever engineering. De keuze van de TL proteïne in de fusie-verslaggever is van cruciaal belang als oligomerizing van fluorescente proteïnen tot kunstmatige verslaggever clustering leiden kan, daardoor negatief beïnvloeden zijn functie. We hebben succes met bewezen monomeer fluorescente proteïnen zoals mEGFP (met de monomerizing mutatie A206K36,37), mTagRFP of mCherry. NIS kan van mens of muis oorsprong (hNIS of msNIS) afhankelijk van het doel van het experiment en het model van de kanker. Transductie efficiëntie variëren over het algemeen tussen verschillende kanker cellijnen. Gegenereerde kanker cellijnen zijn echter vervolgens gezuiverd door FACS in dit protocol, waardoor de noodzaak voor het optimaliseren van de transductie voorwaarden. Transductie met hoge multipliciteit van infectie is niet altijd aan te raden, aangezien meerdere construct integratie in het genoom is waarschijnlijk resulteren niet alleen in hogere construct-expressie, maar ook in meer ongewenst/niet-gereglementeerde genoom wijziging. Daarom is het belangrijk om te laten polyclonal getransduceerde cellen groeien tot stabiliteit van meningsuiting (gecontroleerd door stroom cytometry) en voorkomen het helderste klonen alleen door FACS sorteren. Ook rendert functionele validering van niet-reporter functies cruciale voordat deze cellen moeten worden gebruikt voor in vivo experimenten. Een onlangs ontwikkelde alternatief voor virale gen levering is gene bewerken technologie38, waarin meer specifieke controle over virale integratie sites biedt. Expressie analyse door stroom cytometry en immunoblotting is belangrijk. Stroom cytometry kunt verwerving van eencellige bevolking gebaseerde gegevens, bijvoorbeeld om te onderzoeken of er eventuele drift in verslaggever expressie niveaus na verloop van tijd. Het berust op de FP groep alleen, tenzij de cellen zijn ook gekleurd met een antilichaam gericht tegen oppervlakte of totale NIS. Stroom cytometry doet niet informeren over fusie verslaggever integriteit. In tegenstelling, verslagen immunoblotting over de integriteit van de fusion-verslaggever. Het molecuulgewicht van de NOS en het KP moet worden toegevoegd aan het bepalen van de verwachte molecuulgewicht van de gekozen NIS-FP. Confocal fluorescentie microscopie aangetoond fusion verslaggever colocalization met het plasma-membraan marker tarwekiemen agglutinin in alle nieuw gemaakt van cellijnen. Dit was de verwachte cellulaire locatie voor het grootste deel van het eiwit en een leidende mijlpaal voor latere functionele validering aangegeven. Als minimale/Nee NIS-FP werd gevonden op het plasma-membraan (bijvoorbeeld alleen in interne cellulaire compartimenten), dit zou duiden op een cel biologische probleem met de verslaggever van de fusie in deze cellijn of een mogelijke mutatie van de verslaggever van de fusie op het gebied van de intracellulaire mensenhandel. Het is opmerkelijk dat we niet in acht genomen dat een geval in een van de kankercellen we getest tot nu toe, waaronder: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (menselijke melanoom); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (menselijke borstkanker); NCI-H1975 (menselijke longkanker); SK-Hep1 (menselijke leverkanker); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (lymfkliertest inflammatoire borstkanker); B16F0, B16F3, B16F10 (lymfkliertest melanoom); MTLn3 (adenocarcinoom van de borst van de rat).

NIS-functie moet worden gemeten met behulp van opname testen met radioactieve NIS substraten. Als gevolg van de SPECT radiotracer 99 mTcO4- wordt generator-geproduceerd en daarom wijd-beschikbaar in ziekenhuizen zonder de noodzaak voor een radiotracer synthese, evenals hebbend van een handiger langere halfwaardetijd (6.01 h voor 99 m TC in vergelijking tot 110 min. voor 18F), hebben we dit substraat NIS gebruikt voor routinematige functionele validering van nieuwe NIS-FP waarin cellijnen. Vooraf het blokkeren van cellen NIS-uitdrukken met de NIS co substraat natriumperchloraat resulteerde in de verwachte verlaging/afschaffing van opname van de radiotracer, waardoor het aantonen van specificiteit van opname van de radiotracer. Deze test van de specificiteit NIS is een kritische validatie stap. Als een NIS specificiteit experiment niet leiden verminderde radiotracer opname vergelijkbaar met de respectieve ouderlijke cellen tot zou, een technische fout tijdens het experiment of de opname van de radiotracer was niet te wijten aan de NIS. Het is ook mogelijk dat natriumperchloraat vooraf blokkeren vermindert de opname van de radiotracer in een cellijn van de ouderlijke; Dit zou cellijnen identificeren met endogene functionele NIS expressie (bijvoorbeeld gestimuleerd schildklier cellen6).

