Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Радионуклида флуоресценции Репортер ген Imaging для отслеживания опухолевой прогрессии в моделях грызунов опухоли

doi: 10.3791/57088 Published: March 13, 2018

Summary

Мы описываем протокол для отслеживания доклинических в естественных условиях метастазов рака. Он основан на радионуклида флуоресценции репортер, сочетая Симпорт йодида натрия, обнаружены неинвазивные [18F] Тетрафтороборат PET и флуоресцентный белок для подтверждения обтекаемый ex vivo . Метод применим для доклинических в vivo ячейки слежения за пределами биология опухоли.

Abstract

Метастазирование несет ответственность за большинство случаев смерти от рака. Несмотря на обширные исследования механистического понимания сложных процессов, регулирующих метастазов остается незавершенной. В естественных условиях модели имеют первостепенное значение для исследований метастазов, но требуют доработки. Отслеживание спонтанное метастазов неинвазивные в vivo изображений теперь возможна, но остается сложной, как требует длительного наблюдения и высокую чувствительность. Мы описываем продольной комбинированных радионуклидов и флуоресценции всего тела в vivo imaging подход для отслеживания прогрессии опухоли и спонтанное метастазов. Эта методология гена репортера использует Симпорт йодида натрия (ННГ), сливается с флуоресцентный белок (FP). Раковые клетки предназначены для стабильно Экспресс NIS-FP, после отбора на основе активированного флуоресценции клеток сортировки. Соответствующие модели опухоли, установлены в мышей. NIS-FP, выражая раковые клетки считано неинвазивно в естественных условиях на уровне всего тела, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) с помощью NIS радиоиндикаторных [18F] BF4. ПЭТ в настоящее время является наиболее чувствительным в vivo imaging технологии, доступные в этом масштабе и дает надежные и абсолютной количественной оценки. Текущие методы полагаются на большой когорты животных, которые умерщвлено для оценки метастазов в различные моменты времени, или полагаться на едва количественному 2D изображения. Преимущества метода описаны являются: (i) высокочувствительный неинвазивные в vivo 3D PET изображений и количественной оценки, (ii) автоматизированные производства ПЭТ трассирующими, значительное сокращение числа требуемых животных из-за повторных изображений вариантов, (iii) (iv). приобретение парных данных из последующих сессий изображений, обеспечивая лучше статистические данные и (v) параметр встроенные ex vivo подтверждения раковых клеток в тканях микроскопии флуоресцирования или цитометрии. В этом протоколе мы опишем все шаги, необходимые для обычной NIS-FP-предоставлена неинвазивные в vivo рак клеток отслеживания с помощью ПЭТ/КТ и ex vivo подтверждения результатов в естественных условиях . Этот протокол имеет приложений за пределами онкологии, всякий раз, когда в vivo локализации, расширение и давним мониторинг популяции клеток представляет интерес.

Introduction

Метастатической болезни является причиной большинства связанных с раком смерти 1. Несмотря на обширные исследования в метастатических процессов надежный мониторинг метастазов рака в животной модели систем трудно достичь. Последние достижения в технологии визуализации всего тела и мульти-модальных изображений подходы позволили неинвазивные в vivo ячейки отслеживания2,3,4,5. Последний может использоваться как инструмент для мониторинга присутствия, распределение, количество и жизнеспособность клеток, неинвазивно и неоднократно в живое животное или человека.

Цель метода, описанного здесь является продольно и неинвазивным отслеживать раковые клетки в 3D в живых грызунов опухоли модели. С помощью этого метода, исследователи смогут точно подсчитать прогрессии опухоли, включая распространение метастазов в 3D. По сравнению с традиционными методами на основе изображений, этот метод предлагает приобретение количественных данных с главным образом сокращением поголовья. Еще одной особенностью этого метода является, она позволяет корреляции в vivo изображений с обтекаемый течению ex vivo анализ гусеничных клеток в тканях заготовленной на гистологию или цитометрии3,6.

Основанием для разработки этого метода было предоставить в vivo инструмент для мониторинга и количественной оценки всей метастатического процесса в модели грызунов опухоли. Важно то, что он был разработан, чтобы свести к минимуму использование животных в то же время снижение изменчивости между животных. Продольные неинвазивной визуализации всего тела отлично подходит для информирования о метастатическим нарост, для которых само по себе это трудно точно предсказать время и место его возникновения. 3D визуализация всего тела поэтому был в центре разработки метода. Чтобы закрыть масштаб разрыва между всего тела в vivo изображений и потенциал, которые течению ex vivo гистологического подтверждения, многомасштабный изображений подход, основанный на двухрежимные радионуклидов флуоресценции репортер был принят3, 6.

Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) является наиболее чувствительных тела изображений технологии 3D имеющихся в настоящее время, предлагая отличную глубину проникновения и абсолютной количественная оценка7 с разрешением < 1 мм8,9. В настоящее время доклинические ячейки отслеживания на уровне всего тела с радионуклидной визуализации может надежного выявления клеток при плотностях ~ 1000 ячеек на объем миллиона клеток6 3,с резолюциями в регионе Подкомиссии миллиметр. В отличие от прижизненной микроскопии он не может обнаружить одно распространение раковых клеток, но она не требует хирургических процедур (например , окно камеры), не ограничена, небольшое поле зрения, а не низкой ткани проникновения и разброс. Биолюминесценции изображений предоставляет недорогой альтернативой, но ассоциируется с рассеяния и поглощения света вопросы, а также бедных глубина проникновения и в квантификации2серьезно ограничены вследствие. Флуоресценции всего тела изображения была использована для приобретения 3D изображения, но это намного менее чувствителен, по сравнению с биолюминесценции или радионуклидных технологий2. Тем не менее флуоресценции предлагает возможность анализа ex vivo течению ткани цитометрии или микроскопии. Последний закрывает масштаба разрыв между макроскопического тела изображений (разрешение мм) и флуоресценции микроскопические ткани анализ (резолюция мкм)3. Таким образом радионуклидов и флуоресценции механизмы дополняют друг друга, начиная с уровня всего тела к шкале сотовой (суб-).

Репортер ген изображений идеально подходит для длительного ячейки отслеживания необходимости в исследованиях метастазов. В этом приложении он превосходит прямой клеток маркировки как это (i) не влияет на этикетке разрежения и таким образом не ограничивается в отслеживания времени и (ii) лучше отражает число живых клеток. Следовательно особенно полезно для приложений, в которых прослеживается клетки размножаются или расширить в естественных условиях, например в рак исследований3,6, для обнаружения тератома формирования в стволовых клеток тела отслеживания клетки исследование, или для количественной оценки иммунных клеток расширения5.

Различных радионуклидов основе репортер гены являются доступны2. К ним относятся ферментов, таких как герпес симплекс вирус HSV11 Тимидинкиназа (HSV1 -ТЗ), конвейеры таких Симпорт йодида натрия (NIS) или норадреналина транспортера (нетто), а также поверхности рецепторы клеток как допамин (рецептор D2 D2R). НИС – гликозилированного транс мембранный белок, который активно опосредует поглощение йодида, например в фолликулярных клеток щитовидной железы для последующего синтеза гормонов щитовидной железы10. Этот процесс управляется symport Na+ и опирается на клеточном натрия градиента, который поддерживается Na+/k+-АТФазы11. Следовательно, NIS лучше отражает живые клетки чем другие журналисты, как поглощение йодида/радиоиндикаторных связано с активной Na+/k+ градиент, а не простое присутствие транспортера. Традиционно, используется radioiodide для NIS воображения. Для отслеживания ячейки, Улучшенный6сообщалось альтернативные radiotracers NIS, которые не являются метаболически захваченного в щитовидной железе. Это недавно разработанных Тетрафтороборат PET радиоиндикаторных [18F] ([18F] BF4)12,13 показывает превосходное фармакокинетики по сравнению с radioiodide6 во время доступна на14 высоких конкретных мероприятий без необходимости использования сложных радиохимии зал. [18F] BF4может быть синтезирован через двумя различными способами. Первый метод основан на изотопного обмена нерадиоактивные 19F в BF4 с радиоактивными 18F12. Второй способ — через дополнение 18F нерадиоактивные бора трифторид14. Последний метод было сообщено доходность выше конкретных мероприятий14 и является методом выбора для доклинических воображения.

NIS высоко выражается в тканях щитовидной железы. Это выражается также в слюнных, слезных и кормящих молочных желез, а также желудка, но на более низком уровне по сравнению с щитовидной железы10. Таким образом отличную контрастность изображений в других регионах тела может быть достигнуто с помощью службы NIS. Это также весьма гомологичных между человеком, крысы и мыши10. Кроме того Есть никаких сообщений о токсичности после внематочной NIS выражение в не тороидальной клетках. Важно отметить, что NIS также не был связан с принимающей иммунные реакции, ни людей, ни грызунов. ННГ был использован как репортер ген для измерения промоутер деятельности15,16,17 и ген выражение18,19,20,21,22 23 ,в нескольких разных контекстах. Он также был использован для неинвазивной визуализации генной терапии векторов24,25и отслеживать клетки в сердечной4, кроветворные26, воспаление5и нейронных исследований27. Недавно НИС также использовалась как репортер ген для отслеживания метастазов рака в естественных условиях3,6.

Таким образом, основными преимуществами данного метода за предыдущие методы являются: (i) высокочувствительный неинвазивные 3D в vivo локализации и количественной оценки метастатического распространения, (ii) автоматизированное производство [18F] BF4 в Высокая молярная деятельность, (iii) значительное снижение требуется животных через продольной томографии, (iv) получение парных данных из последующих сессий изображений, что приводит к улучшению статистических данных, которые в свою очередь еще больше снижает использование животных и (v) встроенный вариант для ex vivo подтверждения раковых клеток в тканях, цитометрии или флуоресцентной микроскопии.

Protocol

Этот протокол отвечает всем требованиям, установленным законодательством Соединенного Королевства (UK) и местные этические обзору. Когда после этого протокола, убедитесь, что процедуры также отвечают всем требованиям, продиктовано национальное законодательство и местные этические обзору. Убедитесь, что каждый эксперимент с участием радиоактивности, совместимые с законодательством и местные правила и безопасно выполняться.

1. Проектирование и характеристика раковых клеток выразить радионуклидов флуоресценции фьюжн репортер NIS-FP

Примечание: Для простоты, mEGFP A206K обозначается как «ГФП» и mCherry как «ППП» в последующих разделах настоящего Протокола.

  1. Поколение лентивирусные частиц
    1. Производить человека частицы, совместно transfect 293T клетки с следующие четыре плазмид, используя подходящий transfection метод: (i) кодирования плазмида Репортер ген (pLNT SFFV NIS-GFP или pLNT SFFV NIS-RFP (см. дополнительную информацию), (ii третьего поколения лентивирусные упаковки плазмид pRRE и (iii) pRSV-Rev и (iv), содержащей конверт вирус плазмида, например, pMD2.G. Предварительно Смешайте плазмид перед их добавлением в смесь transfection. Выполняют трансфекции в капюшоне культуры клеток.
      Примечание: Дополнительные трансфекции информация предоставляется в дополнительной информации.
    2. Оценить трансфекции успех после 48 ч, стандарт-поля флуоресцентной микроскопии с фильтром соответствующие настройки для выбранной фьюжн репортер (NIS GFP или NIS-RFP).
      Примечание: Флуоресценции сигналы являются показателем Репортер ген transfection и поэтому только суррогат для успешного сотрудничества трансфекции, не показатель успешной вирусной производства.
    3. Урожай-содержащих частиц супернатант вирус с помощью шприца и удалить плавающие клеток и клеток мусора путем фильтрации посредством фильтра 0.45 мкм стерильным Полиэфирсульфон (PES). Переезд в стерильных 1,5 мл полипропиленовые реакции. Выполнять работу вирус в капюшоне культуры клеток и убедитесь, что живой вирус не оставляет автономной среде.
  2. Трансдукция и подбор NIS-FP выражая рак клеточных линий
    1. Используйте чистый свежий вирус от шага 1.1.3 смешанные 1:1 (v/v) с оптимального роста среднего каждой линии клеток рака (DMEM для клеток MDA-MB-231 и RPMI 1640 для 4T1 клеток; см. таблицу материалов для СМИ композиции). Выполняют трансдукции в капюшоне культуры клеток.
      Примечание: Более общий протокол именуется в дополнительной информации.
    2. Передают раковых клеток с вирусом содержащих средних в инкубаторе с увлажненной атмосфера, содержащая 5% (v/v) CO2 при 37 ° C за 72 ч (работа 6-ну или 12-ну масштабе с использованием 1 мл или 0,4 мл смеси вирус от шаг 1.2.1).
    3. Контролировать целевой ячейки NIS-FP выражение микроскопии флуоресцирования.
    4. Разверните узел успешно transduced клетки к шкале 3-10 миллионов клеток с использованием стандартных культуры условий (см ATCC MDA-MB-231 и 4T1 клеточных линий).
    5. Используйте активированный флуоресценции клеток, сортируя (FACS), чтобы очистить NIS-FP выражая клетки от клеток не преобразованы.
      Примечание: СУИМ может быть источником микоплазменной инфекции; рекомендуется для проверки микоплазмы перед вирусом производства и трансдукция но и после СУИМ и шаг 1.3.
  3. Характеристика NIS-FP выражая рак клеточных линий
    1. Подтвердите репортер выражение стандартных проточной цитометрии, как описано в других разделах28.
    2. Подтвердите целостность репортер на стандартных immunoblotting, как описано в других местах29.
    3. Анализировать внутриклеточный синтез репортер локализации конфокальный флуоресцентной микроскопии.
      Примечание: Пятнать с или совместно выражением плазматической мембране маркер6 и последующего совместного локализации анализ30 облегчит этот шаг.
    4. Анализируйте радиоиндикаторных поглощения в ННГ-FP, выражая клеточных линий.
      Примечание: Подходит любой радиоактивный NIS субстрата, совместимым с существующим оборудованием, например изотопы йода (123я-, 124я-, 125я-, 131я), 99 m ТШО4-,-, 188ReO4[18F] так3F или [18F] BF4.
      1. Семян 106 очищенной ячейки 6-ну пластины в их среде оптимального роста (см. таблицу материалы) один день перед эксперимент. Подготовить все образцы в трех экземплярах и включать примеры элементов управления: (i) «Специфика управления», т.е. NIS-FP выражая клетки предварительно инкубировали с конкурентоспособной NIS субстрат для тестирования специфика поглощения; (ii) «родительский мобильный контроль», т.е. клетки, не выражая NIS-FP, но получение радиоиндикаторных проверить базальной поглощения в родительских клеток.
      2. На следующее утро Вымойте клетки один раз с среднего роста сыворотки бесплатно.
      3. Инкубации клеток в среде свободных сыворотки роста в присутствии 50 КБК 99 mТШО4 или [18F] BF4 для 30 минут при 37 ° C (1 мл общий объем). Для элементов управления, специфика, предварительно Инкубируйте клетки для 30 минут с конкурентоспособной субстрата NaClO4 (12,5 мкм конечная концентрация). Сохранить концентрацию конкурентных субстрата постоянной на протяжении всего эксперимента.
      4. Собирать супернатант и передачи 100 мкл подготовленные коллекции трубки помечены «супернатанта».
      5. Вымойте клетки дважды с 1 мл ледяной фосфат амортизированное saline (PBS) содержащий Ca2 +/Mg2 +. Собирать каждый промывочный раствор и передачи 100 мкл каждого в трубку подготовлен сборник под названием «wash1» или «wash2», соответственно.
      6. Поднимите клетки путем добавления 500 мкл PBS содержащие 0,25% (w/v) трипсина и 0.53 мм ЭДТА и инкубации при 37 ° C, пока клетки (проверить визуально с помощью микроскопа). Передача подвеска в подготовленные коллекции трубку с надписью «клетки». Промыть лунки с 500 мкл ледяной PBS содержащие Ca2 +/Mg2 + и добавить к трубе «клетки». Пелле клетки центрифугированием (250 x g, 4 мин, 4 ° C).
      7. Количество всех четырех типов образцов из каждой хорошо с использованием гамма надлежащим образом противостоять набор для радиоизотопных выбора (здесь: 99 mТС или 18F).
        Примечание: Из-за большого числа проб в этот assay, рекомендуется использовать автоматизированные γ-счетчик способны автоматических распада коррекции.
      8. Анализ данных путем суммирования полученных гамма количество проб от каждой скважины, чтобы определить количество общая радиоактивность в колодец.
        Примечание: взять aliquoting в шагах 1.3.4.4 и 1.3.4.5 во внимание путем умножения чисел 10 для «супернатанта» и «стирать» фракции.
      9. Экспресс сотовой радиоиндикаторных поглощения как % поглощения, как указано в Equ.1. Рассчитайте средние и стандартных отклонений от трех экземплярах экспериментов.
        Equation 1(Equ.1)
        Примечание: Описаны здесь, репортер проверки эксперименты, но не связанных с репортером клеточных функций (например распространения, вторжение раковых клеток, экспрессии генов и т.д.) являются в конечном итоге приложения и ответственность каждого пользователя.

2. Создание в vivo опухоли моделей

  1. Использование только полностью характеризуется и проверены клетки для экспериментов в естественных условиях . Проверьте флуоресценции клеток до администрации, любой подходящей техники (например микроскопии флуоресцирования, проточной цитометрии) каждый раз.
  2. Создать модель опухоли в возрасте 5-6 недель молодых самок мышей. Используйте BALB/cAnNCrl или мышей BALB/cAnN.Cg-Foxn1ню (голая BALB/c) для модели 4T1 опухоли и КИВНУЛ. ТКИД CG-Prkdc Il2rgtm1WjI/SzJ (ГЯП) мышах для опухоли MDA-MB-231-на основе модели. Брить животных локально и использования асептической техники. Непосредственно ввести 50 мкл суспензии, содержащей 106 NIS-FP выражая раковых клеток/мл в молочной железы жировой ткани между четвертой и пятой ниппель31.
    Примечание: Для повышения точности инъекций, рекомендуется выполнять инъекции под наркозом с использованием вдыхаемые анестетики например изофлюрановая (1-2% (v/v) в O2).
    Примечание: Хирургической имплантации опухоли произведений из NIS-FP выражая опухоли является альтернативный подход к опухоли модель создания31.
  3. Проверьте флуоресценции клеток на инъекции сайтов после приема и в первые дни поста инъекции. Используйте флуоресценции факел и фильтр очки подходят для FP выбора.
  4. Контролировать рост опухоли и проверить наличие каких-либо клинических признаков (особенно в позднее время очков).
    Примечание: Для поверхностных опухолей, т.е. ортотопическая груди опухоли в этот протокол, использование суппортов и формула для диаметр среднее опухоли (МПД) = ½· (L + W) 32.

3. производство [18 F] BF 4 с помощью автоматизированных радиоиндикаторных синтеза (ARS) платформы.

Примечание: Здесь, описан синтез4 BF автоматизированных [18F], основанный на методе 18F дополнение к трифторида бора. Пользователи более широко доступны платформы ARS (см. таблицу материалы), можете скачать соответствующий файл расширяемого языка разметки (XML), необходимые для выполнения автоматизированной последовательности на этой платформе (дополнительный файл). Подробное объяснение структуры кассеты, показанный на рисунке 1 приводится в (Таблица 1), а также детальное описание каждого шага в XML-файле последовательности (Таблица 2) для поддержки перевода на любой другой автоматизированные платформы.

  1. Настройка платформы ARS, как описано в таблице 1 и убедитесь, что она функционирует с правильным XML-файл загружается на компьютер управления. Убедитесь, что платформа ARS помещается в химической капюшон подходит для безопасной работы с GBq количество радиоактивности.
  2. Аспирационная циклотрона производства [18F] F (обычно 1,5-2 ГБК 2-7 мл [18O] H2O) через впускной коллектор (V6).
  3. Ловушка радиоактивности на анион обмен смолы (например четвертичных аммониевых анион обмен картриджа; V5 в V4), восстановить [18O] H2O в отдельном флаконе (V1).
  4. Элюировать [18F] F (обратный элюции, V5 для V4) в реактор (V8) с 750 мкл физиологический раствор 0,9% (w/v) (V2), а затем 1,5 мл Ацетонитрил (V16).
  5. Отвода воды испарением азеотропная под вакуумом и азота потока путем нагрева при 105 ° C, а затем 120 ° C за 5 мин.
  6. Снизить температуру реактора до 80 ° C.
  7. 800 мкл 15-Корона-5 в ацетонитриле безводный (46 мг, 0,21 ммоль) сухой [18F] F через Центральный порт реактора (V8).
  8. 850 мкл BF3. 2 тон в ацетонитриле безводный (0,16 мг, 1,13 мкмоль) в реактор.
  9. Реагировать на 5 мин, возвращаясь к комнатной температуре.
  10. Передайте реакционную смесь через картридж оксида алюминия (V17 V18) в ловушку trifluoroborate.
  11. Возвращение реакционной смеси в шприц S2 и разбавляют водой (около 1,6 мл).
  12. Передайте реакционную смесь через второй патрон обмен анион (V19 V20) в ловушку [18F] BF4 продукта.
  13. Вымойте реактора с водой (около 5,5 мл).
  14. Передайте полученный раствор через глинозема и второй картриджи обмену анионов.
  15. Промойте шприцы S2 и S3 с водой.
  16. Вымойте второй анион обмен картриджа с водой и высушить его с газом азота.
  17. Элюировать продукта (V19 V20) с 1 мл 0,9% NaCl (V14) в шприц S3.
  18. Передача продукта (400-500 мкл) через выход линии (V21) 1 мл флакон стекла коллекции.
    Примечание: Молярная деятельность является важным аспектом каждого радиоиндикаторных. Его регулярное определение не только много времени однако также требуется значительное количество свежей синтезированных [18F] BF4-, таким образом, что она становится ограничивающим фактором для количество животных, которые могут быть образы. Для проверки воспроизводимости и молярной деятельности результирующей [18F] BF4, рекомендуется запланировать несколько выделенных тестов для этой цели. Для более подробной информации о деятельности, Молярная пожалуйста, обратитесь к разделу обсуждения.

4. в естественных условиях изображений NIS-FP выражения клеток путем nanoPET/CT

  1. Подготовка животных
    1. Анестезировать мышей с 1,5-2,0% (v/v) изофлюрановая в2 O со скоростью потока 1,0-1,5 Л/мин в камеру всасывание. Чтобы проверить наличие достаточных искать анестезии в отсутствии педали рефлекс.
    2. Обеспечить, чтобы применять мазь ветеринар на глазах животных для предотвращения сухости под наркозом
    3. Переместить мышь на грелку с носа в маске цистит снабжения и теплый хвост (например , погружения в воды 37 ° C или с помощью инфракрасного света лампы).
    4. Разбавьте свежеприготовленные стерильной фильтрации [18F] BF4 решение 5 MBq за 50 мкл с 0.9% стерильного физиологического раствора.
    5. С помощью шприца подключен к подкожных иглы (29-31), привлечь 100 мкл раствора [18F] BF4 , измерения радиоактивности в шприц и отмечаем значение и время измерения.
    6. Внутривенно Администрирование 50 мкл раствора [18F] BF4 в Вену подогретым хвост.
    7. Измерить оставшиеся радиоактивности в шприц и запишите значение и время измерения. Разница между величинами, измеренными в шаги 4.1.7 и 4.1.5 является вводили дозу (ID).
    8. Установите таймер для отсчета от 45 мин (время PET изображений начала = 0 мин).
    9. Поместите курсор мыши на кровать nanoPET/КТ-сканера и убедитесь, что правильно повторно прилагаемый обезболивающий поставок.
    10. Проверка анестезии остается полная проверка на отсутствие педали рефлекс.
    11. Убедитесь в мышь на кровати в желаемый путь, например «Сфинкс»-как позиции.
    12. Установите животных устройства мониторинга в соответствии с рекомендациями изготовителя, например зондом ректальной температуры зонда измерения дыхания животных, или электроды для записи электрокардиограммы. Проверьте правильное функционирование всех инструментов.
      Примечание: В естественных условиях специфичности тестов с NIS радиоиндикаторных [18F] BF4, животные образы как описано выше и затем отдыхал спать до тех пор, пока радиоактивность достаточно распались следует рассматривать как незначительный, например 48 h позже, когда только 1.3·106% остаточного 18F радиоактивности будет присутствовать в животное. В последующей визуализации сессии конкурентоспособных субстрата ClO4 осуществляется в дозе 200 мг/кг 30 мин до радиоиндикаторных администрации, и изображений выполняется, как описано выше.
  2. Изображения по nanoPET/CT
    1. Установите желаемые КТ изображений параметры, например с помощью трубки напряжения nanoPET/CT 55 kVp, установите время экспозиции в 1200 ms с одно градусный угловой степпинг и 180-градусным прогнозов.
    2. Установите параметры для захвата изображений Питомцев. Использование статических проверки параметров PET с длительностью 30 минут, 1:5 совпадение режим и 400-600 keVp энергии окна.
    3. Во время обратного отсчета = получение изображения КТ начало 15 мин.
    4. Во время обратного отсчета = 0 мин начала PET изображений приобретения.
      1. Если последовательный животных изображений требуется, пусть животные полностью восстановиться от наркоза, т.е. восстановить сознание под наблюдением. Впоследствии перенесите их в группу технического обслуживания.
      2. Если это терминал, визуализации сессии, переходите к эвтаназии животных либо анестезии передозировки, усиливающаяся концентрация двуокиси углерода, или вывих шеи.

5. в естественных условиях анализ данных

  1. Восстановить с помощью Монте-Карло полное 3D итерационный алгоритм ПЭТ/КТ данных. Убедитесь, что исправления для затухания, Мертвое время и радиоизотопной распада считаются. Для деталей обратитесь к инструкциям производителя ПЭТ/КТ инструмента в использовании.
  2. Проверка КТ и ПЭТ изображения совместно правильно зарегистрирован и сохранить данные в формате обмена подходит как «Digital Imaging и коммуникации в медицине» (DICOM).
  3. Анализ изображений
    1. Загрузите восстановленные файлы DICOM в анализ подходящих изображений программное обеспечение, которое позволяет распознавание и разграничение областей интереса (ROI) и последующего PET сигнал количественной оценки в этих ROIs.
    2. Сегмент трансформирования, используя ручной или адаптивный порог для определения ROIs33,34 с помощью подходящего программного обеспечения пакета. Анатомическое изображение информацию от КТ сканирование помогает руководство ROI назначения, например поверхностных опухолей или легких томов.
    3. Использовать программное обеспечение для анализа в соответствии с инструкциями производителя и обеспечить данные калиброванные дозу вводят радиоактивности и исправления для ослабления и радиоактивного распада.
  4. Рисовать диаграммы показаны данные из этой количественной в естественных условиях . Экспресс данных либо процентах вводили дозу/объем (%ID/mL) или стандартный поглощение значение (SUV), которая представляет собой альтернативную меру учитывая радиоактивность в тело субъекта.
    1. Вычислить значения %ID/g, предполагая, плотность ткани быть как вода, т.е. ~ 1 г/л Примечательно, что это предположение может быть недопустимым для органов значительно различной плотности, такие как кости или легких.
    2. Вычислить различные внедорожники для оценки истинной Внедорожник (например. SUVmean, SUVmax); SUVmax является более надежным для небольших объектов и используется чаще, чем SUVmean35.

6. анализ ex vivo

Выполнение перечисленных ниже по течению анализы: (i) флуоресценции изображений органов, содержащие флуоресцентные раковые клетки (первичной опухоли и метастазов) во время животных рассечение, (ii) измерение распределения радиоиндикаторных ткани и (iii) гистологического или (iv) Оценка гранулярных раковая органов.

  1. Измерение распределения радиоиндикаторных γ-подсчет (ex vivo накопление) и ex vivo флуоресценции изображения раковых тканей.
    1. Измерения радиоактивности всего мертвых животных и запишите значение и время.
    2. Вскрыть животных и урожай следующих тканей: легких, сердца, крови (с использованием стеклянных капилляров 20 мм), печени, желудка, почек, селезенки, малые и большие кишечника, щитовидной железы и слюнных желез, кусок мышцы от ГЭН и костей заднего бедра, и соответствующие и приспособление лимфатические узлы и раковых тканей.
    3. Измерения радиоактивности оставшиеся каркаса сначала включая затем исключая хвост и запишите значения и время измерения.
      Примечание: Радиоактивность в хвост может считаться вытекающих из радиоиндикаторных, который был неправильно введен и таким образом не достичь циркуляции; Следовательно это количество радиоиндикаторных не способствует вводили дозу. Хвост радиоактивности служит также ретроспективный показатель качества инъекций.
    4. Взвесьте все ткани (использовать предварительно взвешенный трубы).
    5. Фотографировать раковая органов при дневном свете и под светом флуоресцирования.
      Примечание: Используйте камеру стенда сохранить постоянное расстояние между объективом и органа (или использовать выделенный коммерческий инструмент для этой цели).
    6. Внедрить органов/ткани, предназначенные для вниз по течению гистология в OCT или погрузить их в формалином для фиксации. Для других приложений, ниже по течению может отличаться пробоподготовки.
    7. Подготовьте радиоиндикаторных калибровки стандартов в повторяющихся, например 0 до 1000 КБК [18F] BF4.
      Примечание: Стандарты калибровки необходимы для (i) радиоактивности значения (в КБК) касаются отсчеты измерений в минуту и (ii) упрощение коррекции распада; 18 F можно заменить [18F] BF4.
    8. Граф радиоактивности всех собранных тканей, используя γ-счетчик вместе с радиоактивности калибровки стандартов от шага 6.1.7. Обратите внимание на время измерения. Если количество ставки являются слишком высокими (т.е. за пределами линейность калибровки стандартных или обозначенный слишком высокой детектор мертвым раза), пересчитать образцы двух радиоиндикаторных полураспада позже.
    9. Представление данных в качестве %ID/g или стандартный усвоение ценностей (Внедорожник) (Equ.2).
      Внедорожник = Equation 2 (Equ.2)
    10. Отменить все собранные тканей, которые не требуются для дальнейшего течению анализы согласно правилам местного управления отходами.
  2. Анализировать раковых тканей цитометрии или гистологию в соответствии с предпочтениями пользователя и стандарт протоколов (как описано в других разделах3,6,28).

Representative Results

Первый шаг требует генной инженерии раковых клеток интерес. Здесь, результаты лентивирусные трансдукции метастатического мышиных воспалительные 4T1 клеток рака молочной железы и клетки человека метастатического MDA-MB-231 с человека, проявленную частиц, перевозящих ДНК кодирования NIS GFP или NIS-RFP. Трансдукция эффективность варьируется от рака клеточных линий (рис. 2A, левый столбец). Однако все результирующей преобразованы раковых клеток, что линии были отобраны СУИМ в чистоте (рис. 2A, право). Конфокальный флуоресцентной микроскопии (рис. 2B) продемонстрировал правильный плазматической мембраны локализации NIS-FPs NIS-FP функция была количественно с помощью NIS-предоставлена радиоиндикаторных поглощения (Рисунок 2 c-2E) и продемонстрировал функции NIS и специфика. В частности статистически значимых различий между 4T1. NIS-GFP и 4T1. NIS-RFP выражая клеточных линий с аналогичными уровнями выражение ННГ были найдены (рис. 2 c).

После полной в пробирке клеток линии характеристика опухоль модели были созданы с созданным прослеживается рак клеточных линий. Например, 4T1. NIS-GFP опухоли модель, модель для воспалительного рака молочной железы, показано здесь (рис. 3). В опухоль подшипник животных продольной всего тела PET изображений затем проинформировал о прогрессии опухоли, включая распространение метастазов (рис. 3B). PET радиоиндикаторных [18F] BF4 было необходимо для изображений и свежезаваренным производится утром каждого Питомца изображений сессии. Синтез [18F] BF4была выполнена с помощью метода описаны ARS. Как правило ~1.6 GBq 18F был использован в качестве ввода и получил ~ 244 MBq [18F] BF4 40.5±3.9 мин (N = 17). Продукт был проанализирован радио тонким слоем хроматографии или ионной хроматографии и показал радиохимической чистоты 94.7±1.4%. Радиохимический доходность составила 19.4±4.0% (распад исправлениями).

На день 19 после прививки опухолевых первичная опухоль была четко определены с помощью ПЭТ, но нашел нет метастазов. Спустя десять дней (день 29), же опухоль подшипник мышей были заново образ и были выявлены отдаленные метастазы в различных местах в всех животных (метастазы в легких, метастазирования различных паховая или подмышечных лимфатических узлов). Пример на рисунке 3 показан метастазы обширные легких с несколькими четко идентифицировать и количественному конкреций в легких (рис. 3Б-3E). Кроме того животных представлены с региональным распространением опухоли в брюшной стены, а также метастазирования паховых и оба подмышечные лимфатические узлы. Значения ID % индивидуальных метастаз в легких (Рисунок 3E) различаются, но так же оккупированных объемы базовой метастатическим конкреций. Напротив объем нормированный %ID/mL значения (Рисунок 3E) были гораздо более равномерным. Это была понятна для различных метастазы на аналогичных этапах развития (т.е. между дней 19 и 29; Рисунок 3B). В противоположность этому нормализованных %ID/mL значение для первичной опухоли был ниже, чем те, для легких метастазы, который соответствует массы опухоли, которые имели больше времени для прогресса и переделывать, включая приток других типов клеток (стромальные клетки, клетки иммунной системы) , особенно в этой модели воспалительного рака молочной железы.

Руководствуясь в vivo изображения и флуоресценции раковых клеток (видимым во время животных диссекция под флюоресценция света), малые укоренившиеся органы, такие как лимфатические узлы были надежно собирают и в то же время, оценку для контента (злокачественный конкреций На рисунке 4A). Хотя флуоресценции сигнал во время животных рассечение свидетельствует о присутствии клеток опухоли, важно, чтобы убедиться, что эта классификация сопровождалось ex vivo измерения радиоактивности собранного тканей. Рисунок 4B показывает стандартные поглощения (Внедорожник) полученные значения для различных тканей в когорте трех животных, все из которых представлены с метастазами. Эндогенно NIS-выражая органов например, щитовидной железы и слюнных желез (собирают комбинированный) или желудка также показали ожидаемые высокие радиоиндикаторных поглощения. Кроме того этот подход NIS-FP позволил простой рак клеток идентификации во время гистологии (рис. 4 c). Этот пример иммунофлюоресценции гистология данных показал васкуляризации опухоли в 4T1. NIS-GFP опухоли модель. Эти данные также показал, что репортер NIS-GFP, преимущественно проживало в мембраны плазмы опухоли клетки также в vivo (рис. 4 c), тем самым проверки результаты поглощения.

Figure 1
Рисунок 1. Схема, подробно Настройка автоматизированных радиоиндикаторных синтез платформы для производства [18F] BF4 через метод добавление фтора-18-к бора трифторид. Реагент имена печатаются на соответствующие трубы в схеме. QMA это аббревиатура для обмена анион четвертичного аммония и указывает используемые твердофазный хроматографического разделения материала. Дополнительные сведения доступны в таблицах 1 и 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Типичная характеристика результаты линий клеток рака, стабильно выражая NIS GFP или NIS-ППП. (A) указано клеточных линий были сделаны с помощью lentiviruses, Передача NIS-GFP или NIS-ППП. В левом столбце отображается transduced населения (зеленый или красный флуоресцентные) по сравнению с соответствующей родительской клетки (серый; 4T1 и MDA-MB-231 клетки, соответственно). Проценты показывают эффективность трансдукции определяется проточной цитометрии. В правом столбце отображаются результаты потока гранулярных анализы после очистки СУИМ смешанного населения в левой колонке. Все линии клетки были признаны > 99% чистой для обозначается NIS-выражая клетки (проточной цитометрии). (B) конфокальный флуоресцентной микроскопии очищенный клеточных линий показывает плазматической мембраны локализации NIS-GFP или NIS-ППП в соответствующих клеточных линий. WGA-Alexa633 был использован как маркер плазматической мембраны. (C, D) Функциональные проверки NIS-FP белка, недавно выраженную в указанный созданный линий клеток рака. NIS функция была измерена с помощью радиоиндикаторных 99 mТШО4 (50 КБК на миллион клеток). Как элементы управления а также синтез репортер выражая клетки, которые лечили NIS совместно субстрата перхлорат до и во время анализа (Специфика управления) были использованы родительской клетки. Результаты ясно свидетельствуют функции NIS-FP и специфичность в всех клеточных линий. (E) функциональная проверка 4T1. NIS-FP клеточных линий с помощью [18F] BF4 как радиоиндикаторных для NIS. Все остальные условия были идентичны (C). Важно отметить, что очень похожи относительного поглощения, которые были получены результаты для обеих 4T1-производные клеточных линий с обеих radiotracers (рис. 2 c и E), тем самым оправдывая взаимозаменяемые использование как в vitro функциональных характеристик NIS-FP выражая клеточных линий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
На рисунке 3. Представитель результат метастазов, отслеживание [18F] BF4-ПЭТ/КТ в мыши, принимая 4T1. NIS-GFP опухоли. (A) один миллион 4T1. NIS-GFP клеток вводили в молочной жировых отложений 5-6 недель BALB/c CanN.Cg-Foxn1ню/Crl мышей и рост опухоли последовало со временем при помощи штангенциркуля. Благодаря флуоресценции GFP раковых клеток сырой визуальные идентификации/рост оценки был также возможно с помощью флуоресценции факел и подходящий фильтр очки (см. вставку). (B/слева) На день 19 пост опухоли прививка первичной опухоли (Желтая пунктирная линия) было четко но нет метастазов. Изображение представлено это проекция максимальной интенсивности (MIP) ПЭТ изображения. Эндогенные NIS сигналов (белый дескрипторы) также были записаны, т.е. щитовидной железы и слюнных желез (Th + SG), желудка (S) и на очень низком уровне, некоторые части молочной железы и слезных желез. Сигнал мочевого пузыря (B) проистекает из трассировочного экскрецию. (B/справа) На день 29 пост опухоли прививка, метастазирование был четко определены: Множественные метастазы в легких (Желтая пунктирная линия), а также метастатических лимфоузлов (ILN, AxLN, Желтые стрелки). Изображение представлено является MIP PET/CT изображения. Первичной опухоли (Желтая пунктирная линия) выросли не только в шарообразную форму в этот момент времени, но также вторглась в брюшной стенке. (C) 3D осуществление Оцу Бинаризация техники позволило 3D визуализации поверхности раковых тканей; они накладываются на PET ПМС. Метастазы в легких показаны в белый, метастатические подмышечные лимфатические узлы в красном, метастатические пахового лимфоузла в желтом и первичной опухоли, которые вторглись в перитонеальной стену в бирюзовый. (D) изображение раздутии PET/CT МИП в (B/вправо), чтобы указать отдельные легких метастазов. (E) радиоиндикаторных поглощения в раковой ткани был количественно от 3D-изображений (% ID) и нормализации их соответствующих томов (%ID/mL). Индивидуальные легких метастазов соответствуют нумерации в (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Типичные примеры ex vivo данных доступен из NIS-FP опухоли подшипник мышей. (A) в ткани заготовки для анализа, ниже по течению, флуоресцентные свойства NIS-FP выражая опухолевых клеток служил индикатора руководящие животного рассечение. Как экз, тканей от животных на рисунке 3, т.е. легких с несколькими метастатического поражения и два положительных лимфатических узлов отображаются. Дневного света фотографии а также флуоресценции изображения отображаются. Флуоресценции изображения были взяты с такой же камерой, как летнее изображения, но под голубой свет возбуждения (450±10 Нм полосовой фильтр) с фильтром зеленый выбросов (530±30 Нм полосовой фильтр) помещены перед объективом камеры. (B) распределение радиоиндикаторных в различных органах («накопление») животных с 4T1. NIS-GFP опухоли (N = 3; день 29 пост опухоли прививка; 5 MBq [18F] BF4). Стандартные значения (Внедорожник) были рассчитаны поглощения и значения > 1 указывают на специфическом накоплении радиоиндикаторных в соответствующих органах. Данные показывают конкретные радиоиндикаторных поглощения в раковых тканей, т.е. первичной опухоли, метастатических лимфоузлов (как это определено изображений и рассечение под флюоресценция света), легких (был расчлененный в целом без разделения отдельных метастазы), а также органов эндогенно выражая ШЕКЕЛЕЙ, т.е. щитовидной железы и слюнные железы и желудка. (C) иммунофлюоресценции гистологическое первичной опухоли от же мыши, как показано на рисунке 3. Первичной опухоли был собирают, встроенный в OCT и заморожены до того секционного (10 мкм) и обработаны для окрашивания. NIS-GFP, выражая раковые клетки были прямо определены без необходимости для пятнать антитела. Кровеносные сосуды окрашивали кролика антитела против мыши PECAM-1/CD31 (2 мкг/мл) и вторичное антитело проспряганное Cy5 коза анти кролика. Ядер окрашивали 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole (1 мкг/мл) и образец монтируется в поли (виниловый спирт - Винилацетат) содержащий 2,5% (w/v) Dabco как antifade. Конфокальный изображения были получены с помощью Конфокальный микроскоп с параметрами подходит для 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole, GFP и Cy5. Эти данные примера ясно показывают, что 4T1. Васкуляризированной NIS-GFP опухоли, но также что васкуляризации отличается своей степени (cf. верхней левой нижней середине). Он также показывает, что репортер NIS-GFP преимущественно проживает в плазменных мембран опухолевых клеток в vivo (вставка), тем самым проверки результаты поглощения в пробирке . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

FASTlab распределитель Реагент, растворителя, картридж или трубки * Детали
V1 Силиконовые трубки [18O] H2O отходов бутылка 14 см
V2 0,9% раствор NaCl, 750 мкл флакон 11 мм
V3 Шприц S1 1 мл
V4 анион обмен картриджа C1, предварительно кондиционером с 1 M NaCl (10 мл) и H2O (10 мл) например Сен-Пак Accell плюс QMA плюс свет (воды, Кот. LOL WAT023525)
V5 Силиконовая трубка картридж обмену анионов C1 14 см
V6 [18O] H2O /18F впускного коллектора Макс 5 мл
V7 Силиконовая трубка для реактора (слева; вход газа) 14 см
V8 Силиконовая трубка для реактора (Центральный порт; жидкость вход/выход) 14 см
V9 Закрыто
[1] Закрыто
V11 Шприц S2 5 мл
V12 15-Корона-5, 46 мг в 800 мкл MeCN флакон 11 мм
V13 Trifluoroborate диэтил etherate, 0,14 мкл в 850 мкл MeCN (разбавленного 14 мкл BF3. 2 тон с MeCN 1 мл. Развести 10 мкл этого решения до 850 мкл с MeCN). флакон 13 мм
V14 0,9% раствор NaCl, 1 мл флакон 13 мм
V15 Всплеск воды мешок
V16 Ацетонитрил (MeCN), 1,5 мл флакон 13 мм
V17 Силиконовая трубка глинозема нейтральных картридж C2 14 см
V18 Глинозем нейтральных картридж C2, предварительно кондиционером с H2O (10 мл), ацетон (10 мл) и воздуха (20 мл) например Сен-Пак глинозема N плюс свет (воды, Кот. LOL WAT023561)
V19 Силиконовая трубка анион обмен картридж C3 14 см
[2] анион обмен картриджа C3, предварительно кондиционером с 1 M NaCl (10 мл) и H2O (10 мл) например Сен-Пак Accell плюс QMA плюс свет (воды, Кот. LOL WAT023525)
V21 Силиконовая трубка для коллекции флакон 40 см
V22 Закрыто
V23 Закрыто
V24 Шприц S3 5 мл
V25 Силиконовая трубка для реактора (справа; вакуумный порт) 40 см
* Примечание: Из-за пластиковых шипы, мертвых объем для 11 мм ампул и флаконов 13 мм составляет приблизительно 0,35 мл и 0,4 мл, соответственно. Таким образом фактические суммы реагентов, переданы в реактор немного отличаются. Все количества, указанные в этот метод относятся к фактической суммы, введена в каждом флаконе реагента.

Таблица 1. Описание кассеты макета для автоматизированных [18F] BF4 синтеза через метод добавление фтора-18-к бора трифторид (см. рис. 1).

Шаги последовательности Комментарий
[1 - 2] Давление системы и очистить коллектор с N2
[3-15] Промыть шприц S3 дважды с H2O (V15), очистить коллектор с N2
[16-23] Давление реагент флаконов в позиции V16, V14, V13 и V12, промывка коллектор с N2 между каждого флакона
[24-26] Откройте подачу активности (V6)
Подключите флакон, содержащий 18F. Если общий объем > 5 мл, только Вставьте иглу на полпути в флакон перед продолжением.
[27-39] Закрыть деятельности входе (V6), ловушка 18F QMA картриджа C1 (V5), собирать [18O] H2O в бутылке отходов (V1). Если общий объем > 5 мл, приостанавливать последовательность на шаге 37, вернитесь в шаг 26, полностью вставить иглу в пробирку, содержащую 18F и возобновить процесс.
[40] Закрыть [18O] H2O отходов бутылка (V1), очистить коллектор с N2
[41] Давление элюента флакона в положении V2
[42-44] Открыть клапан реактор V8, аспирационная элюента от V2 в шприц S1
[45-50] Элюировать QMA картридж C1 в реактор (V8) с помощью солевых из шприца S1, установите температуру реактора до 90 ° C
[51] Очистите QMA патрон C1 с N2 и увеличить температуру реактора до 105 ° C
[52-53] Черпают V16 Ацетонитрил в шприц S2
[54-57] Передача Ацетонитрил из шприца S2 в реактор (V8)
[58-60] Тепло реактора на 120 ° C за 5 мин испарится растворителя с потоком N2 в реактор (V7).
[61-65] Установите температуру на 105 ° C, сухой шприц S1 с N2
[66-69] Нарисуйте 15-Корона-5 решение от V13 в шприц S2, увеличить температуру реактора до 120 ° C
[70-71] Снизить температуру до 105 ° C, очистить коллектор с N2
[72] Охладить реактор (устанавливать температуру 40 ° C) для 5 мин
[73-78] Установите температуру реактора до 80 ° C, передачи решения 15-Корона-5 от шприца S2 в реактор (V8)
[79-81] Нарисуйте BF3. Решение2 OEt от V14 в шприц S2
[82-87] Передача BF3. Решение2 OEt от шприца S2 в реактор (V8), потолочные линии реактора с N2
[88] Очистить коллектор с N2
[89] Реагировать на 5 мин, пусть температура вернуться к RT
[90-95] Передача смеси реакции (V8) шприц S2
[96-104] Передайте реакционную смесь через картридж глинозема N C2, в шприц S3
[105] Очистить коллектор с N2
[106-109] Возвращение реакционной смеси в шприц S2
[110-112] Пустой шприц S3, рисовать H2O (V15) в шприц S2 для разбавления реакционной смеси
[113-115] Загрузить реакционную смесь на QMA картридж C3
[116-118] Нарисуйте H2O (V15) в шприц S2
[119-124] Промыть реактора (V8) с H2O от шприца S2, аспирационная мойки в шприц S2
[125-128] Передайте мойки через Картриджи C2 и C3
[129-130] Сухие картриджи и коллектор с N2
[131-136] Вымойте шприц S1 с H2O (V15)
[137-142] Вымойте шприц S2 с H2O (V15)
[143] Очистить коллектор с N2
[144-147] Нарисуйте H2O (V15) в шприц S2
[148-151] Потопить QMA патрон C3 с H2O от шприца S2
[152-153] Сухие QMA патрон C3 с N2 и очистить коллектор с N2
[154-157] Элюировать QMA патрон C3 с 0,9% NaCl (V14) в шприц S3
[158-161] Передача продукта от шприца S3 в коллекции флакона (V21)
[162-163] Промывочный картридж QMA C3 с N2 к коллекции флакона (V21)
[164-166] Очистить коллектор с N2
[167-170] Скрытой Картриджи C2 и C3 (терять бутылку) и коллектор с N2
[171] Очистка коллекции трубок (V21) с N2

Таблица 2. Описание шагов в последовательности XML-файле.

Discussion

Первый шаг для визуализации рака клеток прослеживается в естественных условиях этим методом требует инженерных их выразить репортер фьюжн NIS-FP. Выбор флуоресцентный белок в Фьюжн репортер имеет решающее значение, как oligomerizing флуоресцентных белков может привести к искусственным репортер кластеризации, тем самым негативно сказывается на его функцию. Мы имели успех с проверенной мономерных флуоресцентных белков, таких как mEGFP (с monomerizing мутации A206K36,37), mTagRFP или mCherry. NIS может быть либо человека или мыши происхождения (hNIS или msNIS) в зависимости от цели эксперимента и модель рака. Трансдукция эффективности обычно варьируются между различными рак клеточных линий. Однако сгенерированный рак клеточных линий впоследствии очищаются от СУИМ в этот протокол, тем самым снижая потребность в оптимизации условий трансдукции. Трансдукция с высокой кратности инфекции не всегда является целесообразным как несколько конструкцию интеграции в геном может привести не только в более высоких конструкция выражения, но и в более нежелательных/нерегулируемые модификации генома. Таким образом важно позволить поликлональными transduced клетки растут стабильность экспрессии (контролируется проточной цитометрии) и избежать сортировки ярких клонов только по СУИМ. Она также оказывает функциональные проверки характеристик-репортер решающее значение до того, как эти клетки должны использоваться для экспериментов в естественных условиях . Недавно разработанные альтернативой вирусных генов доставки является ген редактирования технологии38, которая предлагает более конкретные контроль над вирусный интеграции сайтов. Анализ выражения проточной цитометрии и immunoblotting имеет важное значение. Проточной цитометрии позволяет приобретать на основе населения одной ячейки данных, например выяснить есть ли любой дрейф в уровнях выражения репортер с течением времени. Он опирается на общие FP только, если клетки также витражи с антитела, направленные против поверхности или всего NIS. Проточной цитометрии не информировать о целостности репортер фьюжн. В противоположность этому immunoblotting сообщает о целостности репортер фьюжн. Молекулярная масса ННГ и FP должен быть добавлен к недавно определить ожидаемые молекулярная масса выбранной NIS-FP. конфокальная флуоресценции микроскопии продемонстрировал фьюжн репортер colocalization с плазматической мембране маркер зародышей пшеницы агглютининов во всех сделал клеточных линий. Это был ожидаемый сотовой местоположение для большинства белка и указала идти вперед вехой для последующей функциональной проверки. Если минимальный/нет NIS-FP была найдена на плазматической мембраны (например только в сотовой внутренних отсеков), это будет указывать на ячейку биологических проблему с репортером фьюжн в этой линии клетки, или потенциальные мутация репортер слияние затрагивающих его внутриклеточные людьми. Примечательно, что мы не наблюдали такого дела в любой из раковых клеток, мы протестировали так далеко, которые включали: A375P, A375M2, СК-Mel28, WM983A/B (человека меланомы); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (рак молочной железы человека); NCI-H1975 (рак легких человека); SK-Hep1 (человека рак печени); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (мышиных воспалительного рака молочной железы); B16F0, B16F3, B16F10 (мышиных меланомы); MTLn3 (Крыса молочной железы аденокарцинома).

NIS функция должна быть измерена с помощью поглощения анализов с радиоактивными NIS субстратов. Из-за ОФЭКТ радиоиндикаторных 99 mТШО4 , генератор производства и поэтому широко доступны в больницах без необходимости для любого радиоиндикаторных синтеза, а также иметь более удобный длительный период полувыведения (6.01 h для 99 m TC по сравнению с 110 мин 18F), мы использовали этот субстрат NIS для обычной функциональной проверки новых ШЕКЕЛЕЙ-FP выражая клеточных линий. Предварительное блокирование NIS-выражая клеток с перхлората натрия NIS совместно субстрата привело ожидаемого сокращения/abolishment радиоиндикаторных поглощения, продемонстрировав тем самым специфики радиоиндикаторных поглощения. Этот тест специфика NIS является критической проверки шаг. Если эксперимент специфика NIS не приведет снижение радиоиндикаторных поглощение сопоставимых в соответствующие родительские клетки, либо произошла техническая ошибка во время эксперимента, или поглощение радиоиндикаторных не обусловлено NIS. Это также возможно, что перхлората натрия предварительно блокирование уменьшает поглощение радиоиндикаторных в родительских клеток линии; Это определит клеточных линий с эндогенного функциональных выражение NIS (например стимулировали щитовидной железы клетки6).

Решающим преимуществом этой визуализации протокола является, что информация собирается в 3D и с течением времени. Это позволяет сравнения изображений из же животное во времени, тем самым обеспечивая парных данных и таким образом преодолеть проблемы, вызванные между животных изменчивости. Это контрастирует с методы оценки связанной с метастазами самых не изображений, которые основаны на жертву различных животных в разных временных точках. В рисунке 3B является очевидным распространение как метастатических и нарост прогрессировала с течением времени в отдельных животных. Сигналы обнаружены ПЭТ/КТ принципиально вызваны NIS выражения. Это включает в себя все сигналы от экзогенно NIS-выражая раковые клетки, а также все органы эндогенно выражая NIS. Типичный эндогенного NIS сигналов находятся в щитовидной железы и слюнные железы, желудка и, на низком уровне в некоторых частях молочной и слезных желез. Помимо эндогенного выражение NIS NIS радиоиндикаторных [18F] BF4 также экскретируется через почки, таким образом объясняя радиоиндикаторных поглощения в моче заполнены пузыри. Почки поглощение больше не обнаруживаемая в изображений момент времени, рекомендуется в настоящем Протоколе (45 мин пост радиоиндикаторных инъекций6). Если сигналы от мочи заполнены пузыри должны привести к проблемам с сигнала к фон, мочевого пузыря может быть механически пустым под анестезией до изображений. Важно отметить, что эндогенного сигналов может варьироваться от животных штаммов. Примечательно также, что эндогенного NIS выражение в молочных желез может быть выше при кормящих условия10. В представленном случае и в случаях тех метастатического клеточных линий, успешно характеризуется прежде чем (см. перечень выше) мы не нашли эндогенного NIS выражение существенно мешать обнаружения метастазов. Примечательно, что [18F] BF4 остается более доступными для поглощения в раковой ткани по сравнению с йодидом, потому что йодида метаболизируется в6гормонов щитовидной железы. Это явление может также способствовать большее количество radioiodide в потоке крови по сравнению с [18F] BF4- 6. Для различных приложений (раковых клеток, отслеживания в других раковых заболеваний или не раковая клетка отслеживания приложений) это может отличаться, и поэтому рекомендуется оценить ли эндогенного NIS выражение может вызвать вопросы сигнала к фон через Предварительные эксперименты. Важным аспектом в доклинических изображений является Молярная деятельность радиоиндикаторных. Метод, описанный здесь использует ~1.5 GBq 18F в качестве отправной материала14 и было показано производить Молярная деятельности значительно выше метод сообщалось ранее замены12. [18F] BF4 производится на Молярная деятельности ≤1 ГБк/мкмоль12 может привести к снижение поглощения в NIS-выражая тканях. Это имеет особое значение при высокой вводят количество радиоактивности на килограмм, т.е. когда небольших животных, таких как мыши образы39; в человека, установка40менее важно. Поэтому Высокая молярная мероприятия необходимо для высокого качества доклинические PET изображений. Молярная деятельности получено бора фторид дополнение метод14, который показан на его автоматизированной форме в настоящем Протоколе, преодолеть эту проблему. Кроме того, стоит отметить, что представленный протокол [18F] BF4 синтеза не является совместимым с хорошей производственной практики (GMP) и поэтому непригодными для использования в человеческих клинических испытаний в этой форме. GMP протокол (через метод подстановки 18F для radiolabel BF4) доступен в другом месте40.

ПЭТ/КТ позволяет визуализировать радиоиндикаторных поглощения излучения, которое свидетельствует о NIS-опосредованной радиоиндикаторных поглощения, вытекающих из NIS-FP, выражая раковых клеток. Что еще более важно связанные PET сигналы могут быть количественно. Это необходимо применять надежные Бинаризация процедуры для обеспечения последовательной и объективной разграничения соответствующих сигналов от любых потенциальных фона. Как фон колеблется в различных местах в естественных условиях, важно учитывать местные и региональные ограничивание и сегментации. Один такой метод был разработан и назван Оцу34, и ее осуществление 3D используется для 3D-рендеринга первичной опухоли и метастазов в настоящем Протоколе. Как правило изображение, видимое наблюдателем визуально лучше всего соответствует значениям дозы (% ID) количественных % инъекции. Что касается количественной оценки на основе образов также важно нормализовать значения измерения радиоактивности различных тканей для их объемы. Выражением нормализованные результаты, (i) % ID тома (например , %ID/mL), и (ii) стандартная поглощение значение (35внедорожник) преимущественно используется двумя способами. Они отличаются тем, что %ID/mL принимает во внимание отдельные тома только, в то время как внедорожник является мерой, которая является относительно средний радиоактивности через весь животного. Важно также отметить, что NIS изображений делает живой опухоли тома (LTV) доступны, потому что мертвых/смерти клетки, которые не синтеза АТФ может больше не импортирует радиоиндикаторных10. Это объясняет большую площадь сигнала в рамках первичной опухоли (опухоли «образный пончик») указанием областей смерти/некроз клеток опухоли. Главное LTV был гораздо более надежной мерой бремя опухоли по сравнению с сырой опухоли объем доступной измерениями суппорта (которая не принимает во внимание жизнеспособности и оценивает только поверхностные опухоли регионов).

Основным преимуществом этой стратегии двойного режима отслеживания очевидна, когда заготовка тканей после выбраковки животных. Руководствуясь в vivo изображения и помогали флуоресцентные раковые клетки во время животных рассечение, малые и глубоко укоренившиеся органов/метастазов также могут быть надежно собраны. Замороженные ткани сохранение/секционирование методология позволяет прямой флуоресценции изображений GFP без необходимости для пятнать антитела анти GFP, но за счет сохранения сокращение структурных тканей по сравнению с формалином исправлено парафин врезанных методология (FFPE). Последний критически требует также анти FP окрашивание, потому что метод FFPE несовместима с нетронутыми сохранение флуоресцентных белков (из-за фиксации обезвоживания для регидратации). В то время как флуоресценции сигнал свидетельствует о присутствии клеток опухоли, важно, чтобы убедиться, что эта классификация подтверждается ex vivo измерения радиоактивности собранного тканей («накопление»). Ex vivo измерения радиоактивности более чувствительны, чем визуального обнаружения флуоресценции, поэтому может позволить выявление рака клеток зависит от сигналов, которые в противном случае останется незамеченным. В случае изображений сессии терминал очень важно точно отметить вводят радиоиндикаторных суммы, а также времена радиоиндикаторных измерения радиоактивности, животных инъекции, забой животных и калиброванные измерения сцинтилляционных счетчиков Собранный тканей. Это крайне важно для обеспечения коррекции для радиоиндикаторных распада и тем самым обеспечить надежный накопление анализа.

ПЭТ/КТ изображений позволяет повторять неинвазивные 3D количественную оценку опухолевой прогрессии, включая оценку метастатическим распространения на уровне всего тела. Эта функция является существенное преимущество перед традиционными методами, которые часто опираются на большой когорты животных, которые умерщвлено для оценки опухолевой прогрессии в различные моменты времени. Преимущества этого подхода на основе изображений являются: (i) высокочувствительный неинвазивные 3D в vivo количественной оценки, (ii) значительное снижение поголовья благодаря возможности повторить изображений, (iii) на приобретение продольных данных парных от последующих изображений сессий, совершенствования статистики путем исключения между животных изменчивость, которая в свою очередь еще больше снижает поголовья, (iv) автоматизированное производство [18F] BF4 на высоких конкретных мероприятий и (v) встроенный вариант для ex vivo подтверждения в тканях флуоресценции методологиями микроскопии или цитометрии.

В естественных условиях клетки отслеживания является развивающейся области. Он был вызван недавние выдвижения в технологии, что привело к расширенной резолюции, пределы обнаружения и мультиплексной возможности (через мультимодального imaging) визуализации. В этом протоколе мы применяем эту концепцию для отслеживания прогрессии опухоли, включая спонтанного рака клеток метастазов в 3D повторных изображений. Приложения включают исследования, направленные на распутывая механизмы спонтанного рака клеток метастазов. Например прослеживается опухолевые клетки могут использоваться для изучения влияния различных иммунных клеток компонентов (как подарок/функциональные животных штаммов различных уровней immunocompromisation) на метастатического процесса. Аналогично можно было бы изучить влияние отдельных генов, в животных штамм или линии клеток рака. Кроме того представленные протокол может использоваться для оценки и проверки эффективности конкретных наркотиков или терапевтические концепции прогрессии опухоли. Важно отметить, что эта пара генов: радиоиндикаторных репортер для PET изображений (ННГ: [18F] BF4) также могут быть использованы для различных клеток, отслеживания приложений. Например несколько клеточной терапии в настоящее время формируются как многообещающие терапевтические подходы. Это включает в себя клеточной терапии для лечения рака41 , но и в трансплантации42 и44 параметры регенеративной медицины43,. Всего тела в vivo ячейки отслеживания становится все более важным для развития и клинический перевод клеточной терапии, например, для оценки безопасности и мониторинга терапии.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Исследование было поддержано короля колледже Лондона и UCL всеобъемлющей Imaging центр рака, финансируемых исследований рака Великобритании и EPSRC совместно с MRC и DoH (Англия); Национальный институт медицинских исследований (NIHR) биомедицинских научно-исследовательский центр, основанный на парня и Сент-Томас NHS Фонд доверия и лондонском Королевском колледже; Центр передового опыта в медицинской техники, финансируемых Уэллком траст и EPSRC Грант номер WT 088641/Z/09/Z; Рак исследований Великобритании многодисциплинарного проекта награда GOF и PJB и король партнеров в области здравоохранения грант для GOF. NanoPET/и nanoSPECT/Карата сканеры были приобретены и поддерживается оборудования грант от Уэллком траст. Мнения, выраженные являются те из авторов и не обязательно ГСЗ, NIHR или DoH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole Thermo Scientific H3570 Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line ATCC CRl-2539 for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter Roche Diagnostics GmbH 5651697001 CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent Sedna Scientific 2501036
CASYton Isotonic Diluent Sedna Scientific 2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 Leica, Wetzlar, Germany Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness VWR International 631-0150
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
DMEM Sigma D5546 Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III  BD Biosciences Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine Sigma G7513 Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells ATCC HTB-26 for details see ATCC website
Mowiol 4-88 Sigma 81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G Addgene #12259 plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE Addgene #12251 packaging plasmid
pRSV-Rev Addgene #12253 packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Penicillin-Streptomycin Sigma P43330 Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate) Polysciences 17951 Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833 From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water 
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge Hettich Lab Technology
RPMI 1640 Sigma R0883 Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm Corning
Syringes 10 mL BD Emerald Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL  Life Technologies Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X  Sigma 59418C (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red 
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate  Life Technologies  W21404 Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper World Precision Instruments 501601
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5 Sigma-Aldrich 188832 CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous) Acros Organics 326811000
Boron trifluoride diethyl etherate Sigma-Aldrich 216607 BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes GE Healthcare FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets Macherey-Nagel 802021 RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light Waters WAT023525 Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light Waters WAT023561 Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP GE Healthcare
Nitrogen filter Millipore SE2M049I05 Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber Vet-Tech AN010R With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system Vet-Tech AN001B Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline Thermo Scientific Oxoid BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger Vet-Tech AN200 VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane  Sigma 59070-1L-D Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 85040C
Cover slips 22×50 mm VWR International SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT SLEE Medical two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson/Stratech 111-175-144 Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35  CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope Nikon Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound  VWR international 361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN Dako UK Ltd Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS) available from various suppliers. Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Brader, P., Serganova, I., Blasberg, R. G. Noninvasive molecular imaging using reporter genes. J Nucl Med. 54, (2), 167-172 (2013).
  3. Fruhwirth, G. O., Diocou, S., Blower, P. J., Ng, T., Mullen, G. E. A whole-body dual-modality radionuclide optical strategy for preclinical imaging of metastasis and heterogeneous treatment response in different microenvironments. J Nucl Med. 55, (4), 686-694 (2014).
  4. Terrovitis, J., et al. Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 52, (20), 1652-1660 (2008).
  5. Seo, J. H., et al. Trafficking Macrophage Migration Using Reporter Gene Imaging with Human Sodium Iodide Symporter in Animal Models of Inflammation. J Nucl Med. 51, (10), 1637-1643 (2010).
  6. Diocou, S., et al. [18F]tetrafluoroborate-PET/CT enables sensitive tumor and metastasis in vivo imaging in a sodium iodide symporter-expressing tumor model. Scientific Reports. 7, (1), 946 (2017).
  7. Lajtos, I., et al. Cold wall effect eliminating method to determine the contrast recovery coefficient for small animal PET scanners using the NEMA NU-4 image quality phantom. Phys Med Biol. 59, (11), 2727-2746 (2014).
  8. Nagy, K., et al. Performance evaluation of the small-animal nanoScan PET/MRI system. J Nucl Med. 54, (10), 1825-1832 (2013).
  9. Deleye, S., et al. Performance evaluation of small-animal multipinhole muSPECT scanners for mouse imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, (5), 744-758 (2013).
  10. Portulano, C., Paroder-Belenitsky, M., Carrasco, N. The Na+/I- symporter (NIS): mechanism and medical impact. Endocr Rev. 35, (1), 106-149 (2014).
  11. Dohan, O., et al. The sodium/iodide Symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocr Rev. 24, (1), 48-77 (2003).
  12. Jauregui-Osoro, M., et al. Synthesis and biological evaluation of [F-18]tetrafluoroborate: a PET imaging agent for thyroid disease and reporter gene imaging of the sodium/iodide symporter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (11), 2108-2116 (2010).
  13. Weeks, A. J., et al. Evaluation of [18F]-tetrafluoroborate as a potential PET imaging agent for the human sodium/iodide symporter in a new colon carcinoma cell line, HCT116, expressing hNIS. Nucl Med Commun. 32, (2), 98-105 (2011).
  14. Khoshnevisan, A., et al. [(18)F]tetrafluoroborate as a PET tracer for the sodium/iodide symporter: the importance of specific activity. EJNMMI Res. 6, (1), 34 (2016).
  15. Groot-Wassink, T., et al. Noninvasive imaging of the transcriptional activities of human telomerase promoter fragments in mice. Cancer Res. 64, (14), 4906-4911 (2004).
  16. Chen, L., et al. Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene. J Nucl Med. 47, (5), 854-862 (2006).
  17. Sieger, S., et al. Tumour-specific activation of the sodium/iodide symporter gene under control of the glucose transporter gene 1 promoter (GTI-1.3). Eur J Nucl Med Mol Imaging. 30, (5), 748-756 (2003).
  18. Chisholm, E. J., et al. Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles. Cancer Res. 69, (6), 2655-2662 (2009).
  19. Klutz, K., et al. Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene. Clin Cancer Res. 15, (19), 6079-6086 (2009).
  20. Merron, A., et al. Assessment of the Na/I symporter as a reporter gene to visualize oncolytic adenovirus propagation in peritoneal tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (7), 1377-1385 (2010).
  21. Merron, A., et al. SPECT/CT imaging of oncolytic adenovirus propagation in tumours in vivo using the Na/I symporter as a reporter gene. Gene Ther. 14, (24), 1731-1738 (2007).
  22. Dingli, D., et al. Combined I-124 positron emission tomography/computed tomography imaging of NIS gene expression in animal models of stably transfected and intravenously transfected tumor. Mol Imaging Biol. 8, (1), 16-23 (2006).
  23. Carlson, S. K., et al. Quantitative molecular imaging of viral therapy for pancreatic cancer using an engineered measles virus expressing the sodium-iodide symporter reporter gene. AJR Am J Roentgenol. 192, (1), 279-287 (2009).
  24. Barton, K. N., et al. GENIS: gene expression of sodium iodide symporter for noninvasive imaging of gene therapy vectors and quantification of gene expression in vivo. Mol Ther. 8, (3), 508-518 (2003).
  25. Siddiqui, F., et al. Design considerations for incorporating sodium iodide symporter reporter gene imaging into prostate cancer gene therapy trials. Hum Gene Ther. 18, (4), 312-322 (2007).
  26. Rad, A. M., et al. AC133+ progenitor cells as gene delivery vehicle and cellular probe in subcutaneous tumor models: a preliminary study. BMC Biotechnol. 9, 28 (2009).
  27. Hwang do, W., et al. Noninvasive in vivo monitoring of neuronal differentiation using reporter driven by a neuronal promoter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 35, (1), 135-145 (2008).
  28. Edmonds, S., et al. Exploiting the Metal-Chelating Properties of the Drug Cargo for In Vivo Positron Emission Tomography Imaging of Liposomal Nanomedicines. ACS Nano. 10, (11), 10294-10307 (2016).
  29. Zhang, R., et al. Probing the Heterogeneity of Protein Kinase Activation in Cells by Super-resolution Microscopy. ACS Nano. 11, (1), 249-257 (2017).
  30. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  31. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Curr Protoc Immunol. Chapter 20 Unit 20.22 (2001).
  32. Workman, P., et al. Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Br J Cancer. 102, (11), 1555-1577 (2010).
  33. Foster, B., Bagci, U., Mansoor, A., Xu, Z., Mollura, D. J. A review on segmentation of positron emission tomography images. Comput Biol Med. 50, 76-96 (2014).
  34. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, (1), 62-66 (1979).
  35. Kinahan, P. E., Fletcher, J. W. Positron emission tomography-computed tomography standardized uptake values in clinical practice and assessing response to therapy. Semin Ultrasound CT MR. 31, (6), 496-505 (2010).
  36. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, (5569), 913-916 (2002).
  37. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J Cell Biol. 163, (2), 257-269 (2003).
  38. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, (6), 1370-1379 (2013).
  39. Hume, S. P., Gunn, R. N., Jones, T. Pharmacological constraints associated with positron emission tomographic scanning of small laboratory animals. Eur J Nucl Med. 25, (2), 173-176 (1998).
  40. O'Doherty, J., et al. 18F-Tetrafluoroborate, a PET Probe for Imaging Sodium/Iodide Symporter Expression: Whole-Body Biodistribution, Safety, and Radiation Dosimetry in Thyroid Cancer Patients. J Nucl Med. 58, (10), 1666-1671 (2017).
  41. Couzin-Frankel, J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 342, (6165), 1432-1433 (2013).
  42. Boardman, D. A., et al. Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for Donor HLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in Preventing Human Skin Transplant Rejection. American Journal of Transplantation. (2017).
  43. Rashid, T., Takebe, T., Nakauchi, H. Novel strategies for liver therapy using stem cells. Gut. 64, (1), 1-4 (2015).
  44. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154, (4), 827-842 (2013).
Радионуклида флуоресценции Репортер ген Imaging для отслеживания опухолевой прогрессии в моделях грызунов опухоли
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).More

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter