Vi beskriver en protokoll for prekliniske i vivo sporing av kreft metastasering. Den er basert på radionuklidenes-fluorescens reporter kombinere natrium iodide symporter, oppdaget av ikke-invasiv [18F] tetrafluoroborate-PET og en fluorescerende protein strømlinjeformet ex vivo bekreftelse. Metoden gjelder prekliniske i vivo celle sporing utover svulst biologi.
Metastasering er ansvarlig for de fleste dødsfall. Til tross for omfattende forskning fortsatt mekanistisk forståelse av komplekse prosesser styrer metastasering ufullstendig. I vivo modeller er avgjørende for metastasering forskning, men krever raffinement. Oppsporer spontan metastasering av ikke-invasiv i vivo imaging er nå mulig, men fortsatt utfordrende som det krever lang tid observasjon og høy følsomhet. Vi beskriver en langsgående kombinert radionuklidenes og fluorescens hele kroppen i vivo imaging tilnærming for å spore svulst progresjon og spontan metastasering. Denne reporteren genet metodikken sysselsetter natrium iodide symporter (NIS) smeltet til et fluorescerende protein (FP). Kreftceller er konstruert til stabilt express NIS-FP etterfulgt av valg basert på fluorescens-aktivert celle sortering. Tilsvarende svulst modeller er etablert i mus. NIS-FP uttrykke kreftceller er spores ikke-invasively i vivo på hele kroppen nivå av fantes et positron utslipp tomografi (PET) bruker NIS radiotracer [18F] BF4–. PET er den mest sensitive i vivo bildeteknologi tilgjengelig på denne skalaen og muliggjør pålitelig og absolutt kvantifisering. Gjeldende metoder enten stole på store kohorter av dyr som er euthanized for metastasering vurdering på forskjellige tidspunkt eller stole på knapt målbar 2D bildebehandling. Fordelene med metoden beskrevet er: (i) svært følsom ikke-invasiv i vivo 3D PET bildebehandling og kvantifisering, (ii) automatisert PET tracer produksjon, (iii) en betydelig reduksjon i nødvendige dyr tallene på grunn av gjentatte imaging alternativer, (iv). oppkjøpet av sammenkoblede data fra senere tenkelig økter gir bedre statistiske data og (v) alternativet iboende ex vivo bekreftelse av kreftceller i vev av fluorescens mikroskopi eller cytometri. I denne protokollen beskriver vi alle trinnene som kreves for rutinemessig NIS-FP-gis ikke-invasiv i vivo kreft cellen sporing ved hjelp av PET/CT og ex vivo bekreftelse i vivo resultater. Denne protokollen har programmer utover kreftforskning når i vivo lokalisering, utvidelse og mangeårige overvåking av cellen innbyggere er av interesse.
Metastatisk sykdom er årsaken til de fleste kreft-dødsfall 1. Til tross for omfattende forskning i metastatisk prosesser er pålitelig overvåking av kreft metastasering i dyremodell systemer vanskelig å oppnå. Nylige fremskritt innen hele kroppen bildeteknologi og multimodal tenkelig tilnærminger har aktivert ikke-invasiv i vivo celle sporing2,3,4,5. Sistnevnte kan brukes som et verktøy for å overvåke tilstedeværelse, distribuere, antall og levedyktigheten til celler, ikke-invasively og gjentatte ganger i levende dyr eller et menneske.
Formålet med metoden beskrevet her er langs- og ikke-invasively spore kreftceller i 3D i levende gnagere svulst modeller. Bruker denne metoden, vil forskere kunne tallfeste nøyaktig svulst progresjon inkludert metastatisk spredning i 3D. Sammenlignet med tradisjonelle ikke-imaging-baserte teknikker, tilbyr denne metoden oppkjøpet av kvantitative data med hovedsakelig redusert dyr tall. En annen funksjon i denne metoden er at det tillater korrelasjon for i vivo bildebehandling med strømlinjeformet nedstrøms ex vivo analyse av de merkede cellene i høstet vev av histology eller cytometri3,6.
Begrunnelsen for utviklingen av denne metoden var å gi en i vivo verktøy for overvåking og måling av hele metastatisk gnager svulst modeller. Viktigere var det designet for å minimere dyr bruk samtidig redusere Inter dyr variasjon. Langsgående ikke-invasiv hele kroppen imaging passer utmerket til å informere på metastatisk utvekst, for som sådan er det vanskelig å forutsi nøyaktig tid og sted for forekomst. Hele kroppen 3D-bildebehandling har derfor vært på midten av metodeutvikling. For å lukke skala gapet mellom hele kroppen i vivo vedtatt bildebehandling og potensial nedstrøms ex vivo histologiske bekreftelse, en multi-skala tenkelig tilnærming basert på dobbel modus radionuklidenes-fluorescens reporter ble3, 6.
Fantes et positron utslipp tomografi (PET) er den mest sensitive 3D hele kroppen bildeteknologi tilgjengelig tilbyr utmerket dyp gjennomtrenging og absolutt kvantifisering7 med en oppløsning på < 1 mm8,9. Foreløpig kan prekliniske celle sporing på hele kroppen nivå av radionuklidenes bildebehandling oppdage cellene på tettheter ~ 1000 celler per volum million celler3,6 med oppløsning i sub-millimeter regionen. I motsetning til intravital mikroskopi, ikke kan identifiseres enkelt spre kreftceller, men det krever ikke kirurgiske prosedyrer (f.eks vindu chambers), er ikke begrenset til en liten synsfelt, og ikke av lav vev gjennomtrenging og scatter. Bioluminescens imaging er gir et rimelig alternativ, men tilknyttet scatter og lys absorpsjon problemer samt dårlig dyp gjennomtrenging, og dermed sterkt begrenset i kvantifisering2. Fluorescens hele kroppen imaging er brukt for kjøp av 3D-bilder, men det er mye mindre følsom sammenlignet bioluminescens eller radionuklidenes teknologier2. Likevel tilbyr fluorescens muligheten til å utføre ex vivo nedstrøms vev analyse av cytometri eller mikroskopi. Sistnevnte lukker skala-gapet mellom makroskopisk hele kroppen bildebehandling (mm oppløsning) og fluorescens mikroskopiske vev analyse (µm oppløsning)3. Derfor utfyller radionuklidenes og fluorescens modaliteter hverandre, mellom hele kroppen nivået (sub-) mobilnettet skalaen.
Reporter genet imaging er ideell for langvarig celle sporing som kreves i metastasering forskning. I dette programmet er bedre enn direkte celle merking som det er (i) ikke er berørt av etiketten fortynning og dermed ikke begrenset i å spore tid, og (ii) bedre reflekterer levende celle tall. Derfor er hele kroppen celle sporing spesielt nyttig for applikasjoner der sporbare celler sprer eller utvide i vivo, forskning for eksempel3,6, for påvisning av teratoma formasjon i stammen i kreft cellen forskning, eller for kvantifisering av immun celle ekspansjon5.
Ulike radionuklidenes-baserte reporter gener er tilgjengelig2. Disse inkluderer enzymer som herpes simplex virus HSV11 thymidine kinase (HSV1 –tk), transportører som natrium iodide symporter (NIS) eller noradrenalin transporter (NET) og celleoverflaten reseptorer som Dopamin D2 reseptor ( D2R). NIS er en glycosylated trans-membran protein som aktivt formidler iodide opptaket, for eksempel i follikulær celler i skjoldbruskkjertelen for påfølgende syntese av thyreoideahormoner10. Denne prosessen er drevet av symport av Na+ og avhengig mobilnettet natrium gradient, som vedlikeholdes av Na+/K+-ATPase11. Følgelig NIS bedre reflekterer levende celle tall enn andre journalister som iodide/radiotracer opptak er koblet til en aktiv Na+/K+ gradert i stedet for det blotte nærvær av transporter. Tradisjonelt, radioiodide er brukt for NIS bildebehandling. For cellen sporing, er alternativ NIS-radiotracers som ikke er metabolically fanget i skjoldbrusk rapportert å være overlegen6. Dette nylig utviklet PET radiotracer [18F] tetrafluoroborate ([18F] BF4–)12,13 viser overlegen farmakokinetikken sammenlignet med radioiodide6 samtidig tilgjengelig på høy spesifikke aktiviteter14 uten behov for komplisert radiochemistry fasiliteter. [18F] BF4– kan syntetiseres via to måter. Den første metoden er basert på isotop utveksling av ikke-radioaktivt 19F i BF4– med radioaktivt 18F12. Den andre metoden er gjennom tillegg av 18F ikke radioaktiv boron trifluoride14. Sistnevnte ble rapportert til høyere spesifikke aktiviteter14 og metoden valgfrihet for prekliniske bildebehandling.
NIS er svært uttrykt i skjoldbrusk vev. Det er også uttrykt i brystkjertlene salivary, lachrymal og ammende samt magen, men på lavere nivåer i forhold til skjoldbruskkjertelen10. Derfor kan ypperlig kontrast imaging i andre kroppen regioner oppnås ved hjelp av NIS. Det er også svært homologe mellom menneske, rotte og mus10. Videre er det ingen rapporter om toksisitet ved ektopisk NIS uttrykk i ikke-thyroidal celler. Viktigere, er NIS også ikke forbundet med verten immunreaksjoner, verken i mennesker eller i gnagere. NIS har blitt brukt som et reporter gen for å måle promoter aktivitet15,16,17 og gene expression18,19,20,21,22 ,23 i flere forskjellige sammenhenger. Det er også brukt for ikke-invasiv bildebehandling gene terapi vektorer24,25, og spore celler i cardiac4, blodkreft26, betennelse5og nevrale studier27. Nylig har NIS også blitt brukt som en reporter genet spore kreft metastasering i vivo3,6.
Oppsummert er de viktigste fordelene med denne metoden over tidligere teknikker: (i) svært følsom ikke-invasiv 3D i vivo lokalisering og kvantifisering av metastatisk spre, (ii) automatisert produksjon av [18F] BF4– på høy molar aktiviteter, (iii) en betydelig reduksjon i nødvendig dyr gjennom langsgående avbildning, (iv) oppkjøpet av sammenkoblede data fra senere tenkelig økter som resulterer i bedre statistiske data, som igjen ytterligere reduserer dyr bruk og (v) alternativet iboende ex vivo bekreftelse av kreftceller i vev av cytometri eller fluorescens mikroskopi.
Første skritt for å gjengi kreft celler sporbare i vivo ved denne metoden krever engineering dem å uttrykke NIS-FP fusion reporteren. Valg av fluorescerende proteinet i fusion reporteren er kritisk oligomerizing fluorescerende proteiner kan føre til kunstig reporter klynging, dermed negativt påvirker dens funksjon. Vi har hatt suksess med bevist monomerisk fluorescerende proteiner som mEGFP (med monomerizing mutasjon A206K36,37), mTagRFP eller mCherry. NIS kan enten være menneske eller musen opprinnelse (hNIS eller msNIS) avhengig av eksperimentet og kreft modellen. Signaltransduksjon effektivitet generelt varierer mellom ulike kreftcelle linjer. Imidlertid blir genererte kreftcelle linjer deretter renset ved FACS i denne protokollen, og dermed redusere behovet for å optimalisere signaltransduksjon forhold. Signaltransduksjon med høy mangfoldighet av infeksjon er ikke alltid tilrådelig som flere konstruere integrering i genomet trolig føre ikke bare i høyere konstruere uttrykket, men også i mer uønsket/uregulert genomet modifisering. Derfor er det viktig å la polyklonale transduced cellene vokse stabilitet uttrykk (overvåket av flowcytometri) og unngå sortering smarteste kloner av FACS. Det gjør også funksjonelle validering av ikke-reporter funksjoner avgjørende før disse cellene skal brukes for i vivo eksperimenter. En nylig utviklet alternativ til viral gen levering er genet redigering teknologi38, som gir mer kontroll over viral integrering områder. Uttrykket analyse av flowcytometri og immunoblotting er viktig. Flowcytometri lar oppkjøpet av befolkningen-baserte enkeltcelle data, for eksempel undersøke om det er noen drift i reporter uttrykk nivåer over tid. Det er avhengig av FP moiety, med mindre celler er også farget med et antistoff rettet mot overflaten eller totale NIS. Flowcytometri informerer ikke på fusion reporter integritet. Derimot rapporterer immunoblotting om integriteten til fusion reporteren. Molekylvekt av NIS og FP må legges til fastslå den forventede Molekylvekten av den valgte NIS-FP. AC Confocal fluorescens mikroskopi vist fusion reporter colocalization med plasma-membran markør hvetespirer agglutinin i alle nylig laget linjer. Dette var forventet mobilnettet mesteparten av protein og indikerte en klarsignal milepæl for påfølgende funksjonelle validering. Hvis minimal/nei NIS-FP ble funnet på plasma membranen (f.eks i interne cellulære avdelinger) dette skulle tilsi en celle biologiske problemet med fusion reporter på denne cellen, eller en mulig mutasjon av fusion reporteren påvirker sin intracellulær menneskehandel. Det er bemerkelsesverdig at vi ikke har observert så fall i noen av kreftcellene vi testet så langt som: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (menneskelige melanom); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (menneskelige brystkreft); NCI-H1975 (menneskelige lungekreft); SK-Hep1 (menneskelige leverkreft); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (murine inflammatorisk brystkreft); B16F0, B16F3, B16F10 (murine melanom); MTLn3 (rat bryst adenocarcinoma).
NIS-funksjonen må måles med opptak analyser med radioaktive NIS underlag. På grunn av SPECT radiotracer 99 mTcO4– å være generator-produsert og derfor tilgjengelig i sykehus uten behov for noen radiotracer syntese, samt å ha en mer praktisk lengre halveringstid (6.01 h 99 m TC sammenlignet med 110 min 18F), vi brukt denne NIS substrat til rutinemessig funksjonelle validering av nye NIS-FP uttrykke linjer. Pre blokkering av NIS-uttrykke celler med NIS co substrat natrium-perklorat resulterte i forventet reduksjon/opphevelse av radiotracer opptak, og dermed demonstrere spesifisitet av radiotracer opptak. Denne NIS spesifisitet testen er en kritisk valideringstrinnet. Hvis et NIS spesifisitet eksperiment ikke ville medføre redusert radiotracer opptak sammenlignes med de respektive foreldrene cellene, enten det har oppstått en teknisk feil under eksperimentet eller radiotracer opptaket var ikke på grunn av NIS. Det er også mulig at natrium perklorat pre blokkerer reduserer radiotracer opptak i foreldrenes celle linjen. Dette vil identifisere linjer med endogene funksjonelle NIS uttrykk (f.eks stimulert thyroid cellene6).
En viktig fordel av denne imaging-protokollen er at informasjonen samles i 3D og over tid. Dette gjør at sammenligningen bilder fra samme dyret over tid, og dermed gir sammenkoblede data og dermed overvinne problemene forårsaket av Inter dyr variasjon. Dette gir kontrast til de fleste ikke-imaging relaterte metastasering vurderingsmetoder som er basert på å ofre forskjellige dyr på ulike tidspunkt. I figur 3B er det tydelig hvordan metastatisk spredning og utvekst kommet over tid i et enkelt dyr. Signalene oppdaget av PET/CT tenkelig fundamentalt skyldes NIS uttrykk. Dette inkluderer alle signaler fra NIS-uttrykke kreftceller exogenously samt alle organer endogenously uttrykke NIS. Typisk endogene NIS signaler finnes i skjoldbrusk og spyttkjertler, magen, og, på et lavt nivå i noen deler av mammary og lachrymal kjertler. I tillegg til endogene NIS uttrykk, er NIS radiotracer [18F] BF4– også utskilles via nyrene, og dermed forklarer radiotracer opptak i urin-fylt blærer. Nyre opptak er ikke lenger synlig på tenkelig tidspunktet anbefalt i denne protokollen (45 min post radiotracer injeksjon6). Hvis signaler fra urin-fylt blærer bør føre til problemer med signal-til-bakgrunn, kan blæren tømmes mekanisk under anestesi før bildebehandling. Viktigere, kan endogen signalene variere mellom dyr stammer. Det er også bemerkelsesverdig at endogene NIS uttrykk i brystkjertlene kan være høyere under ammende forhold10. I presenterte saken og i tilfeller av disse metastatisk cellelinjer vellykket preget før (jf. listen ovenfor), fant vi ikke endogene NIS uttrykk betydelig forstyrre metastasering gjenkjenning. Det er bemerkelsesverdig, at [18F] BF4– er mer tilgjengelig for opptak i kreft vev i forhold til iodide, fordi iodide metaboliseres i skjoldbrusk hormoner6. Dette fenomenet kan også bidra til større mengder radioiodide i blodet i forhold til [18F] BF4– 6. Dette kan variere for forskjellige programmer (kreftcelle sporing i andre kreft eller ikke-kreft cellen sporingsprogrammer), og det anbefales derfor å vurdere om endogene NIS uttrykk er sannsynlig forårsake signal-til-bakgrunn spørsmål gjennom Foreløpig eksperimenter. Et viktig aspekt i preklinisk bildebehandling er molar aktiviteten til radiotracer. Metoden beskrevet her bruker ~1.5 GBq 18F– som starter materiale14 og har vist seg å produsere molar aktiviteter betydelig over de tidligere rapportert erstatning metoden12. [18F] BF4– produsert ved molar aktiviteter ≤1 GBq/µmol12 kan føre til redusert opptak i NIS-uttrykke vev. Dette er spesielt viktig når injisert mengden radioaktivitet per kilo er høy, dvs når små dyr som mus er fotografert39; Det er mindre viktig i den menneskelige sette40. Høy molar aktiviteter er derfor viktig for høykvalitets prekliniske PET bildebehandling. Molar aktiviteter ved den boron trifluoride tillegg metode14, som vises i sin automatisert form i denne protokollen, overvinne dette problemet. Videre, det er bemerkelsesverdig at presentert protokollen for [18F] BF4– -syntese ikke er kompatibel med god produksjon praksis (GMP) og derfor uegnet for bruk i kliniske studier i dette skjemaet. En GMP-protokoll (via 18F erstatning metoden å radiolabel BF4–) er tilgjengelig andre steder40.
PET/CT bildebehandling kan visualisering av radiotracer opptak, som antyder NIS-mediert radiotracer opptak stammer fra NIS-FP uttrykke kreftceller. Enda viktigere, kan tilknyttede PET signalene kvantifiseres. Det er nødvendig å bruke pålitelig terskelverdi prosedyrer for å sikre en konsekvent og upartiske differensiering av relevante signaler fra noen potensielle bakgrunn. Som bakgrunnen varierer i ulike steder i vivo, er det viktig å vurdere lokale og regionale terskelverdi og segmentering. En slik metode ble utviklet av og oppkalt etter Otsu34, og gjennomføringen 3D er ansatt for 3D-gjengivelse av den primære svulsten og metastaser i denne protokollen. Vanligvis svarer bildet sett av observatøren visuelt best til kvantifisert % injisert dose (% ID) verdiene. For avbildningsbasert kvantifisering er det også viktig å normalisere målt radioaktivitet verdiene av ulike vev til volumene. Det er hovedsakelig brukt på to måter å uttrykke normaliserte resultatene, (i) % ID per (f.eks %ID/mL), og (ii) standard opptak (SUV35). De forskjellige ved at %ID/mL tar hensyn til individuelle volumet, mens SUV er et mål som er relativ til den gjennomsnittlige radioaktiviteten over hele dyret. Det er også viktig å merke seg at NIS imaging gjør live svulst volumet (LTV) tilgjengelig, fordi døde/døde celler ikke syntetisere ATP kan ikke lenger importere radiotracer10. Dette forklarer store lav signal området innenfor den primære svulsten (“bolle formet” tumor) angir arealer av svulst celle død/nekrose. Viktigere, var LTV en mye mer pålitelig måling av svulst byrden i forhold til rå svulst volumet tilgjengelig med skyvelære målinger (som ikke tar konto levedyktighet og vurderer bare overfladisk svulst regioner).
En stor fordel med denne dobbelt-måte sporing strategien er tydelig når høsting vev etter dyr culling. Guidet av i vivo bilder og assistert av fluorescerende kreftceller under dyr disseksjon, kan små og dyptliggende organer/metastaser også pålitelig høstes. Frossent bevaring/snitting metodikk kan direkte fluorescens avbilding av GFP uten flekker med et anti-GFP antistoff, men på bekostning av redusert strukturelle vev bevaring sammenlignet med formalin-fast parafin-embedded metodikk (FFPE). Sistnevnte krever kritisk også anti-FP flekker, fordi metoden FFPE er kompatibel med intakt bevaring av fluorescerende proteiner (på grunn av fiksering/dehydrering/rehydrering). Mens fluorescens signalet er et tegn på tumor celle tilstedeværelse, er det viktig å sikre denne klassifiseringen er bekreftet av ex vivo radioaktivitet målinger av høstet vev (‘biodistribution’). Ex vivo radioaktivitet målinger er mer følsomme enn visuell gjenkjenning av fluorescens, dermed kan tillate identifikasjon av kreft celle-avhengige signaler som ville ellers forblir usett. Hvis en terminal imaging økten, det er viktig å nøyaktig merke injisert radiotracer beløpene i tillegg til tider radiotracer radioaktivitet målinger, dyr injeksjon, dyr culling, og kalibrert scintillation telleren målinger av høstet vev. Dette er avgjørende for å sikre korreksjon for radiotracer forfall og dermed aktivere pålitelig biodistribution analyse.
PET/CT imaging kan gjentas ikke-invasiv 3D kvantifisering av svulst progresjon inkludert vurdering av metastatisk spredt på hele kroppen nivå. Denne funksjonen er en betydelig fordel over konvensjonelle metoder, som ofte avhengige av store kohorter av dyr som er euthanized for vurdering av svulst progresjon på forskjellige tidspunkt. Fordelene med denne imaging tilnærming er: (i) svært følsom ikke-invasiv 3D i vivo kvantifisering, (ii) en betydelig reduksjon i dyr tall på grunn av muligheten for gjenta imaging, (iii) oppkjøp av langsgående sammenkoblede data fra påfølgende imaging økter å forbedre statistikk ved å ekskludere Inter dyr variasjon, noe som igjen ytterligere reduserer dyr tall, (iv) automatisert produksjon av [18F] BF4– på høy bestemte aktiviteter, og (v) den iboende alternativ for ex vivo bekreftelse i vev av fluorescens metoder som mikroskopi eller cytometri.
I vivo celle sporing er et voksende felt. Det har vært drevet av nylige fremskritt i imaging teknologi, som resulterte i forbedret oppløsning, oppdagelsen grenser og multiplex evne (via multimodal imaging). I denne protokollen bruker vi dette begrepet for å spore svulst progresjon inkludert spontan kreft cellen metastasering i 3D av gjenta tenkelig. Programmer omfatter studier unraveling mekanismer for spontane kreft cellen metastasering. Sporbare kreftceller kan for eksempel brukes til å studere virkningen av ulike immun celle komponenter (som dag/funksjonelle i dyr stammer av ulike nivåer av immunocompromisation) på metastatisk prosessen. Tilsvarende kunne effekten av enkelte gener, enten i dyr belastning eller kreft cellen linjen, studeres. Videre kan presentert protokollen brukes til å vurdere/validere effekten av spesifikke medikamenter eller terapeutisk konsepter på svulst progresjon. Viktigere, denne reporteren gene: radiotracer par for PET imaging (NIS: [18F] BF4–) kan også brukes for ulike celle sporingsprogrammer. For eksempel dukker flere cellen terapi for tiden som lovende terapeutiske metoder. Dette inkluderer mobilnettet therapeutics for kreft behandling41 , men også i transplantasjon42 og regenerativ medisin43,44 innstillinger. Hele kroppen i vivo celle sporing blir stadig viktigere for utvikling og klinisk oversettelse av mobilnettet therapeutics, for eksempel for å vurdere sikkerheten og terapi overvåking.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen ble støttet av King’s College London og UCL omfattende kreft Imaging sentrum, finansiert av kreftforskning Storbritannia og EPSRC i samarbeid med MRC og DoH (England); National Institute for Health Research (NIHR) biomedisinsk forskningssenter basert på guys og St. Thomas’ NHS Foundation Trust og King’s College London; Senter for fremragende i medisinsk Engineering finansiert av Wellcome Trust og EPSRC under gi nummer WT 088641/Z/09/Z..; en kreft UK tverrfaglig prosjekt forskerpris GOF og PJB og en Kings helse partnere stipend for GOF. Det nanoPET/CT og nanoSPECT/CT skanner ble kjøpt og vedlikeholdes av en utstyr stipend fra Wellcome Trust. Synspunktene er de av forfatterne, og ikke nødvendigvis de NHS, NIHR eller DoH.
Step 1) Engineering and characterization of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP. | |||
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole | Thermo Scientific | H3570 | Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water. |
4T1 murine breast cancer cell line | ATCC | CRl-2539 | for details see ATCC website |
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter | Roche Diagnostics GmbH | 5651697001 | CASY Model TT Cell Counter and Analyzer |
CASYclean Cleaning Reagent | Sedna Scientific | 2501036 | |
CASYton Isotonic Diluent | Sedna Scientific | 2501037 | |
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis | |
Cover slips No. 1.5 thickness | VWR International | 631-0150 | |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
DMEM | Sigma | D5546 | Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells. |
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III | BD Biosciences | Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) – cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead. |
L-glutamine | Sigma | G7513 | Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered |
Linear polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line. |
MDA-MB-231 human breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | for details see ATCC website |
Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
pLNT SFFV NIS-mEGFP | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pLNT SFFV NIS-mCherry | request from our lab | n/a | For details (generation and maps) see Supplementary Information |
pMD2.G | Addgene | #12259 | plasmids encoding for the VSV-G envelope |
pRRE | Addgene | #12251 | packaging plasmid |
pRSV-Rev | Addgene | #12253 | packaging plasmid |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P43330 | Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride |
Poly(vinyl alcohol – vinyl acetate) | Polysciences | 17951 | Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5 |
Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833 | From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water |
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge | Hettich Lab Technology | ||
RPMI 1640 | Sigma | R0883 | Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells. |
SFCA Syringe filter 0.45 μm | Corning | ||
Syringes 10 mL | BD Emerald | Disposable non-sterile syringes | |
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL | Life Technologies | Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera | |
Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma | 59418C | (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red |
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate | Life Technologies | W21404 | Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence |
Step 2) Establishment of in vivo tumor models. | |||
Digital caliper | World Precision Instruments | 501601 | |
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm | |
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance | |||
Step 3) Production of [18F]BF4– using an automated radiotracer synthesis platform. | |||
15-crown-5 | Sigma-Aldrich | 188832 | CAS 33100-27-5 |
Acetonitrile (anhydrous) | Acros Organics | 326811000 | |
Boron trifluoride diethyl etherate | Sigma-Aldrich | 216607 | BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7 |
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab | GE Healthcare | ||
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes | GE Healthcare | FASTlab Developer pack | |
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets | Macherey-Nagel | 802021 | RadioTLC plates, 40×80 mm |
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light | Waters | WAT023525 | Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL) |
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light | Waters | WAT023561 | Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL) |
Water for injection USP | GE Healthcare | ||
Nitrogen filter | Millipore | SE2M049I05 | Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm |
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT. | |||
Isoflurane 1000 mg/g | Isocare | For inhalation | |
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1) |
Rodent anesthesia induction chamber | Vet-Tech | AN010R | With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m) |
Rodent anesthesia system | Vet-Tech | AN001B | Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer |
Sterile physiological saline | Thermo Scientific Oxoid | BO0334B | |
Syringes 0.3 mL U-100 insulin | Terumo | 29G × 1/2'' – 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer | |
Veterinary Scavenger | Vet-Tech | AN200 | VetScav filter weighing mechanism – 240 V with automatic temperature compensation and LED system |
5) In vivo data analysis. | |||
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm | Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary | ||
VivoQuant Software | Invicro LLC., Boston, USA | ||
6) Ex vivo analyses | |||
2-Methylbutane | Sigma | 59070-1L-D | Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 85040C | |
Cover slips 22×50 mm | VWR International | SMITMCQ211022X50 | |
Cryostat, e.g. Cryostat MNT | SLEE Medical | two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate | |
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson/Stratech | 111-175-144 | Used at 1:500 (2 µg/mL) |
Dabco | Sigma | 290734 | Stock 125 mg/mL |
Microtome blades, e.g. Feather S35 | CellPath | ||
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5 | |
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma | LKB Wallac Laboratory | 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV | |
Hoechst 33342 solution | Life Technologies | H1399 | |
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter | Electron Microscopy Sciences | SFA-LFS-RBS/GR | Equipped with GFP and RFP emission filters |
O.C.T. compound | VWR international | 361603E | |
Wax pen, e.g. PAP-PEN | Dako UK Ltd | Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes | |
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence |
Microscope slides, e.g. Superfrost slides | VWR, Lutterworth, UK | ||
Tris-buffered saline (TBS) | available from various suppliers. | Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4 |