Een cruciaal voordeel van dit imaging protocol is dat de informatie wordt verzameld in 3D en na verloop van tijd. Hierdoor is de vergelijking van de beelden van hetzelfde dier in de tijd, waardoor gekoppelde gegevens en dus het overwinnen van de problemen veroorzaakt door de spreiding over de dieren. Dit staat in contrast met de meest niet-imaging gerelateerde metastase beoordelingsmethoden die zijn gebaseerd op het offeren van verschillende dieren op verschillende tijdstippen. In figuur 3B is het duidelijk hoe metastatische verspreiding en uitgroei na verloop van tijd in een afzonderlijk dier vorderde. De signalen gedetecteerd door PET/CT beeldvorming zijn fundamenteel veroorzaakt door NIS expressie. Dit omvat alle signalen van kankercellen exogenously NIS-uiten evenals alle organen endogeen uiting van NIS. Typische endogene NIS signalen zijn te vinden in schildklier en speekselklieren, de maag, en, op een laag niveau in sommige delen van de borstklier en lachrymal klieren. Naast de endogene NIS expressie, wordt de NIS radiotracer [18F] BF4- ook uitgescheiden via de nieren, waardoor radiotracer opname in urine gevulde blazen uit te leggen. Nier opname is niet meer waarneembaar op de imaging tijdstip in dit protocol (45 min post radiotracer injectie6) aanbevolen. Als signalen uit urine gevulde blazen tot kwesties van de signaal-naar-achtergrond leiden moeten, kan de blaas mechanisch geleegd worden onder verdoving voor imaging. Nog belangrijker is, kunnen de endogene signalen variëren tussen dieren stammen. Het is ook opmerkelijk dat de endogene NIS expressie in de borstklieren hoger onder zogende voorwaarden10kan zijn. In het voorgelegde geval en in het geval van deze metastatische cellijnen met succes gekarakteriseerd vóór (Zie lijst hierboven), vonden wij niet endogene NIS expressie aanzienlijk verstoren metastase detectie. Het is opmerkelijk, dat [18F] BF4- blijft meer beschikbaar voor opname in kanker weefsels ten opzichte van jodide, omdat jodide wordt gemetaboliseerd in de schildklier hormonen6. Dit fenomeen kan ook bijdragen tot grotere hoeveelheden van radioiodide in de bloedstroom in vergelijking met [18F] BF4- 6. Voor verschillende toepassingen (kankercel bijhouden in andere vormen van kanker of niet-kankercel traceringstoepassingen), dit kan verschillen, en daarom is het raadzaam om te beoordelen of endogene NIS expressie dreigt te veroorzaken van signaal-naar-achtergrond kwesties door middel van voorbereidende experimenten. Een belangrijk aspect in de preklinische beeldvorming is de molaire activiteit van de radiotracer. De hier beschreven methode gebruikt ~1.5 GBq 18F- als startende materiële14 en is aangetoond dat het produceren van molaire activiteiten aanzienlijk boven de eerder gemelde vervanging methode12. [18F] BF4- geproduceerd in molaire activiteiten ≤1 GBq/µmol12 kan leiden tot verminderde opname in NIS-uiten weefsels. Dit is van bijzonder belang wanneer de ingespoten hoeveelheid radioactiviteit per kilogram hoog is, d.w.z. als kleine dieren zoals muizen beeld39; het is minder belangrijk in de mens40instellen. Hoge molaire activiteiten zijn daarom noodzakelijk voor kwalitatief hoogwaardige preklinische PET imaging. Molaire activiteiten verkregen door de boor trifluoride toevoeging methode14, die wordt weergegeven in de geautomatiseerde vorm in dit protocol, ondervangen dit probleem. Bovendien, het is opmerkelijk dat de gepresenteerde protocol voor [18F] BF4- synthese niet compatibel met goede praktijken (GMP is) en daarom ongeschikt voor gebruik in menselijke klinische tests in dit formulier. Een GMP-protocol (via de substitutiemethode 18F aan radiolabel BF4-) is beschikbaar elders40.

PET/CT beeldvorming kan de visualisatie van radiotracer opname, die is een indicatie van de NIS-gemedieerde radiotracer opname die voortvloeien uit de NIS-FP waarin kankercellen. Wat nog belangrijker is, kunnen de bijbehorende PET-signalen worden gekwantificeerd. Het is noodzakelijk betrouwbare drempelmethode procedures om te zorgen voor een consequente en onpartijdige differentiatie van relevante signalen van elke mogelijke achtergrond toe te passen. Als de achtergrond in verschillende locaties in vivo varieert, is het belangrijk dat de lokale/regionale drempelmethode en segmentatie. Een dergelijke methode is ontwikkeld door en genoemd naar Otsu34, en de 3D uitvoering ervan is werkzaam voor 3D rendering van de primaire tumor en metastasen in dit protocol. In het algemeen het beeld gezien door de waarnemer visueel overeenkomt met beste de gekwantificeerde % ingespoten dosis (% ID) waarden. Wat betreft beeld-gebaseerde kwantificering is het ook belangrijk om te normaliseren van de radioactiviteit gemeten waarden van de verschillende weefsels naar hun volumes. Er zijn twee voornamelijk gebruikte manieren uitdrukken van genormaliseerde resultaten, (i) % ID per volume (bijvoorbeeld %ID/mL), en (ii) standaard opname waarde (SUV35). Ze verschillen in die zin dat de %ID/mL rekening wordt gehouden met het individuele volume alleen, terwijl SUV is een maatregel die is ten opzichte van de gemiddelde radioactiviteit in het hele dier. Het is ook belangrijk op te merken dat NIS imaging het volume van de levende tumor (LTV) toegankelijk, maakt omdat dode/sterven cellen niet de synthese van ATP niet meer kan radiotracer10 importeren. Dit verklaart het grote gebied van de laag-signaal binnen de primaire tumor ("donut gevormde" tumor) die aangeeft gebieden van tumor cel dood/necrose. Bovenal was LTV een veel betrouwbaarder maatregel van tumor lasten ten opzichte van het ruwe tumor volume toegankelijk door remklauw metingen (die niet rekening account levensvatbaarheid en beoordeelt slechts oppervlakkig tumor regio's).

Een groot voordeel van deze dual-mode-tracking strategie is duidelijk bij het verzamelen van weefsels na ruiming van dieren. Geleid door in vivo afbeeldingen en bijgestaan door fluorescerende kankercellen tijdens dierlijke dissectie, kan kleine en diepgewortelde organen/metastasen ook geoogst worden betrouwbaar. Bevroren weefsel behoud/afdelen methodologie maakt de beeldvorming van de directe fluorescentie van GFP zonder de behoefte van de kleuring met een anti-GFP-antilichaam, maar ten koste van verminderde structurele weefsel instandhouding ten opzichte van formaline-vaste paraffine-ingebedde methodologie (FFPE). De laatste vereist kritisch ook anti-FP kleuring, omdat de FFPE methode incompatibel met intact behoud van fluorescente proteïnen (als gevolg van fixatie/uitdroging/rehydratie is). Hoewel de fluorescentie-signaal is een indicatie van de tumor cel aanwezigheid, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat deze classificatie wordt bevestigd door ex vivo radioactiviteit metingen van de geoogste weefsels ('ook'). Ex vivo radioactiviteit metingen zijn gevoeliger dan visuele detectie van fluorescentie, vandaar kunnen de identificatie van kanker-cel-afhankelijke signalen die anders onopgemerkt zou blijven. In het geval van een terminal sessie imaging, het is van cruciaal belang nauwkeurig vast de ingespoten radiotracer bedragen, alsmede de tijden van radiotracer radioactiviteit metingen, dierlijke injectie, dier slachten, en gekalibreerd Scintillatie teller metingen van geoogste weefsels. Dit is van cruciaal belang om te zorgen voor correctie voor radiotracer verval en daardoor betrouwbare ook analyse.

PET/CT imaging maakt herhaalde niet-invasieve 3D kwantificering van progressie van de tumor met inbegrip van de beoordeling van metastatische verspreid op een niveau van het gehele lichaam. Deze functie is een belangrijk voordeel ten opzichte van conventionele methodes, die vaak afhankelijk zijn van grote cohorten van dieren die voor de beoordeling van de progressie van de tumor op verschillende tijdstippen zijn euthanized. De voordelen van deze beeldvorming gebaseerde benadering zijn: (i) gevoelige niet-invasieve 3D in vivo kwantificering, (ii) een significante vermindering van dierlijke cijfers te wijten aan de mogelijkheid van herhaling imaging, (iii) de overname van longitudinale gekoppelde gegevens uit latere imaging sessies statistieken te verbeteren door met uitzondering van spreiding over de dieren, die op zijn beurt verder dierlijke cijfers vermindert, (iv) geautomatiseerde productie van [18F] BF4- op hoge specifieke activiteiten, en (v) de intrinsieke optie voor ex vivo bevestiging in weefsels door fluorescentie methodologieën zoals microscopie of cytometry.

In vivo cel bijhouden is een groeiende sector. Het heeft zijn aangewakkerd door de recente vooruitgang in de imaging technologie, wat in een verhoogde resolutie, de detectiegrenzen en de multiplex vermogen (via de weergave van het multimodale resulteerde). In dit protocol passen we dit concept voor het bijhouden van de progressie van de tumor met inbegrip van spontane kanker cel metastase in 3D door herhalen imaging. Toepassingen omvatten studies gericht op het ontrafelen van de mechanismen van spontane kanker cel metastase. Bijvoorbeeld kunnen traceerbaar tumorcellen worden gebruikt om het bestuderen van de impact van verschillende immuun celbestanddelen (als heden/functioneel in dierlijke stammen van verschillende niveaus van immunocompromisation) over het proces van metastatische. Ook kan het effect van afzonderlijke genen, hetzij in de dierlijke stam of de kanker cellijn, worden bestudeerd. Bovendien, het voorgestelde protocol kan worden gebruikt om te beoordelen/valideren van de werkzaamheid van bepaalde drugs of therapeutische concepten op tumor progressie. Bovenal dit reporter gene: radiotracer paar voor PET imaging (NIS: [18F] BF4-) kan ook worden gebruikt voor verschillende cel traceringstoepassingen. Verschillende celtherapieën ontstaan bijvoorbeeld momenteel zo veelbelovende therapeutische benaderingen. Het gaat hierbij om cellulaire therapeutiek van kanker behandeling41 , maar ook in de transplantatie42 en regeneratieve geneeskunde43,44 instellingen. Gehele lichaam in vivo cel bijhouden wordt steeds belangrijker voor de ontwikkeling en de klinische vertaling van cellulaire therapeutics, bijvoorbeeld voor de beoordeling van de veiligheid en voor de controle van de therapie.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Het onderzoek werd gesteund door de King's College London en UCL uitgebreide Cancer Imaging Centre, gefinancierd door Cancer Research UK en EPSRC i.s.m. de MRC en DoH (Engeland); het National Institute for Health onderzoek (NIHR) Biomedical Research Centre gebaseerd op Guy's en St Thomas' NHS Foundation Trust en King's College in Londen; het Centre of Excellence in Medical Engineering wordt gefinancierd door de Wellcome Trust en EPSRC onder grant nummer WT 088641/Z/09/Z; een Cancer Research UK multidisciplinaire Project Award voor GOF en PJB en een King's gezondheid Partners subsidie voor GOF. De nanoPET/CT en nanoSPECT/CT-scanners werden gekocht en onderhouden door een subsidie van de apparatuur van de Wellcome Trust. De standpunten zijn die van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs die van de NHS, de NIHR of de DoH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole Thermo Scientific H3570 Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line ATCC CRl-2539 for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter Roche Diagnostics GmbH 5651697001 CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent Sedna Scientific 2501036
CASYton Isotonic Diluent Sedna Scientific 2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 Leica, Wetzlar, Germany Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness VWR International 631-0150
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
DMEM Sigma D5546 Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III  BD Biosciences Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine Sigma G7513 Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells ATCC HTB-26 for details see ATCC website
Mowiol 4-88 Sigma 81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G Addgene #12259 plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE Addgene #12251 packaging plasmid
pRSV-Rev Addgene #12253 packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Penicillin-Streptomycin Sigma P43330 Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate) Polysciences 17951 Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833 From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water 
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge Hettich Lab Technology
RPMI 1640 Sigma R0883 Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm Corning
Syringes 10 mL BD Emerald Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL  Life Technologies Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X  Sigma 59418C (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red 
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate  Life Technologies  W21404 Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper World Precision Instruments 501601
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5 Sigma-Aldrich 188832 CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous) Acros Organics 326811000
Boron trifluoride diethyl etherate Sigma-Aldrich 216607 BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes GE Healthcare FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets Macherey-Nagel 802021 RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light Waters WAT023525 Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light Waters WAT023561 Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP GE Healthcare
Nitrogen filter Millipore SE2M049I05 Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber Vet-Tech AN010R With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system Vet-Tech AN001B Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline Thermo Scientific Oxoid BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger Vet-Tech AN200 VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane  Sigma 59070-1L-D Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 85040C
Cover slips 22×50 mm VWR International SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT SLEE Medical two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson/Stratech 111-175-144 Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35  CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope Nikon Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound  VWR international 361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN Dako UK Ltd Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS) available from various suppliers. Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Brader, P., Serganova, I., Blasberg, R. G. Noninvasive molecular imaging using reporter genes. J Nucl Med. 54, (2), 167-172 (2013).
  3. Fruhwirth, G. O., Diocou, S., Blower, P. J., Ng, T., Mullen, G. E. A whole-body dual-modality radionuclide optical strategy for preclinical imaging of metastasis and heterogeneous treatment response in different microenvironments. J Nucl Med. 55, (4), 686-694 (2014).
  4. Terrovitis, J., et al. Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 52, (20), 1652-1660 (2008).
  5. Seo, J. H., et al. Trafficking Macrophage Migration Using Reporter Gene Imaging with Human Sodium Iodide Symporter in Animal Models of Inflammation. J Nucl Med. 51, (10), 1637-1643 (2010).
  6. Diocou, S., et al. [18F]tetrafluoroborate-PET/CT enables sensitive tumor and metastasis in vivo imaging in a sodium iodide symporter-expressing tumor model. Scientific Reports. 7, (1), 946 (2017).
  7. Lajtos, I., et al. Cold wall effect eliminating method to determine the contrast recovery coefficient for small animal PET scanners using the NEMA NU-4 image quality phantom. Phys Med Biol. 59, (11), 2727-2746 (2014).
  8. Nagy, K., et al. Performance evaluation of the small-animal nanoScan PET/MRI system. J Nucl Med. 54, (10), 1825-1832 (2013).
  9. Deleye, S., et al. Performance evaluation of small-animal multipinhole muSPECT scanners for mouse imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, (5), 744-758 (2013).
  10. Portulano, C., Paroder-Belenitsky, M., Carrasco, N. The Na+/I- symporter (NIS): mechanism and medical impact. Endocr Rev. 35, (1), 106-149 (2014).
  11. Dohan, O., et al. The sodium/iodide Symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocr Rev. 24, (1), 48-77 (2003).
  12. Jauregui-Osoro, M., et al. Synthesis and biological evaluation of [F-18]tetrafluoroborate: a PET imaging agent for thyroid disease and reporter gene imaging of the sodium/iodide symporter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (11), 2108-2116 (2010).
  13. Weeks, A. J., et al. Evaluation of [18F]-tetrafluoroborate as a potential PET imaging agent for the human sodium/iodide symporter in a new colon carcinoma cell line, HCT116, expressing hNIS. Nucl Med Commun. 32, (2), 98-105 (2011).
  14. Khoshnevisan, A., et al. [(18)F]tetrafluoroborate as a PET tracer for the sodium/iodide symporter: the importance of specific activity. EJNMMI Res. 6, (1), 34 (2016).
  15. Groot-Wassink, T., et al. Noninvasive imaging of the transcriptional activities of human telomerase promoter fragments in mice. Cancer Res. 64, (14), 4906-4911 (2004).
  16. Chen, L., et al. Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene. J Nucl Med. 47, (5), 854-862 (2006).
  17. Sieger, S., et al. Tumour-specific activation of the sodium/iodide symporter gene under control of the glucose transporter gene 1 promoter (GTI-1.3). Eur J Nucl Med Mol Imaging. 30, (5), 748-756 (2003).
  18. Chisholm, E. J., et al. Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles. Cancer Res. 69, (6), 2655-2662 (2009).
  19. Klutz, K., et al. Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene. Clin Cancer Res. 15, (19), 6079-6086 (2009).
  20. Merron, A., et al. Assessment of the Na/I symporter as a reporter gene to visualize oncolytic adenovirus propagation in peritoneal tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (7), 1377-1385 (2010).
  21. Merron, A., et al. SPECT/CT imaging of oncolytic adenovirus propagation in tumours in vivo using the Na/I symporter as a reporter gene. Gene Ther. 14, (24), 1731-1738 (2007).
  22. Dingli, D., et al. Combined I-124 positron emission tomography/computed tomography imaging of NIS gene expression in animal models of stably transfected and intravenously transfected tumor. Mol Imaging Biol. 8, (1), 16-23 (2006).
  23. Carlson, S. K., et al. Quantitative molecular imaging of viral therapy for pancreatic cancer using an engineered measles virus expressing the sodium-iodide symporter reporter gene. AJR Am J Roentgenol. 192, (1), 279-287 (2009).
  24. Barton, K. N., et al. GENIS: gene expression of sodium iodide symporter for noninvasive imaging of gene therapy vectors and quantification of gene expression in vivo. Mol Ther. 8, (3), 508-518 (2003).
  25. Siddiqui, F., et al. Design considerations for incorporating sodium iodide symporter reporter gene imaging into prostate cancer gene therapy trials. Hum Gene Ther. 18, (4), 312-322 (2007).
  26. Rad, A. M., et al. AC133+ progenitor cells as gene delivery vehicle and cellular probe in subcutaneous tumor models: a preliminary study. BMC Biotechnol. 9, 28 (2009).
  27. Hwang do, W., et al. Noninvasive in vivo monitoring of neuronal differentiation using reporter driven by a neuronal promoter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 35, (1), 135-145 (2008).
  28. Edmonds, S., et al. Exploiting the Metal-Chelating Properties of the Drug Cargo for In Vivo Positron Emission Tomography Imaging of Liposomal Nanomedicines. ACS Nano. 10, (11), 10294-10307 (2016).
  29. Zhang, R., et al. Probing the Heterogeneity of Protein Kinase Activation in Cells by Super-resolution Microscopy. ACS Nano. 11, (1), 249-257 (2017).
  30. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  31. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Curr Protoc Immunol. Chapter 20 Unit 20.22 (2001).
  32. Workman, P., et al. Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Br J Cancer. 102, (11), 1555-1577 (2010).
  33. Foster, B., Bagci, U., Mansoor, A., Xu, Z., Mollura, D. J. A review on segmentation of positron emission tomography images. Comput Biol Med. 50, 76-96 (2014).
  34. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, (1), 62-66 (1979).
  35. Kinahan, P. E., Fletcher, J. W. Positron emission tomography-computed tomography standardized uptake values in clinical practice and assessing response to therapy. Semin Ultrasound CT MR. 31, (6), 496-505 (2010).
  36. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, (5569), 913-916 (2002).
  37. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J Cell Biol. 163, (2), 257-269 (2003).
  38. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, (6), 1370-1379 (2013).
  39. Hume, S. P., Gunn, R. N., Jones, T. Pharmacological constraints associated with positron emission tomographic scanning of small laboratory animals. Eur J Nucl Med. 25, (2), 173-176 (1998).
  40. O'Doherty, J., et al. 18F-Tetrafluoroborate, a PET Probe for Imaging Sodium/Iodide Symporter Expression: Whole-Body Biodistribution, Safety, and Radiation Dosimetry in Thyroid Cancer Patients. J Nucl Med. 58, (10), 1666-1671 (2017).
  41. Couzin-Frankel, J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 342, (6165), 1432-1433 (2013).
  42. Boardman, D. A., et al. Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for Donor HLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in Preventing Human Skin Transplant Rejection. American Journal of Transplantation. (2017).
  43. Rashid, T., Takebe, T., Nakauchi, H. Novel strategies for liver therapy using stem cells. Gut. 64, (1), 1-4 (2015).
  44. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154, (4), 827-842 (2013).
Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).More

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter