Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Radionuklidenes-fluorescens Reporter genet å spore svulst progresjon i gnager svulst modeller

doi: 10.3791/57088 Published: March 13, 2018

Summary

Vi beskriver en protokoll for prekliniske i vivo sporing av kreft metastasering. Den er basert på radionuklidenes-fluorescens reporter kombinere natrium iodide symporter, oppdaget av ikke-invasiv [18F] tetrafluoroborate-PET og en fluorescerende protein strømlinjeformet ex vivo bekreftelse. Metoden gjelder prekliniske i vivo celle sporing utover svulst biologi.

Abstract

Metastasering er ansvarlig for de fleste dødsfall. Til tross for omfattende forskning fortsatt mekanistisk forståelse av komplekse prosesser styrer metastasering ufullstendig. I vivo modeller er avgjørende for metastasering forskning, men krever raffinement. Oppsporer spontan metastasering av ikke-invasiv i vivo imaging er nå mulig, men fortsatt utfordrende som det krever lang tid observasjon og høy følsomhet. Vi beskriver en langsgående kombinert radionuklidenes og fluorescens hele kroppen i vivo imaging tilnærming for å spore svulst progresjon og spontan metastasering. Denne reporteren genet metodikken sysselsetter natrium iodide symporter (NIS) smeltet til et fluorescerende protein (FP). Kreftceller er konstruert til stabilt express NIS-FP etterfulgt av valg basert på fluorescens-aktivert celle sortering. Tilsvarende svulst modeller er etablert i mus. NIS-FP uttrykke kreftceller er spores ikke-invasively i vivo på hele kroppen nivå av fantes et positron utslipp tomografi (PET) bruker NIS radiotracer [18F] BF4-. PET er den mest sensitive i vivo bildeteknologi tilgjengelig på denne skalaen og muliggjør pålitelig og absolutt kvantifisering. Gjeldende metoder enten stole på store kohorter av dyr som er euthanized for metastasering vurdering på forskjellige tidspunkt eller stole på knapt målbar 2D bildebehandling. Fordelene med metoden beskrevet er: (i) svært følsom ikke-invasiv i vivo 3D PET bildebehandling og kvantifisering, (ii) automatisert PET tracer produksjon, (iii) en betydelig reduksjon i nødvendige dyr tallene på grunn av gjentatte imaging alternativer, (iv). oppkjøpet av sammenkoblede data fra senere tenkelig økter gir bedre statistiske data og (v) alternativet iboende ex vivo bekreftelse av kreftceller i vev av fluorescens mikroskopi eller cytometri. I denne protokollen beskriver vi alle trinnene som kreves for rutinemessig NIS-FP-gis ikke-invasiv i vivo kreft cellen sporing ved hjelp av PET/CT og ex vivo bekreftelse i vivo resultater. Denne protokollen har programmer utover kreftforskning når i vivo lokalisering, utvidelse og mangeårige overvåking av cellen innbyggere er av interesse.

Introduction

Metastatisk sykdom er årsaken til de fleste kreft-dødsfall 1. Til tross for omfattende forskning i metastatisk prosesser er pålitelig overvåking av kreft metastasering i dyremodell systemer vanskelig å oppnå. Nylige fremskritt innen hele kroppen bildeteknologi og multimodal tenkelig tilnærminger har aktivert ikke-invasiv i vivo celle sporing2,3,4,5. Sistnevnte kan brukes som et verktøy for å overvåke tilstedeværelse, distribuere, antall og levedyktigheten til celler, ikke-invasively og gjentatte ganger i levende dyr eller et menneske.

Formålet med metoden beskrevet her er langs- og ikke-invasively spore kreftceller i 3D i levende gnagere svulst modeller. Bruker denne metoden, vil forskere kunne tallfeste nøyaktig svulst progresjon inkludert metastatisk spredning i 3D. Sammenlignet med tradisjonelle ikke-imaging-baserte teknikker, tilbyr denne metoden oppkjøpet av kvantitative data med hovedsakelig redusert dyr tall. En annen funksjon i denne metoden er at det tillater korrelasjon for i vivo bildebehandling med strømlinjeformet nedstrøms ex vivo analyse av de merkede cellene i høstet vev av histology eller cytometri3,6.

Begrunnelsen for utviklingen av denne metoden var å gi en i vivo verktøy for overvåking og måling av hele metastatisk gnager svulst modeller. Viktigere var det designet for å minimere dyr bruk samtidig redusere Inter dyr variasjon. Langsgående ikke-invasiv hele kroppen imaging passer utmerket til å informere på metastatisk utvekst, for som sådan er det vanskelig å forutsi nøyaktig tid og sted for forekomst. Hele kroppen 3D-bildebehandling har derfor vært på midten av metodeutvikling. For å lukke skala gapet mellom hele kroppen i vivo vedtatt bildebehandling og potensial nedstrøms ex vivo histologiske bekreftelse, en multi-skala tenkelig tilnærming basert på dobbel modus radionuklidenes-fluorescens reporter ble3, 6.

Fantes et positron utslipp tomografi (PET) er den mest sensitive 3D hele kroppen bildeteknologi tilgjengelig tilbyr utmerket dyp gjennomtrenging og absolutt kvantifisering7 med en oppløsning på < 1 mm8,9. Foreløpig kan prekliniske celle sporing på hele kroppen nivå av radionuklidenes bildebehandling oppdage cellene på tettheter ~ 1000 celler per volum million celler3,6 med oppløsning i sub-millimeter regionen. I motsetning til intravital mikroskopi, ikke kan identifiseres enkelt spre kreftceller, men det krever ikke kirurgiske prosedyrer (f.eks vindu chambers), er ikke begrenset til en liten synsfelt, og ikke av lav vev gjennomtrenging og scatter. Bioluminescens imaging er gir et rimelig alternativ, men tilknyttet scatter og lys absorpsjon problemer samt dårlig dyp gjennomtrenging, og dermed sterkt begrenset i kvantifisering2. Fluorescens hele kroppen imaging er brukt for kjøp av 3D-bilder, men det er mye mindre følsom sammenlignet bioluminescens eller radionuklidenes teknologier2. Likevel tilbyr fluorescens muligheten til å utføre ex vivo nedstrøms vev analyse av cytometri eller mikroskopi. Sistnevnte lukker skala-gapet mellom makroskopisk hele kroppen bildebehandling (mm oppløsning) og fluorescens mikroskopiske vev analyse (µm oppløsning)3. Derfor utfyller radionuklidenes og fluorescens modaliteter hverandre, mellom hele kroppen nivået (sub-) mobilnettet skalaen.

Reporter genet imaging er ideell for langvarig celle sporing som kreves i metastasering forskning. I dette programmet er bedre enn direkte celle merking som det er (i) ikke er berørt av etiketten fortynning og dermed ikke begrenset i å spore tid, og (ii) bedre reflekterer levende celle tall. Derfor er hele kroppen celle sporing spesielt nyttig for applikasjoner der sporbare celler sprer eller utvide i vivo, forskning for eksempel3,6, for påvisning av teratoma formasjon i stammen i kreft cellen forskning, eller for kvantifisering av immun celle ekspansjon5.

Ulike radionuklidenes-baserte reporter gener er tilgjengelig2. Disse inkluderer enzymer som herpes simplex virus HSV11 thymidine kinase (HSV1 -tk), transportører som natrium iodide symporter (NIS) eller noradrenalin transporter (NET) og celleoverflaten reseptorer som Dopamin D2 reseptor ( D2R). NIS er en glycosylated trans-membran protein som aktivt formidler iodide opptaket, for eksempel i follikulær celler i skjoldbruskkjertelen for påfølgende syntese av thyreoideahormoner10. Denne prosessen er drevet av symport av Na+ og avhengig mobilnettet natrium gradient, som vedlikeholdes av Na+/K+-ATPase11. Følgelig NIS bedre reflekterer levende celle tall enn andre journalister som iodide/radiotracer opptak er koblet til en aktiv Na+/K+ gradert i stedet for det blotte nærvær av transporter. Tradisjonelt, radioiodide er brukt for NIS bildebehandling. For cellen sporing, er alternativ NIS-radiotracers som ikke er metabolically fanget i skjoldbrusk rapportert å være overlegen6. Dette nylig utviklet PET radiotracer [18F] tetrafluoroborate ([18F] BF4-)12,13 viser overlegen farmakokinetikken sammenlignet med radioiodide6 samtidig tilgjengelig på høy spesifikke aktiviteter14 uten behov for komplisert radiochemistry fasiliteter. [18F] BF4- kan syntetiseres via to måter. Den første metoden er basert på isotop utveksling av ikke-radioaktivt 19F i BF4- med radioaktivt 18F12. Den andre metoden er gjennom tillegg av 18F ikke radioaktiv boron trifluoride14. Sistnevnte ble rapportert til høyere spesifikke aktiviteter14 og metoden valgfrihet for prekliniske bildebehandling.

NIS er svært uttrykt i skjoldbrusk vev. Det er også uttrykt i brystkjertlene salivary, lachrymal og ammende samt magen, men på lavere nivåer i forhold til skjoldbruskkjertelen10. Derfor kan ypperlig kontrast imaging i andre kroppen regioner oppnås ved hjelp av NIS. Det er også svært homologe mellom menneske, rotte og mus10. Videre er det ingen rapporter om toksisitet ved ektopisk NIS uttrykk i ikke-thyroidal celler. Viktigere, er NIS også ikke forbundet med verten immunreaksjoner, verken i mennesker eller i gnagere. NIS har blitt brukt som et reporter gen for å måle promoter aktivitet15,16,17 og gene expression18,19,20,21,22 ,23 i flere forskjellige sammenhenger. Det er også brukt for ikke-invasiv bildebehandling gene terapi vektorer24,25, og spore celler i cardiac4, blodkreft26, betennelse5og nevrale studier27. Nylig har NIS også blitt brukt som en reporter genet spore kreft metastasering i vivo3,6.

Oppsummert er de viktigste fordelene med denne metoden over tidligere teknikker: (i) svært følsom ikke-invasiv 3D i vivo lokalisering og kvantifisering av metastatisk spre, (ii) automatisert produksjon av [18F] BF4- på høy molar aktiviteter, (iii) en betydelig reduksjon i nødvendig dyr gjennom langsgående avbildning, (iv) oppkjøpet av sammenkoblede data fra senere tenkelig økter som resulterer i bedre statistiske data, som igjen ytterligere reduserer dyr bruk og (v) alternativet iboende ex vivo bekreftelse av kreftceller i vev av cytometri eller fluorescens mikroskopi.

Protocol

Denne protokollen oppfyller alle kravene Storbritannia (UK) lovgivning og den lokale etisk sikkerhet-panelet. Når du følger denne protokollen, sikre prosedyrene også oppfyller alle krav diktert av nasjonal og lokal etisk sikkerhet-panelet. Kontroller hver eksperiment med radioaktivitet er kompatibel med lovgivning og lokale regler og utført trygt.

1. engineering og karakterisering av kreftceller uttrykke radionuklidenes-fluorescens fusion reporteren NIS-FP

Merk: For enkelhet, mEGFP A206K er forkortet til "GFP" og mCherry som "RFP" i de etterfølgende delene av denne protokollen.

  1. Generasjon av lentiviral partikler
    1. For å produsere lentivirus partikler, co transfect 293T celler med følgende fire plasmider med en egnet transfection metode: (i) reporter genet koding plasmider (pLNT SFFV NIS-GFP eller pLNT SFFV NIS-RFP (se tilleggsinformasjon), (ii) den tredjegenerasjons lentiviral emballasje plasmider pRRE og (iii) pRSV-Rev og (iv) en virus konvolutt inneholder plasmider, f.ekspMD2.G. Pre-mix plasmider før du legger dem til hva mix. Utføre hva i celle kultur hette.
      Merk: Ekstra transfection informasjon gis i tilleggsinformasjon.
    2. Vurdere hva suksess etter 48 timer av standard wide-field fluorescens mikroskopi med filterinnstillingene som er passende for den valgte fusion reporteren (NIS-GFP eller NIS-RFP).
      Merk: Fluorescens signaler er veiledende reporter genet transfection og derfor bare en surrogat for vellykket co transfection, ikke en indikator for vellykket virus produksjon.
    3. Høste viruset partikkel inneholder nedbryting bruker en sprøyte og fjerne flytende celler og celle rusk ved filtrering gjennom filtere 0,45 µm sterilt polyethersulfone (PES). Overføre til en bakteriefri 1.5 mL polypropylen reaksjon rør. Utføre virus arbeid i celle kultur hette og sikre ingen levende virus forlater inneholdt miljøet.
  2. Signaltransduksjon og utvalg av NIS-FP uttrykke kreftcelle linjer
    1. Bruk ren frisk virus fra trinn 1.1.3 blandet 1:1 (v/v) med optimal vekst medium av hver kreft cellen linje (DMEM for MDA-MB-231 celler og RPMI 1640 for 4T1 celler, se materialer tabellen media sammensetning). Utføre signaltransduksjon i celle kultur hette.
      Merk: En mer generell protokoll som omtales i tilleggsinformasjon.
    2. Transduce kreftceller med virus inneholder medium i en inkubator fuktet atmosfære som inneholder 5% (v/v) CO2 på 37 ° C 72 h (arbeid på 6-godt eller 12-vel skala 1 mL eller 0,4 mL av virus blandingen fra trinn 1.2.1).
    3. Overvåke målet cellen NIS-FP uttrykk ved fluorescens mikroskopi.
    4. Utvid vellykket transduced cellene til en skala på 3-10 millioner celler ved hjelp av standard oppdrettsforholdene (se ATCC for MDA-MB-231 og 4T1 linjer).
    5. Bruk fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS) til å rense NIS-FP uttrykke celler fra ikke-transduced celler.
      Merk: FACS kan være en kilde til mycoplasma infeksjoner; Det anbefales å sjekke for mycoplasma før viruset produksjon og signaltransduksjon men også etter FACS og før trinn 1.3.
  3. Karakterisering NIS-FP uttrykke kreftcelle linjer
    1. Bekreft reporter uttrykk av standard flowcytometri som beskrevet andre steder28.
    2. Bekreft reporter integritet ved standard immunoblotting som beskrevet andre steder29.
    3. Analysere intracellulær fusion reporter lokalisering av AC confocal fluorescens mikroskopi.
      Merk: Farging med eller co uttrykk for en plasma membran markøren6 og påfølgende co lokalisering analyse30 vil lette dette trinnet.
    4. Analysere radiotracer opptak i NIS-FP uttrykke linjer.
      Merk: Radioaktivt NIS substrat kompatibel med eksisterende utstyr er egnet, f.eks iodide isotoper (123jeg-, 124jeg-, 125jeg-, 131jeg-), 99 m TcO4-, 188ReO4-, [18F] så3F- eller [18F] BF4-.
      1. Frø 106 renset celler i 6-vel platene i sin optimale vekst medium (se tabell for materiale) en dag før eksperimentet. Forberede alle prøvene i tre eksemplarer og inkluderer kontroll eksempler: (i) "spesifisitet kontroller", dvs NIS-FP uttrykke celler pre inkubert med en konkurransedyktig NIS substrat teste opptak spesifisitet; (ii) "foreldre celle kontroller", dvs celler ikke uttrykke NIS-FP men mottar radiotracer test basale opptak i foreldrenes celler.
      2. På neste morgen, vask celler når med serum-free vekst medium.
      3. Inkuber cellene i serum-free vekstmediet i nærvær av 50 kBq 99 mTcO4- eller [18F] BF4- i 30 min på 37 ° C (1 mL totalt volum). For spesifisitet kontroller pre ruge celler for 30 min med konkurrerende substrat NaClO4- (12.5 µM siste konsentrasjon). Holde konkurrerende substrat konsentrasjonen konstant gjennom hele eksperimentet.
      4. Samle nedbryting og overføre 100 µL slik forberedt samling merket "supernatant".
      5. Vask cellene to ganger med 1 mL iskald fosfat-bufret saltvann (PBS) som inneholder Ca2 +/Mg2 +. Samle hver vaskeløsning og overføre 100 µL av hver i en forberedt samling rør merket "wash1" eller "wash2", henholdsvis.
      6. Løft cellene ved å legge 500 µL PBS med 0,25% (w/v) trypsin og 0,53 mM EDTA, og rugende på 37 ° C til cellene koble (Sjekk visuelt ved hjelp av et mikroskop). Overføre suspensjon i en forberedt samling rør merket "celler". Vask brønnene med 500 µL iskald PBS inneholder Ca2 +/Mg2 + og legge til røret "celler". Pellets cellene med sentrifugering (250 x g, 4 min, 4 ° C).
      7. Telle alle fire prøve typer i hver brønn ved å en gamma counter riktig angitt for radioisotop valgfrihet (her: 99 mTc eller 18F).
        Merk: På grunn av stort antall prøver i denne analysen anbefales det å bruke en automatisert γ-teller i stand til å automatisk forfall korreksjon.
      8. Analysere data ved å summere innhentet gamma antall prøver fra hver brønn for å bestemme en total radioaktivitet teller per brønn.
        Merk: ta aliquoting i trinn 1.3.4.4 og 1.3.4.5 hensyn ved å multiplisere med 10 for "supernatant" og "vaske" fraksjoner.
      9. Uttrykke mobilnettet radiotracer opptak som % opptak som angitt i Equ.1. Beregne gjennomsnitt og standardavvik fra tre eksemplarer eksperimenter.
        Equation 1(Equ.1)
        Merk: Her, reporter validering eksperimenter er beskrevet, men ikke-reporter-relaterte cellulære funksjoner (f.eks spredning, kreft cellen invasjon, genuttrykk etc.) er til slutt programspesifikke og ansvar for hver bruker.

2. opprettelsen av i vivo svulst modeller

  1. Bruk bare fullstendig preget og validerte celler for i vivo eksperimenter. Sjekk fluorescens celler før administrasjonen av noen passende teknikk (f.eks fluorescens mikroskopi, flowcytometri) på enhver anledning.
  2. Opprette svulst modellen i 5-6 uker gammel ung-voksen kvinnelig mus. Bruk BALB/cAnNCrl eller BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu (BALB/c naken) mus for 4T1 svulst modellen og Hilsen. CG-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ (NSG) mus for MDA-MB-231-baserte svulst modellen. Barbere dyr lokalt og bruke steril teknikk. Direkte injisere 50 µL av en suspensjon som inneholder 106 NIS-FP uttrykke kreft celler/mL inn i mammary fett pute mellom fjerde og femte brystvorte31.
    Merk: For å forbedre nøyaktigheten av injeksjon, er det anbefalt utfører injeksjon under narkose ved hjelp av en inhalable bedøvelse som isoflurane (1-2% (v/v) i O2).
    Merk: Kirurgisk implantasjon av svulst stykker fra NIS-FP uttrykke svulster er en alternativ tilnærming til tumor modell etablering31.
  3. Sjekk fluorescens celler på injeksjon nettsteder etter administrasjon og i begynnelsen post injeksjon. Bruk en fluorescens fakkelen og filter glass egnet for FP valg.
  4. Overvåke tumor vekst og sjekk for kliniske tegn (spesielt på senere tidspunkt).
    Merk: For overfladisk svulster, dvs orthotopic bryst tumorer i denne protokollen, bruk calipers og formelen for mener svulst diameter (MTD) = ½· (L + W) 32.

3. produksjon av [18 F] BF 4- med en automatisert radiotracer syntese (ARS) plattform.

Merk: Her, automatisert [18F] BF4- syntese basert på metoden for 18F tillegg til boron trifluoride er beskrevet. Brukere av en mer tilgjengelig ARS plattform (se tabell for materiale), kan filopplasting tilsvarende Extensible Markup Language (XML) kreves for å kjøre automatiserte rekkefølgen på denne plattformen (supplerende fil). En detaljert forklaring av oppsettet kassett som vist i figur 1 er gitt i (tabell 1) og en detaljert beskrivelse av hvert trinn i XML-sekvens filen (tabell 2) å støtte oversettelse til noen annen automatisert plattform.

  1. Sikre at det fungerer med riktig XML-filen lastet inn kontroll datamaskinen definert ARS plattformen som beskrevet i tabell 1 . Sikre ARS plattformen er plassert i en kjemisk hette egnet for sikker jobb med GBq mengder radioaktivitet.
  2. Sug opp cyclotron-produsert [18F] F- (vanligvis 1,5-2 GBq i 2-7 mL [18O] H2O) via innløp reservoaret (V6).
  3. Felle radioaktiviteten på en anion exchange harpiks (f.eks kvartær ammonium anion exchange patron; V5 til V4), gjenopprette [18O] H2O i en separat hetteglass (V1).
  4. Elute [18F] F- (omvendt eluering vil V5 til V4) til reaktor (V8) med 750 µL av 0,9% (w/v) saltvannsoppløsning (V2), etterfulgt av 1,5 mL acetonitrile (V16).
  5. Fjerne vannet ved azeotropic fordampning under vakuum og nitrogen flyt av oppvarming på 105 ° C og 120 ° C i 5 minutter.
  6. Redusere reaktoren temperaturen til 80 ° C.
  7. Legge til 800 µL av 15-kronen-5 i vannfri acetonitrile (46 mg, 0.21 mmol) i tørre [18F] F- gjennom den sentrale porten av reaktoren (V8).
  8. Legge til 850 µL av BF3. OEt2 i vannfri acetonitrile (0,16 mg, 1.13 µmol) til reaktoren.
  9. Reagere i 5 min tilbake til romtemperatur.
  10. Passerer reaksjonsblandingen gjennom en aluminiumoksid kassett (V17 til V18) å fange trifluoroborate.
  11. Hjem reaksjonsblandingen å sprøyte S2 fortynnet med vann (ca. 1,6 mL).
  12. Passerer reaksjonsblandingen gjennom andre anion exchange patron (V19 til V20) å fange [18F] BF4- produktet.
  13. Vask reaktoren med vann (ca. 5,5 mL).
  14. Passere den endelige løsningen gjennom alumina og andre anion exchange patroner.
  15. Skyll sprøyter S2 og S3 med vann.
  16. Vask den andre anion exchange patronen med vann og tørk den med nitrogen gass.
  17. Elute produktet (V19 til V20) med 1 mL av 0,9% NaCl (V14) i sprøyte S3.
  18. Overføre produktet (400-500 µL) via stikkontakt linjen (V21) til en 1 mL samling hetteglass.
    Merk: Molar aktivitet er en viktig del av hver radiotracer. Men sin rutine besluttsomhet er ikke bare tidkrevende, men også krever betydelige mengder av den ferske syntetisert [18F] BF4-, slik at det blir en begrensende faktor for antall dyr som kan avbildes. Teste reproduserbarhet og molar aktiviteter i resulterende [18F] BF4-, er det anbefalt å planlegge noen dedikert testen kjører for dette formålet. For mer informasjon om molar aktiviteter, se drøftingen.

4. i vivo avbilding av NIS-FP uttrykke celler ved nanoPET/CT

  1. Dyr forberedelse
    1. Bedøve mus med 1,5-2.0% (v/v) isoflurane i O2 en strømningshastighet på 1.0-1,5 L/min i en induksjon kammer. Å sjekk for tilstrekkelig anestesi se etter fravær av det pedal refleks.
    2. Sikre for å bruke vet salve på dyr øyne å hindre tørrhet under anestesi
    3. Flytter musen på en heten pute med nesen i en anesthetic forsyning maske og varme halen (f.eks dipping det inn 37 ° C vann eller bruker et infrarødt lys lampe).
    4. Fortynne nylagde sterilt-filtrert [18F] BF4- løsningen 5 MBq per 50 µL med 0,9% sterilt saltvann.
    5. En sprøyte er koblet til en sprøyte nål (måler 29-31), tegne 100 µL av [18F] BF4- løsningen, måle radioaktiviteten i sprøyten og merke verdien og tidspunktet for målingen.
    6. Intravenøst administrere 50 µL av [18F] BF4- løsningen i forvarmes hale venen.
    7. Måle den gjenværende radioaktiviteten i sprøyten og Merk verdien og tidspunktet for målingen. Forskjellen mellom verdier målt på trinn 4.1.7 og 4.1.5 er injisert dose (ID).
    8. Angi en tidtaker telle fra 45 min (starttid for PET imaging = 0 min).
    9. Plasser musen på sengen av nanoPET/CT skanner og sikre bedøvende tilbudet er riktig tilknyttet på nytt.
    10. Når anestesi er fullstendig testet for fravær av pedal refleks.
    11. Kontroller musen er plassert på sengen på ønsket måte, f.eks 'Sfinksen'-som posisjon.
    12. Installere dyr overvåking enheter i henhold til produsentens anbefalinger, f.eks en endetarms temperatur probe, en sonde måle dyr puster, eller elektroder for opptak elektrokardiogram. Sjekk den riktige funksjonen av alle instrumenter.
      Merk: For i vivo spesifisitet tester med NIS radiotracer [18F] BF4-, dyr er avbildet som beskrevet ovenfor og så hvilte våken inntil radioaktiviteten har forfalt tilstrekkelig for å betrakte som ubetydelig, f.eks 48 timer senere da bare 1.3·106% gjenværende 18F radioaktivitet finnes i dyret. I påfølgende tenkelig økten, konkurransedyktig underlaget ClO4- administreres i en dose på 200 mg/kg 30 min før radiotracer administrasjon og bildebehandling utføres som beskrevet ovenfor.
  2. Imaging ved nanoPET/CT
    1. Angi ønsket CT tenkelig parametere, f.eks med nanoPET/CT 55 kVp tube spenningen, satt eksponeringstid til 1200 ms med en-graders kantete stepping og 180-graders anslag.
    2. Angi parametere for PET bildeopptak. Bruk statisk PET skanneparametere med en varighet på 30 min, 1:5 tilfeldig modus og 400-600 keVp energi-vinduet.
    3. På nedtellingstiden = 15 min start CT bildeopptak.
    4. På nedtellingstiden = 0 min start PET bildeopptak.
      1. Hvis seriell dyr imaging er igjen nødvendig, la dyr fullt fra anestesi, dvs gjenvinne bevissthet under tilsyn. Deretter overføre dem til en vedlikehold enhet.
      2. Hvis dette er terminalen imaging økten, fortsette til dyr euthanasia enten bedøvende overdose, stigende konsentrasjonen av karbondioksid eller forvridning i nakken.

5. i vivo dataanalyse

  1. Rekonstruere PET/CT-data ved hjelp av en Monte Carlo-basert full 3D iterativ algoritme. Sikre at rettelser for demping, dødtid og radioisotop forfallet er vurdert. For detaljer se produsentens instruksjoner på PET/CT apparatet i bruk.
  2. Sjekk CT og PET registreres riktig co og lagre dataene i et egnet exchange format som "Digital Imaging and Communications in Medicine" (DICOM).
  3. Analysere bilder
    1. Legg de rekonstruerte DICOM-filene i en passende bilde analyseprogramvare som gir anerkjennelse og avgrensning av interesse (ROIs) og påfølgende PET signal kvantifisering i disse ROIs.
    2. Segmentere ROIs bruker manuell eller dynamisk terskelverdi til å definere ROIs33,34 bruker en egnet programvarepakke. Anatomisk bildeinformasjon fra CT-skanning hjelper guide ROI tildeling, f.eks overfladiske svulster eller lunge volumer.
    3. Bruk analyseprogramvare som produsentens instruksjoner og sikre data er kalibrert til injisert radioaktivitet dose og korrigert for demping og radioaktivitet.
  4. Tegne grafer viser data fra denne i vivo kvantifisering. Uttrykke data som enten prosent injisert dose/volum (%ID/mL) eller standard opptak verdi (SUV), som er et alternativt måletall vurderer radioaktiviteten i hele kroppen av faget.
    1. Beregne %ID/g verdier forutsatt vevs tetthet som vann, dvs ~ 1 g/L. Det er bemerkelsesverdig at denne antakelsen kan være ugyldig for organer med betydelig forskjellige tettheter, som lungekreft eller bein.
    2. Beregne ulike SUVer for å beregne sanne SUV (f.eks. SUVmean, SUVmax); SUVmax er mer egnet for små gjenstander og brukes oftere enn SUVmean35.

6. ex vivo analyser

Utføre de oppførte nedstrøms analysene: (i) fluorescens imaging organer med fluorescerende kreftceller (primære svulst og metastaser) under dyr disseksjon, (ii) måling av radiotracer vev distribusjon, og (iii) histologic eller (iv) cytometric vurdering av kreft organer.

  1. Måling av radiotracer distribusjon av γ-telling (ex vivo biodistribution) og ex vivo fluorescens avbildning av kreft vev.
    1. Måle radioaktivitet av hele døde dyr og noter verdien og tid.
    2. Dissekere dyrene og høste følgende vev: lunge, hjerte, blod (med 20 mm glass kapillærene), lever, mage, nyrer, milt, små og store tarmen, skjoldbrusk og spyttkjertler, et stykke muskel av og ben av de bakre femurs, og relevant og dissectible lymfeknuter og kreft vev.
    3. Måle radioaktiviteten den gjenværende Carcass først inkludert deretter unntatt halen og Merk verdiene og tider av måling.
      Merk: Radioaktivitet i halen kan betraktes som stammer fra radiotracer som var mis injisert og dermed nådde ikke sirkulasjon; Derfor var denne mengden radiotracer ikke bidrar til injisert dose. Hale radioaktiviteten fungerer også som en retrospektiv parameter injeksjon kvalitet.
    4. Veie alle vev (bruk pre vektet rør).
    5. Ta bilder av kreft organer i dagslys og under fluorescens lys.
      Merk: Bruk en kameraet stå å holde avstanden mellom kameralinsen og orgel konstant (eller bruke en dedikert kommersielle instrument for dette formålet).
    6. Bygg inn organer/vev ment for nedstrøms histology i OCT eller dyppe dem i formalin for fiksering. For andre nedstrøms programmer kan eksempel forberedelse variere.
    7. Forberede radiotracer kalibrering standarder i duplikat, f.eks 0-1000 kBq [18F] BF4-.
      Merk: Kalibrering standarder kreves (i) gjelder målt teller per min radioaktivitet verdier (i kBq), og (ii) forenkle forfall korreksjon; 18 F- kan erstatte [18F] BF4-.
    8. Telle radioaktiviteten av alle høstet vev bruker en γ-teller med radioaktivitet kalibrering standarder fra trinn 6.1.7. Merk av måling. Hvis antall prisene er for høy (i.e. utenfor linearitet av kalibrering standard eller indikert ved for høy detektor død ganger), re telle prøver to radiotracer halv-livet senere.
    9. Presentere data som %ID/g eller standard opptak verdier (SUV) (Equ.2).
      SUV = Equation 2 (Equ.2)
    10. Forkaste alle høstet vev som ikke kreves for videre nedstrøms analyser i henhold til lokale avfallshåndtering-regler.
  2. Analysere kreft vev av cytometri eller histology etter brukerens preferanser og standard protokoller (som beskrevet andre steder3,6,28).

Representative Results

Det første trinnet krever genteknologi av kreftceller av interesse. Her, resultatene av lentiviral signaltransduksjon metastatisk murine inflammatorisk 4T1 brystkreft celler og menneskelige metastatisk MDA-MB-231 celler med lentivirus partikler bærer DNA koding NIS-GFP eller NIS-RFP vises. Signaltransduksjon effektivitet varierte mellom kreftcelle linjer (figur 2A, venstre kolonne). Men transduced alle resulterende kreftcelle linjer ble valgt av FACS til renhet (figur 2A, høyre). AC confocal fluorescens mikroskopi (figur 2B) vist riktig plasma membranen lokalisering av NIS-FPs. NIS-FP-funksjonen ble kvantifisert bruker NIS-gis radiotracer opptak (figur 2C-2E) og vist NIS-funksjonen og spesifisitet. Spesielt, ingen betydelige forskjeller mellom 4T1. NIS-GFP og 4T1. NIS-RFP uttrykke linjer med lignende NIS uttrykk nivåer ble funnet (figur 2C).

Etter full i vitro cellen linje karakterisering, svulst modeller ble satt opp med de nyopprettede sporbare kreftcelle linjene. Eksempel på 4T1. NIS-GFP svulst modell, modell for inflammatorisk brystkreft, vises her (Figur 3). I svulst-bærende dyr langsgående hele kroppen PET bildebehandling så informert på svulst progresjon inkludert metastatisk spredning (figur 3B). PET radiotracer [18F] BF4- var nødvendig for bildebehandling og Stekes i morgen av enhver PET imaging økten. Syntese av [18F] BF4- ble utført med metoden beskrevet ARS. ~1.6 GBq 18F- var vanligvis brukes som inndata og fått ~ 244 MBq [18F] BF4- i 40.5±3.9 min (N = 17). Produktet ble analysert av radio tynt lag kromatografi eller ion kromatografi og viste radiochemical renhet av 94.7±1.4%. Radiochemical avkastningen var 19.4±4.0% (forfall-korrigert).

På dag 19 etter svulst inoculation, den primære svulsten ble klart identifisert med PET, men fant ingen metastaser. Ti dager senere (dag 29), samme svulst rentebærende mus var reinstallert og fjern metastasering på ulike steder i alle dyr (lunge metastasering, metastasering til ulike lysken og/eller axillaris lymfeknuter) ble identifisert. Eksemplet i Figur 3 viste omfattende lunge metastasering med flere klart identifiserbare og kvantifiserbare knuter i lungene (figur 3B-3E). Videre dyret presentert med regionale spredning av svulsten i peritoneal vegg samt metastasering til lysken og begge axillaris lymfeknuter. % ID-verdiene av individuelle metastaser i lungene (figur 3E) skilte seg mye, men det gjorde okkuperte volumene av de underliggende metastatisk nodules. I kontrast, var volum-normalisert %ID/mL verdiene (figur 3E) mye mer ensartet. Dette var forståelig for ulike metastaser på lignende utviklingstrinn (i.e. utviklet mellom dager 19 og 29; Figur 3B). Derimot var normaliserte %ID/mL verdien for den primære svulsten lavere enn for lunge-metastaser som er i tråd med en svulst masse som hadde mer tid til fremgang og renovere inkludert tilstrømningen av andre celletyper (stromal celler, immunceller) , spesielt i denne modellen av inflammatoriske brystkreft.

Guidet av i vivo bilder og fluorescens av kreftceller (synlig under dyr disseksjon under fluorescens lys), liten dyptliggende organer som lymfeknuter var pålitelig høstet og samtidig, vurdert for kreft nodule innhold ( Figur 4A). Mens fluorescens signalet under dyr disseksjon var indikativ av svulst celle tilstedeværelse, var det viktig å sikre denne klassifiseringen ble ledsaget av ex vivo radioaktivitet målinger av høstet vev. Figur 4B viser standard opptak verdiene (SUV) innhentet for ulike vev over en kohort av tre dyr, som presenterte med metastasering. Endogenously NIS-uttrykke organer som skjoldbrusk og spyttkjertler (høstet kombinert) eller magen viste også forventet høy radiotracer opptaket. Videre denne NIS-FP tillatt grei kreft cellen identifikasjon under histology (figur 4C). Denne immunofluorescence histology eksempeldataene viste svulst endometrial blodkar i 4T1. NIS-GFP svulst modell. Disse dataene viste også at NIS-GFP reporteren bodde hovedsakelig i plasma membraner av svulst celler også i vivo (figur 4C), og dermed validering av opptak resultater.

Figure 1
Figur 1. Ordningen detaljering av automatiserte radiotracer syntese plattformen for produksjon av [18F] BF4- via fluor-18-til-boron trifluoride tillegg metoden. Reagensnavn skrives på respektive rør i ordningen. QMA er forkortelsen for kvartær ammonium anion exchange, og angir brukte solid-fase brukt kromatografiske separasjon materialet. Flere detaljer finnes i tabell 1 og 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Typisk karakteristikk resultatene av kreftcelle linjer stabilt uttrykke NIS-GFP eller NIS-RFP. (A) de angitte cellen linjene ble laget ved hjelp lentiviruses overføring av NIS-GFP eller NIS-RFP. Venstre kolonne viser transduced befolkningen (grønn eller rød fluorescerende) i forhold til de respektive foreldrene cellene (grå, 4T1 og MDA-MB-231 celler, henholdsvis). Prosenter viser signaltransduksjon effektivitet som bestemmes av flowcytometri. Kolonnen til høyre viser resultatene av cytometric analyser etter FACS rensing av blandede befolkningen i venstre kolonne. Alle linjer ble funnet for å være > 99% ren for angitt NIS-uttrykke celler (av flowcytometri). (B) AC Confocal fluorescens mikroskopi renset cellen linjer viser plasma membranen lokalisering av NIS-GFP eller NIS-RFP i de respektive linjene. WGA-Alexa633 ble brukt som en plasma membran markør. (C, D) Funksjonell validering av NIS-FP protein uttrykt i angitt nylig generert kreftcelle linjer. NIS-funksjonen ble målt bruker radiotracer 99 mTcO4- (50 kBq per million celler). Kontroller, ble foreldrekontroll celler brukt og fusion reporter uttrykke celler som ble behandlet med NIS co substrat-perklorat før og under analysen (spesifisitet kontroll). Resultatene viser tydelig NIS-FP-funksjonen og spesifisitet i alle linjer. (E) funksjonelle validering av 4T1. NIS-FP cellelinjer bruker [18F] BF4- som en radiotracer for NIS. Alle andre forhold var identisk med (C). Viktigere, rettferdiggjøre ligner relativt opptaket resultater ble oppnådd for begge 4T1-avledet cellelinjer med begge radiotracers (figur 2C og E), og dermed utskiftbare bruk av både i vitro funksjonell karakteristikk av NIS-FP uttrykke linjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Representant resultatet av metastasering sporing av [18F] BF4--PET/CT tenkelig i en mus med en 4T1. NIS-GFP svulst. (A) en million 4T1. NIS-GFP celler ble injisert i mammary fett pads 5-6 uker gamle BALB/c CanN.Cg-Foxn1nu/Crl mus og tumor vekst ble fulgt over tid med calipers. På grunn av den GFP fluorescensen av kreftceller var råolje visuell identifikasjon/vekst vurdering også mulig bruker en fluorescens fakkel og egnet filter glass (se innfelt). (B/venstre) På dag 19 innlegg svulst inoculation, ble den primære svulsten (gul prikkelinje) klart identifisert men ingen metastasering. Bildet presentert er en maksimale intensitet projeksjon (MIP) av PET bildet. Endogene NIS signaler (hvit beskrivelser) ble også registrert, dvs skjoldbrusk og spyttkjertler (Th + SG), mage (S), og ved svært lave nivåer, noen deler av mammary og lachrymal kjertler. Blæren (B) signalet stammer fra tracer utskillelse. (B/høyre) På dag 29 innlegget svulst inoculation, metastasering ble klart identifisert: flere metastaser i lungene (gul prikkelinje) samt metastatisk lymfeknuter (ILN, AxLN, gul pilspisser). Bildet presentert er en MIP PET/CT-bilde. Den primære svulsten (gul prikkelinje) vokste ikke bare i en globular form på dette tidspunkt, men også hadde invadert i peritoneal veggen. (C) en 3D implementering av Otsu terskelverdi teknikken aktivert 3D-overflate gjengivelse av kreft vev; disse er lagt til en PET MIP. Lunge metastaser vises i hvitt, metastatisk axillaris lymfeknuter i rødt, metastatisk lysken lymfeknute i gult og den primære svulsten som invaderte i peritoneal veggen i turkis. (D) en blow-up bilde av PET/CT MIP i (B/høyre) for å angi individuelle lunge metastaser. (E) Radiotracer opptak i kreft vev ble kvantifisert fra 3D-bilder (% ID) og normalisert av deres respektive volumer (%ID/mL). Individuelle lunge metastaser tilsvarer nummereringen i (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Typiske eksempler på ex vivo data tilgjengelig fra NIS-FP svulst rentebærende mus. (A) under vev høsting for nedstrøms analyser, fluorescerende egenskapene til NIS-FP uttrykke kreftceller tjenestegjorde som indikator guiding dyr disseksjon. Som eksempler, vev fra dyret i Figur 3, vises dvs lungene med flere metastatisk lesjoner og to positiv lymfeknuter. Dagslys fotografering samt fluorescens bilder vises. Fluorescens bildene ble tatt med samme kamera som dagslys bildene, men under blå lys eksitasjon (450±10 nm Båndpassdesign filter) med en grønn utslipp filter (530±30 nm Båndpassdesign filter) plassert foran kameralinsen. (B) distribusjon av radiotracer i forskjellige organer ('biodistribution') dyr med 4T1. NIS-GFP svulster (N = 3, dag 29 innlegget svulst inoculation, 5 MBq [18F] BF4-). Standard opptak verdier (SUV) ble beregnet og verdier > 1 indikerer bestemt opphopning av radiotracer i det respektive organer. Dataene viser bestemte radiotracer opptak i kreft vev, dvs primære svulsten, metastatisk lymfeknuter (som identifiseres av bildebehandling og disseksjon under fluorescens lys), lunge (ble dissekert som helhet uten skille personlige metastaser), i tillegg til organer uttrykke endogenously NIS, dvs skjoldbruskkjertelen og spyttkjertler og magen. (C) Immunofluorescence histology av den primære svulsten fra samme musen som vist på Figur 3. Den primære svulsten var høstet, innebygd i OCT og frosset før appa (10 µm) og behandlet for flekker. NIS-GFP uttrykke kreftceller ble direkte identifisert uten behov for antistoff flekker. Blodkar var farget med en kanin antistoff mot musen PECAM-1/CD31 (2 µg/mL) og et Cy5-konjugerte geit anti-kanin sekundære antistoff. Kjerner var farget med 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole (1 µg/mL) og prøven montert i poly (vinyl alkohol - vinyl acetate) med 2,5% (w/v) Dabco som en antifade. AC confocal bildene ble oppnådd ved hjelp av en AC confocal mikroskop med innstillinger passer for 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole, GFP og Cy5. Disse eksempeldataene tydelig viser at 4T1. NIS-GFP svulst er Stangeriaceae, men også at endometrial blodkar forskjellig i utstrekning (jf. topp med bunnen midten). Det viser også at NIS-GFP reporteren hovedsakelig finnes i plasma membraner for svulst cellene vivo (innsats), dermed validere i vitro opptak resultatene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

FASTlab mange ventil Reagens, løsemiddel, patron eller rør * Detaljer
V1 Silikon rør [18O] H2O avfall flaske 14 cm
V2 0,9% NaCl løsning, 750 µL 11 mm medisinglass
V3 Sprøyte S1 1 mL
V4 anion exchange patron C1 pre betinget med 1 M NaCl (10 mL) og H2O (10 mL) f.eks September-Pak Accell pluss QMA Plus Light (vann, katten. nei. WAT023525)
V5 Silikon rør til anion exchange patron C1 14 cm
V6 [18O] H2O /18F innløp reservoaret Maks 5 mL
V7 Silikon rør til reaktor fartøy (venstre, gass vik) 14 cm
V8 Silikon rør til reaktor fartøy (sentrale havn, flytende inn-/ utløp) 14 cm
V9 Stengt
V10 Stengt
V11 Sprøyte S2 5 mL
V12 15-kronen-5, 46 mg i 800 µL MeCN 11 mm medisinglass
V13 Trifluoroborate diethyl etherate, 0,14 µL i 850 µL MeCN (fortynne 14 µL av BF3. OEt2 med 1 mL MeCN. Fortynne 10 µL av denne løsningen til 850 µL med MeCN). 13 mm medisinglass
V14 0,9% NaCl løsning, 1 mL 13 mm medisinglass
V15 Vann bag spike
V16 Acetonitrile (MeCN), 1,5 mL 13 mm medisinglass
V17 Silikon rør til Alumina nøytral patron C2 14 cm
V18 Alumina nøytral patron C2, pre klimaanlegg H2O (10 mL), aceton (10 mL) og luft (20 mL) f.eks September-Pak Alumina N Plus Light (vann, katten. nei. WAT023561)
V19 Silikon rør til anion exchange patron C3 14 cm
V20 anion exchange patron C3, pre betinget med 1 M NaCl (10 mL) og H2O (10 mL) f.eks September-Pak Accell pluss QMA Plus Light (vann, katten. nei. WAT023525)
V21 Silikon rør til samling medisinglass 40 cm
V22 Stengt
V23 Stengt
V24 Sprøyte S3 5 mL
V25 Silikon rør til reaktor fartøy (høyre, vakuum port) 40 cm
* Merk: På grunn av plast toppene, død volumet for 11 mm ampuller og 13 mm hetteglass er ca 0,35 mL og 0,4 mL, henholdsvis. Den faktiske mengden reagenser til reaktoren er derfor litt annerledes. Alle antallene som er angitt i denne metoden gjelder faktiske beløpene i hvert reagens hetteglass.

Tabell 1. Beskrivelse av kassett oppsettet for automatisert [18F] BF4- syntese via fluor-18-til-boron trifluoride tillegg metoden (jf figur 1).

Sekvensen trinn Kommentar
[1 - 2] Presse systemet og flush manifold med N2
[3-15] Skyll sprøyte S3 to ganger med H2O (V15), tømme manifold med N2
[16-23] Pressurize reagens ampuller posisjoner V16, V14, V13 og V12, rødme manifold med N2 mellom hvert hetteglass
[24-26] Åpne aktivitet innløp (V6)
Koble ampullen inneholder 18F. Hvis det totale volumet er > 5 mL, bare inn nålen halvveis ampullen før du fortsetter.
[27-39] Lukk aktivitet innløp (V6), felle 18F QMA patron C1 (V5), samle [18O] H2O i avfall flasken (V1). Hvis det totale volumet er > 5 mL, pause rekkefølgen på trinn 37, gå tilbake til trinn 26, sett inn nålen inn ampullen inneholder 18F, og gjenoppta prosessen.
[40] Lukk [18O] H2O avfall flasken (V1), flush manifold med N2
[41] Presse eluent ampullen i posisjon V2
[42-44] Åpne reaktoren ventilen V8, Sug opp eluent fra V2 i sprøyten S1
[45-50] Elute QMA patron C1 til reaktor (V8) med saltvann fra sprøyte S1, reaktoren temperaturen til 90 ° C
[51] Tømme QMA kassetten C1 med N2 og øke reaktoren temperaturen 105 ° c
[52-53] Trekke acetonitrile fra V16 i sprøyten S2
[54 til 57] Overføre acetonitrile fra sprøyten S2 til reaktoren (V8)
[58-60] Varme reaktoren ved 120 ° C i 5 min. fordampe løsemiddelet med en flyt av N2 reaktoren (V7).
[61-65] Still inntemperaturen 105 ° c, tørr sprøyte S1 med N2
[66-69] Trekke 15-kronen-5 løsningen fra V13 i sprøyten S2, øke reaktoren temperaturen til 120 ° C
[70-71] Redusere temperaturen 105 ° c, flush manifold med N2
[72] Avkjøl reaktoren (sett temperaturen til 40 ° C) i 5 min
[73-78] Angi reaktoren temperaturen til 80 ° C, overføre den 15-krone-5-løsningen fra sprøyten S2 til reaktoren (V8)
[79-81] Tegne BF3. OEt2 løsning fra V14 i sprøyten S2
[82-87] Overføre BF3. OEt2 løsning fra sprøyte S2 reaktoren (V8) flush reaktoren linjen med N2
[88] Flush manifold med N2
[89] Reagere for 5 min, la temperaturen tilbake til RT
[90-95] Overføre reaksjonsblandingen (V8) på sprøyten S2
[96-104] Pass reaksjonsblandingen gjennom Alumina N patron C2, i sprøyten S3
[105] Flush manifold med N2
[106-109] Returnere reaksjonsblandingen å sprøyte S2
[110-112] Tom sprøyte S3, trekke H2O (V15) i sprøyten S2 å fortynne reaksjonsblandingen
[113-115] Laste reaksjonsblandingen på QMA kassetten C3
[116-118] Trekke H2O (V15) i sprøyten S2
[119-124] Skyll reaktoren (V8) med H2O fra sprøyte S2, Sug opp vasker i sprøyten S2
[125-128] Passere vasker gjennom kassetter C2 og C3
[129-130] Tørr blekkpatronene og manifold med N2
[131-136] Vask sprøyte S1 med H2O (V15)
[137-142] Vask sprøyte S2 med H2O (V15)
[143] Flush manifold med N2
[144-147] Trekke H2O (V15) i sprøyten S2
[148-151] Spyle QMA kassetten C3 med H2O fra sprøyten S2
[152-153] Tørr QMA kassetten C3 med N2 og flush manifold med N2
[154-157] Elute QMA kassetten C3 med 0,9% NaCl (V14) i sprøyten S3
[158-161] Overføre produktet fra sprøyten S3 til samling ampullen (V21)
[162-163] Flush QMA kassetten C3 med N2 til samling ampullen (V21)
[164-166] Flush manifold med N2
[167-170] Flush patroner C2 og C3 (å kaste flaske) og manifold med N2
[171] Tømme samling slangen (V21) med N2

Tabell 2. Beskrivelse av trinnene i XML-sekvens filen.

Discussion

Første skritt for å gjengi kreft celler sporbare i vivo ved denne metoden krever engineering dem å uttrykke NIS-FP fusion reporteren. Valg av fluorescerende proteinet i fusion reporteren er kritisk oligomerizing fluorescerende proteiner kan føre til kunstig reporter klynging, dermed negativt påvirker dens funksjon. Vi har hatt suksess med bevist monomerisk fluorescerende proteiner som mEGFP (med monomerizing mutasjon A206K36,37), mTagRFP eller mCherry. NIS kan enten være menneske eller musen opprinnelse (hNIS eller msNIS) avhengig av eksperimentet og kreft modellen. Signaltransduksjon effektivitet generelt varierer mellom ulike kreftcelle linjer. Imidlertid blir genererte kreftcelle linjer deretter renset ved FACS i denne protokollen, og dermed redusere behovet for å optimalisere signaltransduksjon forhold. Signaltransduksjon med høy mangfoldighet av infeksjon er ikke alltid tilrådelig som flere konstruere integrering i genomet trolig føre ikke bare i høyere konstruere uttrykket, men også i mer uønsket/uregulert genomet modifisering. Derfor er det viktig å la polyklonale transduced cellene vokse stabilitet uttrykk (overvåket av flowcytometri) og unngå sortering smarteste kloner av FACS. Det gjør også funksjonelle validering av ikke-reporter funksjoner avgjørende før disse cellene skal brukes for i vivo eksperimenter. En nylig utviklet alternativ til viral gen levering er genet redigering teknologi38, som gir mer kontroll over viral integrering områder. Uttrykket analyse av flowcytometri og immunoblotting er viktig. Flowcytometri lar oppkjøpet av befolkningen-baserte enkeltcelle data, for eksempel undersøke om det er noen drift i reporter uttrykk nivåer over tid. Det er avhengig av FP moiety, med mindre celler er også farget med et antistoff rettet mot overflaten eller totale NIS. Flowcytometri informerer ikke på fusion reporter integritet. Derimot rapporterer immunoblotting om integriteten til fusion reporteren. Molekylvekt av NIS og FP må legges til fastslå den forventede Molekylvekten av den valgte NIS-FP. AC Confocal fluorescens mikroskopi vist fusion reporter colocalization med plasma-membran markør hvetespirer agglutinin i alle nylig laget linjer. Dette var forventet mobilnettet mesteparten av protein og indikerte en klarsignal milepæl for påfølgende funksjonelle validering. Hvis minimal/nei NIS-FP ble funnet på plasma membranen (f.eks i interne cellulære avdelinger) dette skulle tilsi en celle biologiske problemet med fusion reporter på denne cellen, eller en mulig mutasjon av fusion reporteren påvirker sin intracellulær menneskehandel. Det er bemerkelsesverdig at vi ikke har observert så fall i noen av kreftcellene vi testet så langt som: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (menneskelige melanom); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (menneskelige brystkreft); NCI-H1975 (menneskelige lungekreft); SK-Hep1 (menneskelige leverkreft); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (murine inflammatorisk brystkreft); B16F0, B16F3, B16F10 (murine melanom); MTLn3 (rat bryst adenocarcinoma).

NIS-funksjonen må måles med opptak analyser med radioaktive NIS underlag. På grunn av SPECT radiotracer 99 mTcO4- å være generator-produsert og derfor tilgjengelig i sykehus uten behov for noen radiotracer syntese, samt å ha en mer praktisk lengre halveringstid (6.01 h 99 m TC sammenlignet med 110 min 18F), vi brukt denne NIS substrat til rutinemessig funksjonelle validering av nye NIS-FP uttrykke linjer. Pre blokkering av NIS-uttrykke celler med NIS co substrat natrium-perklorat resulterte i forventet reduksjon/opphevelse av radiotracer opptak, og dermed demonstrere spesifisitet av radiotracer opptak. Denne NIS spesifisitet testen er en kritisk valideringstrinnet. Hvis et NIS spesifisitet eksperiment ikke ville medføre redusert radiotracer opptak sammenlignes med de respektive foreldrene cellene, enten det har oppstått en teknisk feil under eksperimentet eller radiotracer opptaket var ikke på grunn av NIS. Det er også mulig at natrium perklorat pre blokkerer reduserer radiotracer opptak i foreldrenes celle linjen. Dette vil identifisere linjer med endogene funksjonelle NIS uttrykk (f.eks stimulert thyroid cellene6).

En viktig fordel av denne imaging-protokollen er at informasjonen samles i 3D og over tid. Dette gjør at sammenligningen bilder fra samme dyret over tid, og dermed gir sammenkoblede data og dermed overvinne problemene forårsaket av Inter dyr variasjon. Dette gir kontrast til de fleste ikke-imaging relaterte metastasering vurderingsmetoder som er basert på å ofre forskjellige dyr på ulike tidspunkt. I figur 3B er det tydelig hvordan metastatisk spredning og utvekst kommet over tid i et enkelt dyr. Signalene oppdaget av PET/CT tenkelig fundamentalt skyldes NIS uttrykk. Dette inkluderer alle signaler fra NIS-uttrykke kreftceller exogenously samt alle organer endogenously uttrykke NIS. Typisk endogene NIS signaler finnes i skjoldbrusk og spyttkjertler, magen, og, på et lavt nivå i noen deler av mammary og lachrymal kjertler. I tillegg til endogene NIS uttrykk, er NIS radiotracer [18F] BF4- også utskilles via nyrene, og dermed forklarer radiotracer opptak i urin-fylt blærer. Nyre opptak er ikke lenger synlig på tenkelig tidspunktet anbefalt i denne protokollen (45 min post radiotracer injeksjon6). Hvis signaler fra urin-fylt blærer bør føre til problemer med signal-til-bakgrunn, kan blæren tømmes mekanisk under anestesi før bildebehandling. Viktigere, kan endogen signalene variere mellom dyr stammer. Det er også bemerkelsesverdig at endogene NIS uttrykk i brystkjertlene kan være høyere under ammende forhold10. I presenterte saken og i tilfeller av disse metastatisk cellelinjer vellykket preget før (jf. listen ovenfor), fant vi ikke endogene NIS uttrykk betydelig forstyrre metastasering gjenkjenning. Det er bemerkelsesverdig, at [18F] BF4- er mer tilgjengelig for opptak i kreft vev i forhold til iodide, fordi iodide metaboliseres i skjoldbrusk hormoner6. Dette fenomenet kan også bidra til større mengder radioiodide i blodet i forhold til [18F] BF4- 6. Dette kan variere for forskjellige programmer (kreftcelle sporing i andre kreft eller ikke-kreft cellen sporingsprogrammer), og det anbefales derfor å vurdere om endogene NIS uttrykk er sannsynlig forårsake signal-til-bakgrunn spørsmål gjennom Foreløpig eksperimenter. Et viktig aspekt i preklinisk bildebehandling er molar aktiviteten til radiotracer. Metoden beskrevet her bruker ~1.5 GBq 18F- som starter materiale14 og har vist seg å produsere molar aktiviteter betydelig over de tidligere rapportert erstatning metoden12. [18F] BF4- produsert ved molar aktiviteter ≤1 GBq/µmol12 kan føre til redusert opptak i NIS-uttrykke vev. Dette er spesielt viktig når injisert mengden radioaktivitet per kilo er høy, dvs når små dyr som mus er fotografert39; Det er mindre viktig i den menneskelige sette40. Høy molar aktiviteter er derfor viktig for høykvalitets prekliniske PET bildebehandling. Molar aktiviteter ved den boron trifluoride tillegg metode14, som vises i sin automatisert form i denne protokollen, overvinne dette problemet. Videre, det er bemerkelsesverdig at presentert protokollen for [18F] BF4- -syntese ikke er kompatibel med god produksjon praksis (GMP) og derfor uegnet for bruk i kliniske studier i dette skjemaet. En GMP-protokoll (via 18F erstatning metoden å radiolabel BF4-) er tilgjengelig andre steder40.

PET/CT bildebehandling kan visualisering av radiotracer opptak, som antyder NIS-mediert radiotracer opptak stammer fra NIS-FP uttrykke kreftceller. Enda viktigere, kan tilknyttede PET signalene kvantifiseres. Det er nødvendig å bruke pålitelig terskelverdi prosedyrer for å sikre en konsekvent og upartiske differensiering av relevante signaler fra noen potensielle bakgrunn. Som bakgrunnen varierer i ulike steder i vivo, er det viktig å vurdere lokale og regionale terskelverdi og segmentering. En slik metode ble utviklet av og oppkalt etter Otsu34, og gjennomføringen 3D er ansatt for 3D-gjengivelse av den primære svulsten og metastaser i denne protokollen. Vanligvis svarer bildet sett av observatøren visuelt best til kvantifisert % injisert dose (% ID) verdiene. For avbildningsbasert kvantifisering er det også viktig å normalisere målt radioaktivitet verdiene av ulike vev til volumene. Det er hovedsakelig brukt på to måter å uttrykke normaliserte resultatene, (i) % ID per (f.eks %ID/mL), og (ii) standard opptak (SUV35). De forskjellige ved at %ID/mL tar hensyn til individuelle volumet, mens SUV er et mål som er relativ til den gjennomsnittlige radioaktiviteten over hele dyret. Det er også viktig å merke seg at NIS imaging gjør live svulst volumet (LTV) tilgjengelig, fordi døde/døde celler ikke syntetisere ATP kan ikke lenger importere radiotracer10. Dette forklarer store lav signal området innenfor den primære svulsten ("bolle formet" tumor) angir arealer av svulst celle død/nekrose. Viktigere, var LTV en mye mer pålitelig måling av svulst byrden i forhold til rå svulst volumet tilgjengelig med skyvelære målinger (som ikke tar konto levedyktighet og vurderer bare overfladisk svulst regioner).

En stor fordel med denne dobbelt-måte sporing strategien er tydelig når høsting vev etter dyr culling. Guidet av i vivo bilder og assistert av fluorescerende kreftceller under dyr disseksjon, kan små og dyptliggende organer/metastaser også pålitelig høstes. Frossent bevaring/snitting metodikk kan direkte fluorescens avbilding av GFP uten flekker med et anti-GFP antistoff, men på bekostning av redusert strukturelle vev bevaring sammenlignet med formalin-fast parafin-embedded metodikk (FFPE). Sistnevnte krever kritisk også anti-FP flekker, fordi metoden FFPE er kompatibel med intakt bevaring av fluorescerende proteiner (på grunn av fiksering/dehydrering/rehydrering). Mens fluorescens signalet er et tegn på tumor celle tilstedeværelse, er det viktig å sikre denne klassifiseringen er bekreftet av ex vivo radioaktivitet målinger av høstet vev ('biodistribution'). Ex vivo radioaktivitet målinger er mer følsomme enn visuell gjenkjenning av fluorescens, dermed kan tillate identifikasjon av kreft celle-avhengige signaler som ville ellers forblir usett. Hvis en terminal imaging økten, det er viktig å nøyaktig merke injisert radiotracer beløpene i tillegg til tider radiotracer radioaktivitet målinger, dyr injeksjon, dyr culling, og kalibrert scintillation telleren målinger av høstet vev. Dette er avgjørende for å sikre korreksjon for radiotracer forfall og dermed aktivere pålitelig biodistribution analyse.

PET/CT imaging kan gjentas ikke-invasiv 3D kvantifisering av svulst progresjon inkludert vurdering av metastatisk spredt på hele kroppen nivå. Denne funksjonen er en betydelig fordel over konvensjonelle metoder, som ofte avhengige av store kohorter av dyr som er euthanized for vurdering av svulst progresjon på forskjellige tidspunkt. Fordelene med denne imaging tilnærming er: (i) svært følsom ikke-invasiv 3D i vivo kvantifisering, (ii) en betydelig reduksjon i dyr tall på grunn av muligheten for gjenta imaging, (iii) oppkjøp av langsgående sammenkoblede data fra påfølgende imaging økter å forbedre statistikk ved å ekskludere Inter dyr variasjon, noe som igjen ytterligere reduserer dyr tall, (iv) automatisert produksjon av [18F] BF4- på høy bestemte aktiviteter, og (v) den iboende alternativ for ex vivo bekreftelse i vev av fluorescens metoder som mikroskopi eller cytometri.

I vivo celle sporing er et voksende felt. Det har vært drevet av nylige fremskritt i imaging teknologi, som resulterte i forbedret oppløsning, oppdagelsen grenser og multiplex evne (via multimodal imaging). I denne protokollen bruker vi dette begrepet for å spore svulst progresjon inkludert spontan kreft cellen metastasering i 3D av gjenta tenkelig. Programmer omfatter studier unraveling mekanismer for spontane kreft cellen metastasering. Sporbare kreftceller kan for eksempel brukes til å studere virkningen av ulike immun celle komponenter (som dag/funksjonelle i dyr stammer av ulike nivåer av immunocompromisation) på metastatisk prosessen. Tilsvarende kunne effekten av enkelte gener, enten i dyr belastning eller kreft cellen linjen, studeres. Videre kan presentert protokollen brukes til å vurdere/validere effekten av spesifikke medikamenter eller terapeutisk konsepter på svulst progresjon. Viktigere, denne reporteren gene: radiotracer par for PET imaging (NIS: [18F] BF4-) kan også brukes for ulike celle sporingsprogrammer. For eksempel dukker flere cellen terapi for tiden som lovende terapeutiske metoder. Dette inkluderer mobilnettet therapeutics for kreft behandling41 , men også i transplantasjon42 og regenerativ medisin43,44 innstillinger. Hele kroppen i vivo celle sporing blir stadig viktigere for utvikling og klinisk oversettelse av mobilnettet therapeutics, for eksempel for å vurdere sikkerheten og terapi overvåking.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forskningen ble støttet av King's College London og UCL omfattende kreft Imaging sentrum, finansiert av kreftforskning Storbritannia og EPSRC i samarbeid med MRC og DoH (England); National Institute for Health Research (NIHR) biomedisinsk forskningssenter basert på guys og St. Thomas' NHS Foundation Trust og King's College London; Senter for fremragende i medisinsk Engineering finansiert av Wellcome Trust og EPSRC under gi nummer WT 088641/Z/09/Z..; en kreft UK tverrfaglig prosjekt forskerpris GOF og PJB og en Kings helse partnere stipend for GOF. Det nanoPET/CT og nanoSPECT/CT skanner ble kjøpt og vedlikeholdes av en utstyr stipend fra Wellcome Trust. Synspunktene er de av forfatterne, og ikke nødvendigvis de NHS, NIHR eller DoH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole Thermo Scientific H3570 Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line ATCC CRl-2539 for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter Roche Diagnostics GmbH 5651697001 CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent Sedna Scientific 2501036
CASYton Isotonic Diluent Sedna Scientific 2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 Leica, Wetzlar, Germany Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness VWR International 631-0150
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
DMEM Sigma D5546 Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III  BD Biosciences Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine Sigma G7513 Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells ATCC HTB-26 for details see ATCC website
Mowiol 4-88 Sigma 81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G Addgene #12259 plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE Addgene #12251 packaging plasmid
pRSV-Rev Addgene #12253 packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Penicillin-Streptomycin Sigma P43330 Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate) Polysciences 17951 Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833 From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water 
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge Hettich Lab Technology
RPMI 1640 Sigma R0883 Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm Corning
Syringes 10 mL BD Emerald Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL  Life Technologies Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X  Sigma 59418C (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red 
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate  Life Technologies  W21404 Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper World Precision Instruments 501601
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5 Sigma-Aldrich 188832 CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous) Acros Organics 326811000
Boron trifluoride diethyl etherate Sigma-Aldrich 216607 BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes GE Healthcare FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets Macherey-Nagel 802021 RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light Waters WAT023525 Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light Waters WAT023561 Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP GE Healthcare
Nitrogen filter Millipore SE2M049I05 Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber Vet-Tech AN010R With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system Vet-Tech AN001B Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline Thermo Scientific Oxoid BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger Vet-Tech AN200 VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane  Sigma 59070-1L-D Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 85040C
Cover slips 22×50 mm VWR International SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT SLEE Medical two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson/Stratech 111-175-144 Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35  CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope Nikon Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound  VWR international 361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN Dako UK Ltd Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS) available from various suppliers. Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Brader, P., Serganova, I., Blasberg, R. G. Noninvasive molecular imaging using reporter genes. J Nucl Med. 54, (2), 167-172 (2013).
  3. Fruhwirth, G. O., Diocou, S., Blower, P. J., Ng, T., Mullen, G. E. A whole-body dual-modality radionuclide optical strategy for preclinical imaging of metastasis and heterogeneous treatment response in different microenvironments. J Nucl Med. 55, (4), 686-694 (2014).
  4. Terrovitis, J., et al. Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 52, (20), 1652-1660 (2008).
  5. Seo, J. H., et al. Trafficking Macrophage Migration Using Reporter Gene Imaging with Human Sodium Iodide Symporter in Animal Models of Inflammation. J Nucl Med. 51, (10), 1637-1643 (2010).
  6. Diocou, S., et al. [18F]tetrafluoroborate-PET/CT enables sensitive tumor and metastasis in vivo imaging in a sodium iodide symporter-expressing tumor model. Scientific Reports. 7, (1), 946 (2017).
  7. Lajtos, I., et al. Cold wall effect eliminating method to determine the contrast recovery coefficient for small animal PET scanners using the NEMA NU-4 image quality phantom. Phys Med Biol. 59, (11), 2727-2746 (2014).
  8. Nagy, K., et al. Performance evaluation of the small-animal nanoScan PET/MRI system. J Nucl Med. 54, (10), 1825-1832 (2013).
  9. Deleye, S., et al. Performance evaluation of small-animal multipinhole muSPECT scanners for mouse imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, (5), 744-758 (2013).
  10. Portulano, C., Paroder-Belenitsky, M., Carrasco, N. The Na+/I- symporter (NIS): mechanism and medical impact. Endocr Rev. 35, (1), 106-149 (2014).
  11. Dohan, O., et al. The sodium/iodide Symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocr Rev. 24, (1), 48-77 (2003).
  12. Jauregui-Osoro, M., et al. Synthesis and biological evaluation of [F-18]tetrafluoroborate: a PET imaging agent for thyroid disease and reporter gene imaging of the sodium/iodide symporter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (11), 2108-2116 (2010).
  13. Weeks, A. J., et al. Evaluation of [18F]-tetrafluoroborate as a potential PET imaging agent for the human sodium/iodide symporter in a new colon carcinoma cell line, HCT116, expressing hNIS. Nucl Med Commun. 32, (2), 98-105 (2011).
  14. Khoshnevisan, A., et al. [(18)F]tetrafluoroborate as a PET tracer for the sodium/iodide symporter: the importance of specific activity. EJNMMI Res. 6, (1), 34 (2016).
  15. Groot-Wassink, T., et al. Noninvasive imaging of the transcriptional activities of human telomerase promoter fragments in mice. Cancer Res. 64, (14), 4906-4911 (2004).
  16. Chen, L., et al. Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene. J Nucl Med. 47, (5), 854-862 (2006).
  17. Sieger, S., et al. Tumour-specific activation of the sodium/iodide symporter gene under control of the glucose transporter gene 1 promoter (GTI-1.3). Eur J Nucl Med Mol Imaging. 30, (5), 748-756 (2003).
  18. Chisholm, E. J., et al. Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles. Cancer Res. 69, (6), 2655-2662 (2009).
  19. Klutz, K., et al. Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene. Clin Cancer Res. 15, (19), 6079-6086 (2009).
  20. Merron, A., et al. Assessment of the Na/I symporter as a reporter gene to visualize oncolytic adenovirus propagation in peritoneal tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (7), 1377-1385 (2010).
  21. Merron, A., et al. SPECT/CT imaging of oncolytic adenovirus propagation in tumours in vivo using the Na/I symporter as a reporter gene. Gene Ther. 14, (24), 1731-1738 (2007).
  22. Dingli, D., et al. Combined I-124 positron emission tomography/computed tomography imaging of NIS gene expression in animal models of stably transfected and intravenously transfected tumor. Mol Imaging Biol. 8, (1), 16-23 (2006).
  23. Carlson, S. K., et al. Quantitative molecular imaging of viral therapy for pancreatic cancer using an engineered measles virus expressing the sodium-iodide symporter reporter gene. AJR Am J Roentgenol. 192, (1), 279-287 (2009).
  24. Barton, K. N., et al. GENIS: gene expression of sodium iodide symporter for noninvasive imaging of gene therapy vectors and quantification of gene expression in vivo. Mol Ther. 8, (3), 508-518 (2003).
  25. Siddiqui, F., et al. Design considerations for incorporating sodium iodide symporter reporter gene imaging into prostate cancer gene therapy trials. Hum Gene Ther. 18, (4), 312-322 (2007).
  26. Rad, A. M., et al. AC133+ progenitor cells as gene delivery vehicle and cellular probe in subcutaneous tumor models: a preliminary study. BMC Biotechnol. 9, 28 (2009).
  27. Hwang do, W., et al. Noninvasive in vivo monitoring of neuronal differentiation using reporter driven by a neuronal promoter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 35, (1), 135-145 (2008).
  28. Edmonds, S., et al. Exploiting the Metal-Chelating Properties of the Drug Cargo for In Vivo Positron Emission Tomography Imaging of Liposomal Nanomedicines. ACS Nano. 10, (11), 10294-10307 (2016).
  29. Zhang, R., et al. Probing the Heterogeneity of Protein Kinase Activation in Cells by Super-resolution Microscopy. ACS Nano. 11, (1), 249-257 (2017).
  30. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  31. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Curr Protoc Immunol. Chapter 20 Unit 20.22 (2001).
  32. Workman, P., et al. Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Br J Cancer. 102, (11), 1555-1577 (2010).
  33. Foster, B., Bagci, U., Mansoor, A., Xu, Z., Mollura, D. J. A review on segmentation of positron emission tomography images. Comput Biol Med. 50, 76-96 (2014).
  34. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, (1), 62-66 (1979).
  35. Kinahan, P. E., Fletcher, J. W. Positron emission tomography-computed tomography standardized uptake values in clinical practice and assessing response to therapy. Semin Ultrasound CT MR. 31, (6), 496-505 (2010).
  36. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, (5569), 913-916 (2002).
  37. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J Cell Biol. 163, (2), 257-269 (2003).
  38. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, (6), 1370-1379 (2013).
  39. Hume, S. P., Gunn, R. N., Jones, T. Pharmacological constraints associated with positron emission tomographic scanning of small laboratory animals. Eur J Nucl Med. 25, (2), 173-176 (1998).
  40. O'Doherty, J., et al. 18F-Tetrafluoroborate, a PET Probe for Imaging Sodium/Iodide Symporter Expression: Whole-Body Biodistribution, Safety, and Radiation Dosimetry in Thyroid Cancer Patients. J Nucl Med. 58, (10), 1666-1671 (2017).
  41. Couzin-Frankel, J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 342, (6165), 1432-1433 (2013).
  42. Boardman, D. A., et al. Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for Donor HLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in Preventing Human Skin Transplant Rejection. American Journal of Transplantation. (2017).
  43. Rashid, T., Takebe, T., Nakauchi, H. Novel strategies for liver therapy using stem cells. Gut. 64, (1), 1-4 (2015).
  44. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154, (4), 827-842 (2013).
Radionuklidenes-fluorescens Reporter genet å spore svulst progresjon i gnager svulst modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).More

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter