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Cancer Research

Gen reportero de radionúclido-fluorescencia de imagen para seguir la progresión del Tumor en modelos de roedores Tumor

doi: 10.3791/57088 Published: March 13, 2018

Summary

Se describe un protocolo para la preclínica en vivo rastreo de metástasis del cáncer. Se basa en un reportero con radionúclidos-fluorescencia combina el sodio yoduro symporter, detectado por tetrafluoroborato de no invasivo [18F]-PET y una proteína fluorescente para la confirmación de racionalización ex vivo . El método es aplicable para la preclínica en vivo de la célula de seguimiento más allá de la biología del tumor.

Abstract

La metástasis es responsable de la mayoría de las muertes de cáncer. A pesar de la extensa investigación, la comprensión mecanicista de los procesos complejos que rigen la metástasis sigue siendo incompleta. Modelos in vivo son primordiales para la investigación de metástasis, pero requieren de refinamiento. Metástasis espontánea de seguimiento no invasivo en vivo la proyección de imagen ahora es posible, pero sigue siendo difícil ya que requiere de observación de largo plazo y alta sensibilidad. Describimos un longitudinal combinada con radionúclidos y la fluorescencia todo el cuerpo en vivo imagen enfoque para el seguimiento de la progresión del tumor y la metástasis espontánea. Esta metodología de gen reportero emplea sodio yoduro symporter (NIS) unida a una proteína fluorescente (FP). Las células cancerosas se dirigen a la estable expresa NIS-PF seguido por selección basada en la clasificación de células activado por fluorescencia. Modelos tumorales correspondientes se establecen en los ratones. NIS-FP expresando las células cancerosas son orugas no invasiva en vivo a nivel de todo el cuerpo por tomografía por emisión de positrones (PET) utilizando el NIS radiosonda [18F] BF4. PET es actualmente el más sensible en vivo tecnología disponible a esta escala de la imagen y permite la cuantificación confiable y absoluta. Los métodos actuales dependen de grandes cohortes de animales que son sacrificados para la evaluación de metástasis en diferentes puntos del tiempo, o se basan en la proyección de imagen 2D apenas cuantificable. Las ventajas del método descrito son: (i) altamente sensible no invasiva en vivo 3D animal doméstico proyección de imagen y cuantificación, (ii) automatizado de producción de trazador PET, (iii) una reducción significativa en el número de animales requerido por opciones de repetición, (iv). la adquisición de datos pareados de posteriores sesiones imagen proporcionando mejor información estadística y (v) la opción intrínseca para la confirmación de ex vivo de células cancerosas en los tejidos por microscopía de fluorescencia o citometría. En este protocolo, describimos todos los pasos necesarios para la rutina que ofrece la FP de NIS no invasivo en la vivo cáncer celular seguimiento usando PET/CT y ex vivo la confirmación de los resultados en vivo . Este protocolo tiene aplicaciones más allá de la investigación contra el cáncer sea en vivo , expansión y localización monitoreo de largo plazo de una población de células de interés.

Introduction

Enfermedad metastásica es la causa de la mayoría de las muertes relacionadas con cáncer 1. A pesar de extensas investigaciones en procesos metastásicos, monitoreo confiable de metástasis del cáncer en sistemas modelo animales es difícil de lograr. Avances recientes en tecnologías de proyección de imagen de cuerpo entero y enfoques multimodales de imagen han permitido no invasivo en la vivo de la célula seguimiento2,3,4,5. Este último puede utilizarse como una herramienta para monitorear la presencia, distribución, cantidad y viabilidad de las células, de forma no invasiva y en varias ocasiones en un animal vivo o un ser humano.

El propósito del método descrito aquí es longitudinalmente y no invasiva las células cancerosas en 3D en modelos de roedores tumor vivo de pista. Usando este método, los investigadores podrán cuantificar con precisión la progresión del tumor incluyendo diseminación metastásica en 3D. En comparación con las técnicas tradicionales no están basadas en la proyección de imagen, este método ofrece la adquisición de datos cuantitativos con el número de animales en gran parte reducida. Otra característica de este método es que permite la correlación de las imágenes en vivo con Análisis aerodinámico abajo ex vivo de las orugas células en tejidos cosechados por histología o citometría de3,6.

El fundamento para el desarrollo de este método era proporcionar una herramienta en vivo para el seguimiento y cuantificación del proceso entero metastásico en modelos de roedores tumor. Lo importante, fue diseñada para minimizar el uso de animales mientras que al mismo tiempo reducir la variabilidad entre animales. Longitudinal proyección de imagen no invasiva de cuerpo entero es ideal para informar en consecuencia metastásico, para que por sí es difícil de predecir con precisión el tiempo y el lugar de su ocurrencia. Proyección de imagen 3D de todo el cuerpo ha sido en el centro de desarrollo de métodos. Para cerrar la brecha de escala entre todo el cuerpo en vivo la proyección de imagen y potencial aguas abajo ex vivo confirmación histológica, una multi-escala enfoque de proyección de imagen basada en un reportero de modo dual con radionúclidos-fluorescencia fue adoptado3, 6.

Tomografía por emisión de positrones (PET) es el más sensible todo el cuerpo imagen tecnología 3D disponible en la actualidad ofrece excelente profundidad penetración y cuantificación absoluta7 con una resolución de < 1 mm8,9. Actualmente, celulares preclínica gammagrafía de seguimiento en el nivel de todo el cuerpo pueden detectar de manera fiable las células en las densidades de ~ 1.000 células por volumen de 1 millón de células3,6 con resoluciones en la región submilimétrica. A diferencia de la microscopía intravital, que no puede detectar las células de cáncer que se separa solo, pero no requiere de procedimientos quirúrgicos (por ejemplo cámaras de ventana), no se limita a un pequeño campo de visión y no por dispersión y penetración del tejido bajo. Imágenes de bioluminiscencia proporciona una alternativa económica, pero se asocia a dispersión y problemas de absorción de la luz así como penetración de profundidad pobre y por lo tanto muy limitada en cuantificación2. La proyección de imagen de cuerpo entero de la fluorescencia se ha utilizado para la adquisición de imágenes en 3D, pero es mucho menos sensible en comparación con bioluminiscencia o en radionúclidos tecnologías2. Sin embargo, fluorescencia ofrece la oportunidad de realizar análisis ex vivo de aguas abajo del tejido por citometría o microscopia. El último cierra la brecha de escala entre imágenes de todo el cuerpo macroscópico (mm de resolución) y fluorescencia microscópico del tejido fino análisis (μm de resolución)3. Por lo tanto, las modalidades de radionúclidos y de la fluorescencia complementan, que van desde el nivel de todo el cuerpo a escala celular (sub-).

La proyección de imagen de gen reportero se adapta idealmente para celular prolongado de seguimiento según sea necesario en la investigación de metástasis. En esta aplicación es superior a la célula directa de etiquetado (i) no afectado por la dilución de la etiqueta y por lo tanto no limitado en el tiempo de seguimiento y (ii) mejor refleja un número de células vivas. En consecuencia, la célula de cuerpo entero de seguimiento es particularmente útil para aplicaciones en las que células trazables proliferan o amplían en vivo, por ejemplo en cáncer investigación3,6, para la detección de formación de teratoma en tallo investigación de la célula o para la cuantificación de inmune celular expansión5.

Varios genes del reportero basado en radionucleidos están disponibles2. Éstos incluyen las enzimas tales como el herpes simple virus HSV11 timidina quinasa (HSV1 -tk), transportadores como el sodio yoduro symporter (NIS) o el transportador de norepinefrina (NET), así como receptores de superficie celular como la dopamina (D2) del receptor D2R). NIS es una proteína de glicosilada trans membrana que activamente interviene en la absorción de yodo, por ejemplo en las células foliculares en la glándula tiroides para la posterior síntesis de las hormonas de tiroides10. Este proceso es conducido por el symport de Na+ y se basa en el gradiente de sodio celular, que es mantenido por la Na+/+k-ATPasa11. En consecuencia, NIS refleja mejor la vida celular números de otros reporteros como captación de yoduro/radiosonda está ligado a un activo Na+/+ k gradiente más que la mera presencia del transportador. Tradicionalmente, radioiodide se ha utilizado para la proyección de imagen de NIS. Para el rastreo de celulares, radiotrazadores alternativos de NIS que metabólicamente no son atrapadas en la tiroides se han divulgado para ser superior6. Esto recientemente desarrollado PET radiosonda [18F] tetrafluoroborato ([18F] BF4)12,13 muestra farmacocinética superior en comparación con radioiodide6 estando disponible en actividades específicas de alto14 sin necesidad de instalaciones complejas radiochemistry. [18F] BF4 puede sintetizarse a través de dos formas diferentes. El primer método se basa en el intercambio del isótopo no radiactivo 19F en BF4 con radiactivo 18F12. El segundo método es a través de la adición de 18F para no radiactivo boro trifluoruro14. El último método fue divulgado para rendimiento superior actividades específicas14 y es el método de elección para la proyección de imagen preclínica.

NIS es altamente expresada en los tejidos de la tiroides. También se expresa en las glándulas mamarias salivales, lagrimal y lactantes así como el estómago, pero en niveles más bajos en comparación con la glándula tiroides10. Por lo tanto, la proyección de imagen excelente contraste en otras regiones del cuerpo se logra mediante NIS. También es altamente homóloga entre humanos, rata y ratón10. Por otra parte, no hay ningún reporte de toxicidad sobre la expresión ectópica de NIS en células no-thyroidal. Lo importante, NIS también no se ha asociado con inmunorespuestas del anfitrión, ni en humanos ni en roedores. NIS ha sido utilizado como un gen reportero para medir promotor actividad15,16,17 y gene expresión18,19,20,21,22 ,23 en varios contextos diferentes. También se ha utilizado para la proyección de imagen no invasiva de gene terapia vectores24,25y un seguimiento de las células cardiacas4, hematopoyéticos26, inflamación5y estudios neuronales27. Recientemente, NIS también se ha utilizado como un gen reportero seguimiento cáncer metástasis en vivo3,6.

En Resumen, las principales ventajas de este método sobre las técnicas anteriores son: (i) altamente sensible no invasiva 3D en vivo de la localización y cuantificación de metastásico de propagación, (ii) producción de [18F] BF4 automatizada en alta actividades molares, (iii) una reducción significativa en los animales necesarios a través de la imagen longitudinal, (iv) la adquisición de datos pareados de sesiones posteriores imágenes resultando en datos estadísticos, que a su vez más reduce el uso de animales y (v) la opción intrínseca para confirmación de ex vivo de células cancerosas en los tejidos por citometría o fluorescencia microscopía.

Protocol

Este protocolo cumple todos los requisitos establecidos por la legislación del Reino Unido (Reino Unido) y el panel de revisión ética local. Al seguir este protocolo, garantizar que los procedimientos también cumplen todos los requisitos dictados por la legislación nacional y local panel de revisión ética. Asegúrese de que todos los experimentos con radiactividad es compatible con la legislación y normas locales y realizada con seguridad.

1. Ingeniería y caracterización de células de cáncer para expresar el reportero de la fusión de radionúclido-fluorescencia NIS-FP

Nota: Para simplificar, mEGFP A206K es abreviado como "GFP", mCherry como "RFP" en las secciones posteriores de este protocolo.

  1. Generación de partículas lentivirales
    1. Para producir partículas de lentivirus, co transfectar las células 293T con la cuatro plásmidos siguiente utilizando un método de transfección adecuada: (i) el plásmido de la codificación del gene del reportero (pLNT SFFV NIS-GFP o pLNT SFFV NIS-RFP (ver información complementaria), (ii) el tercera generación lentivirales empaquetado plásmidos pRRE y (iii) pRSV-Rev y plásmido (iv) un virus envolvente que contiene, por ejemplo, pMD2.G. Plásmidos de la mezcla preparada de antemano antes de añadirlos a la mezcla de transfección. Realizar la transfección en una campana de cultivo celular.
      Nota: Se proporciona información adicional de la transfección en información complementaria.
    2. Evaluar el éxito de transfección después de 48 h por microscopia de fluorescencia de campo amplio estándar con ajustes de filtro apropiados para el reportero de fusión solicitadas (GFP NIS o NIS-RFP).
      Nota: Las señales de fluorescencia son indicativos de la transfección del gen de reportero y por lo tanto solamente un sustituto para la exitosa transfección Co, no un indicador de la producción de virus exitoso.
    3. Coseche el sobrenadante que contiene partículas de virus utilizando una jeringa y saque flotantes células y restos celulares por filtración a través de un filtro de 0.45 μm estéril polyethersulfone (PES). Transferir a un tubo de ensayo de polipropileno de 1.5 mL estéril. Trabajos de virus en una campana de cultivo celular y asegurar que ningún virus vivo deja el ecosistema.
  2. Transducción de señales y la selección de líneas de células de cáncer expresan NIS-FP
    1. Utilizar puro virus fresco del paso 1.1.3 mezclado 1:1 (v/v) con el medio de crecimiento óptimo de cada línea celular de cáncer (DMEM para las células MDA-MB-231 y RPMI 1640 4T1 células; ver la tabla de materiales para la composición de los medios de comunicación). Realizar la transducción de señales en una campana de cultivo celular.
      Nota: Un protocolo más general se denomina en información complementaria.
    2. Transducir las células del cáncer con virus medio en una incubadora con atmósfera humidificada con 5% (v/v) CO2 a 37 ° C por 72 h (trabajo en escala bien 6 o 12 pocillos con 1 mL o 0.4 mL de la mezcla de virus de paso 1.2.1).
    3. Controlar la expresión de NIS-FP de célula blanco por microscopía de fluorescencia.
    4. Expandir células transduced con éxito a una escala de 3 millones células mediante condiciones de cultivo estándar (véase ATCC para MDA-MB-231 y 4T1 líneas celulares).
    5. Utilizar celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación para purificar células expresa NIS-FP de células no-transduced.
      Nota: FACS puede ser una fuente de infecciones por mycoplasma; se recomienda para detectar mycoplasma antes de la producción del virus y transducción de señales sino también después de FACS y antes paso 1.3.
  3. Líneas celulares de cáncer de expresando su caracterización NIS-FP
    1. Confirmar la expresión de reportero por citometría de flujo estándar como se describe en otra parte28.
    2. Confirmar la integridad de reportero por immunoblotting estándar como se describe en otra parte29.
    3. Análisis de localización de reportero de fusión intracelular por microscopía de fluorescencia confocal.
      Nota: Tinción con o la coexpresión de un marcador de membrana plasmática6 y co-localización subsecuente análisis30 facilitará este paso.
    4. Análisis de captación del radiotrazador en las líneas celulares expresan NIS-FP.
      Nota: Cualquier substrato radioactivo de NIS compatible con equipo existente es conveniente, por ejemplo, los isótopos de yodo (123I-, 124I-, 125I-, 131I), 99 m TcO4-, 188ReO4-, [18F] así3F o [18F] BF4.
      1. Purificada de semillas 106 células en placas de 6 pozos en su medio de crecimiento óptimo (véase tabla de materiales) antes de un día para el experimento. Preparar todas las muestras por triplicado e incluyen muestras de control: (i) "controles de especificidad", es decir, FP-NIS expresando células previamente incubados con un substrato competitivo de NIS para probar la especificidad de absorción; (ii) "célula parental control", es decir, las células no expresan NIS-FP pero recibiendo radiotrazador para comprobar captación basal de las células parentales.
      2. En la mañana siguiente, lavar las células una vez con medio de cultivo libre de suero.
      3. Incubar las células en el medio de crecimiento libre de suero en presencia de 50 kBq 99 mTcO4 o [18F] BF4 durante 30 min a 37 ° C (1 mL de volumen total). Para los controles de especificidad, Pre-incubar las células por 30 min con el substrato competitivo NaClO4 (concentración final de 12,5 μm). Mantener la concentración de substrato competitivo constante durante todo el experimento.
      4. Recoger el sobrenadante y transferir 100 μl a un tubo de recogida preparado con la etiqueta "flotante".
      5. Lavan las células dos veces con 1 mL helado con tampón fosfato salino (PBS) con Ca2 +/Mg2 +. Recolectar cada solución de lavado y transferir 100 μl de cada uno en un tubo de colección preparada con la etiqueta "wash1" o "wash2", respectivamente.
      6. Levantar las células añadiendo 500 μl PBS con tripsina 0.25% (p/v) y 0,53 mM de EDTA e incubando a 37 ° C hasta que se desprenda de las células (Verifica visualmente con un microscopio). Transferir la suspensión a un tubo de recogida preparado con la etiqueta "células". Lavar los pocillos con 500 μl helada PBS que contenga Ca2 +/Mg2 + y añadir al tubo de "células". Sedimenten las células por centrifugación (250 x g, 4 min, 4 ° C).
      7. Cuenta los cuatro tipos de muestra de cada pocillo con una gamma contrarrestar adecuadamente fijado para el radioisótopo de elección (aquí: 99 mTc o 18F).
        Nota: Debido al gran número de muestras en este ensayo, se recomienda utilizar un contador de γ automatizado capaz de corrección automática de decaimiento.
      8. Analizar los datos mediante la suma de cuentas gamma obtenidos de muestras de cada pozo para determinar una cuenta total de la radiactividad por pozo.
        Nota: tome tomar pasos 1.3.4.4 y 1.3.4.5 en cuenta por números multiplicando por 10 para "flotante" y "lavar" fracciones.
      9. Expresar la absorción celular del radiotrazador en % absorción como se indica en Equ.1. Calcular promedios y desviaciones estándar de los experimentos por triplicado.
        Equation 1(Equ.1)
        Nota: Aquí, se describen experimentos de validación del reportero, pero funciones celulares no relacionadas con la reportera (e.g. proliferación, invasión de células de cáncer, genes, etc.) son en última instancia específica de la aplicación y la responsabilidad de cada usuario.

2. establecimiento de modelos de tumores en vivo

  1. Use solamente completamente caracterizado y validado las células para los experimentos en vivo . Comprobar la fluorescencia de las células antes de la administración por cualquier técnica adecuada (por ejemplo, microscopía de fluorescencia, citometría de flujo) en cada ocasión.
  2. Establecer el modelo de tumor en ratones femeninos del adulto joven de 5-6 semanas de edad. Utilice BALB/cAnNCrl o ratones de BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu (BALB/c Nude) para el modelo de tumor 4T1 y NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ ratones (NSG) para el modelo de tumor MDA-MB-231-basado. Afeitar animales localmente y usar técnica aséptica. Directamente inyectar 50 μl de una suspensión que contiene 106 FP-NIS expresando su cáncer células/mL en la almohadilla de grasa mamaria entre el cuarto y el quinto del pezón31.
    Nota: Para mejorar la precisión de la inyección, se recomienda realizar la inyección bajo anestesia general usando un anestésico inhalable como isoflurano (1-2% (v/v) de O2).
    Nota: Implantación quirúrgica de piezas tumor de tumores expresando NIS-FP es un enfoque alternativo al modelo de tumor establecimiento31.
  3. Comprobar la fluorescencia de células en sitios de inyección después de la administración y en los primeros días después de la inyección. Utilice una fluorescencia antorcha filtro vidrios y conveniente para el FP de elección.
  4. Monitorear el crecimiento del tumor y busque signos clínicos (sobre todo en momentos más adelante).
    Nota: Para los tumores superficiales, es decir, el trasplante orthotopic del pecho tumores en este protocolo, uso de pinzas y la fórmula para el diámetro tumoral promedio (MTD) = ½· (L + W) 32.

3. producción de [18 F] BF 4 usando una plataforma de síntesis (ARS) de radiosonda automatizado.

Nota: Aquí se describe la síntesis de4 BF automatizado [18F] basada en el método de trifluoruro de boro, además 18F. Los usuarios de una plataforma más ampliamente disponible de ARS (véase tabla de materiales), puede descargar el archivo de lenguaje de marcado Extensible (XML) correspondientes necesario para ejecutar la secuencia automatizada en esta plataforma (fichero complementario). Se proporciona una explicación detallada de la distribución de cassettes que se muestra en la figura 1 (tabla 1) así como una descripción detallada de cada paso en el archivo de secuencia XML (tabla 2) para apoyar la traducción a cualquier otra plataforma automatizada.

  1. Establecer la plataforma de ARS, como se describe en la tabla 1 y asegurarse de que funciona con el archivo XML correcto cargado en la computadora de control. Asegúrese de que la plataforma de ARS se coloca en una campana química conveniente para la seguridad en el trabajo con cantidades de GBq de radiactividad.
  2. Aspirar el producido en ciclotrón [18F] F (normalmente de 1.5-2 GBq en 2-7 mL [18O] H2O) mediante el depósito de entrada (V6).
  3. Trampa de la radiactividad en una resina de intercambio aniónico (por ejemplo amonio cuaternario anión cambio de cartucho; V5 a V4), recupera la [18O] H2O en un frasco separado (V1).
  4. Responsables [18F] F (elución inverso, V5 a V4) en el reactor (V8) con 750 μl de solución salina al 0.9% (w/v) (V2), seguido de 1.5 mL de acetonitrilo (V16).
  5. Eliminar el agua por evaporación azeotrópica bajo flujo de nitrógeno y vacío por calentamiento a 105 ° C y 120 ° C durante 5 minutos.
  6. Reducir la temperatura del reactor a 80 ° C.
  7. Añadir 800 μl de 15-corona-5 en acetonitrilo anhidro (46 mg, 0.21 mmol) a seco [18F] F a través del puerto central del reactor (V8).
  8. Agregar 850 μl de BF3. 2 de la OEt en acetonitrilo anhidro (0,16 mg, 1.13 μmol) al reactor.
  9. Reaccionar durante 5 minutos al volver a temperatura ambiente.
  10. Pasar la mezcla de reacción a través de un cartucho de óxido de aluminio (V17 a V18) para atrapar el trifluoroborate.
  11. Volver la mezcla de reacción a jeringa S2 y diluir con agua (aprox. 1,6 mL).
  12. Pasar la mezcla de reacción a través de un segundo cartucho de intercambio aniónico (V19 a la V20) para retener el producto de4 BF [18F].
  13. Lave el reactor con agua (aprox. 5,5 mL).
  14. Pasar la solución resultante a través de la alúmina y segundo cartuchos de intercambio de aniones.
  15. Enjuague las jeringas S2 y S3 con agua.
  16. Lavar el segundo cartucho de intercambio aniónico con agua y secar con gas nitrógeno.
  17. Eluir el producto (V19 a la V20) con 1 mL 0.9% NaCl (V14) en jeringa de S3.
  18. Transferir el producto de (400-500 μl) a través de la línea de salida (V21) a un frasco de colección de vidrio de 1 mL.
    Nota: Actividad Molar es un aspecto importante de cada radiosonda. Sin embargo, su determinación rutinaria no sólo desperdiciador de tiempo sino también requiere cantidades significativas de la recién sintetizada [18F] BF4-, que se convierte en un factor limitante para el número de animales que puede ser reflejada. Para comprobar la reproducibilidad y actividades molares de la resultante [18F] BF4, se recomienda programar algunos funcionamientos de prueba dedicados para este propósito. Para obtener más información acerca de las actividades molares, por favor consulte la sección de discusión.

4. las células in vivo la proyección de imagen de FP-NIS expresar por nanoPET/CT

  1. Preparación de animales
    1. Anestesiar ratones con isoflurane 1.5-2.0% (v/v) de O2 con un caudal de 1.0-1.5 L/min en una cámara de inducción. Busque la mirada de anestesia suficiente para la ausencia del reflejo pedal.
    2. Asegúrese de aplicar el ungüento veterinario en ojos de animales para evitar la sequedad bajo anestesia
    3. Mueva el ratón sobre una almohada con la nariz en una máscara de suministro de anestésicos y caliente la cola (por ejemplo, por inmersión en agua de 37 ° C o usando una lámpara de luz infrarroja).
    4. Diluir la solución recién preparada estéril filtrada [18F] BF4 de 5 MBq por 50 μL con solución salina estéril 0,9%.
    5. Utilizando una jeringa conectada a una aguja hipodérmica (calibre 29-31), dibujar 100 μl de la solución de4 [18F] BF, medir la radiactividad en la jeringa y tenga en cuenta el valor y el tiempo de la medición.
    6. Administrar por vía intravenosa 50 μl de la solución de [18F] BF4 en la vena de la cola previamente calentada.
    7. Medir la radioactividad restante en la jeringa y observar el valor y el tiempo de la medición. La diferencia entre los valores medidos en pasos 4.1.7 y 4.1.5 es la dosis inyectada (ID).
    8. Ajustar un temporizador de cuenta regresiva de 45 minutos (hora de la proyección de imagen del animal doméstico de inicio = 0 min).
    9. Coloque el ratón en la cama nanoPET tomógrafo y esté correctamente vuelva a conectar el suministro de anestesia.
    10. Compruebe la anestesia queda completa por la prueba de la ausencia del reflejo pedal.
    11. Asegurar el ratón se coloca sobre la cama de la manera deseada, por ejemplo, la 'Esfinge'-como posición.
    12. Instalar aparatos de vigilancia animal según las recomendaciones del fabricante, por ejemplo, una sonda rectal de la temperatura, una sonda de medición de respiración animal, o electrodos para el registro de electrocardiogramas. Compruebe el funcionamiento de todos los instrumentos.
      Nota: Para las pruebas de especificidad en vivo con el NIS radiosonda [18F] BF4, animales reflejados como se describió anteriormente y luego reposó despiertos hasta que la radioactividad ha decaído lo suficiente para ser considerado como insignificante, p. ej. 6% residual 18F radiactividad de 48 h más tarde, cuando sólo 1.3·10estará presente en el animal. En la posterior sesión de imágenes, el sustrato competitivo ClO4 se administra en una dosis de 200 mg/kg de 30 min antes de la administración del radiotrazador y la proyección de imagen se realiza como se describe anteriormente.
  2. La proyección de imagen por nanoPET/CT
    1. Configurar el CT imagen parámetros deseados, por ejemplo, usar el voltaje de tubo de 55 kVp nanoPET/CT, el tiempo de exposición a 1200 ms con un grado angular de escalonamiento y proyecciones de 180 grados.
    2. Definir los parámetros para la adquisición de la imagen de PET. Uso estático analizar parámetros de PET con una duración de 30 min, 1:5 el modo de coincidencia y 400-600 keVp energía ventana.
    3. En cuenta regresiva hora = 15 min Inicio adquisición de imágenes de CT.
    4. En el tiempo de cuenta regresiva = 0 min Inicio adquisición de imágenes de PET.
      1. Si es serial proyección de imagen de animal requeridos, deje que los animales se recuperan completamente de la anestesia, es decir, recuperar conciencia bajo supervisión. Posteriormente, transferirlos a una unidad de mantenimiento.
      2. Si es el terminal de proyección de imagen sesión, proceda a eutanasia animal o sobredosis de anestésica, creciente concentración de dióxido de carbono, o dislocación del cuello.

5. Análisis de datos en vivo

  1. Reconstruir los datos de la PET-TAC usando un algoritmo iterativo 3D basados en Monte Carlo. Asegurar que se consideran las correcciones para la atenuación, tiempo muerto y decaimiento del radioisótopo. Para detalles consulte las instrucciones del fabricante del instrumento de PET/CT en uso.
  2. Imágenes de control CT y PET co está registradas correctamente y guardar los datos en un formato de intercambio adecuado como 'Digital Imaging and Communications in Medicine' (DICOM).
  3. Analizar imágenes
    1. Cargue los archivos DICOM reconstruidos a un software de análisis de imagen adecuado que permite el reconocimiento y la delimitación de regiones de interés (ROIs) y posterior cuantificación de señal de PET en estos ROIs.
    2. Segmento el ROIs uso manual o adaptable de umbral para definir ROIs33,34 usando un paquete de software conveniente. Información de la imagen anatómica de la tomografía computarizada ayuda guía ROI asignación, por ejemplo, los tumores superficiales o volúmenes pulmonares.
    3. Utilice el software de análisis según las instrucciones del fabricante y asegúrese de datos son calibrados a la dosis de radiactividad inyectada y corregidos por atenuación y decaimiento radiactivo.
  4. Dibujar gráficos mostrando los datos de esta cuantificación en vivo . Datos expresados como tanto por ciento inyección dosis/volumen (%ID/mL) o valor de captación estándar (SUV), que es una medida alternativa teniendo en cuenta la radiactividad en todo el cuerpo del sujeto.
    1. Calcular los valores de %ID/g suponiendo que la densidad del tejido a ser como el agua, es decir, ~ 1 g/L. Cabe destacar que esta hipótesis puede ser válida para los órganos con diferentes densidades, como pulmón o hueso.
    2. Calcular diferentes SUV para estimar el verdadero SUV (por ej. SUVmean, SUVmax); SUVmax es más confiable para pequeños objetos y se utiliza más con frecuencia que SUVmean35.

6. análisis ex vivo

Realizar el análisis abajo enumeradas: la proyección de imagen (i) de la fluorescencia de los órganos que contienen células de cáncer fluorescente (tumor primario y metástasis) durante la disección de animales, (ii) medición de la distribución del radiotrazador en los tejidos y (iii) histologic o (iv) evaluación de la citometría de órganos cancerosos.

  1. Medición de la distribución del radiotrazador por γ-conteo (ex vivo biodistribución) y ex vivo imágenes de fluorescencia de los tejidos cancerosos.
    1. Medir la radiactividad del animal entero muerto y tenga en cuenta el valor y el tiempo.
    2. Disecar los animales y recoger los tejidos siguientes: pulmón, corazón, sangre (con Capillares de vidrio de 20 mm), hígado, estómago, riñones, bazo, intestinos delgado y grueso, tiroides y glándulas salivales, un trozo de músculo de la pierna y el hueso de los fémures posteriores, y los ganglios linfáticos correspondientes y desarmables y tejidos cancerosos.
    3. Medir la radiactividad de la caparazón restante incluyendo primero excepto la cola y tenga en cuenta los valores y los tiempos de medición.
      Nota: Radiactividad en la cola se puede considerar de marcador radiactivo que se inyecta mal y así no llegar a la circulación; por lo tanto, esta cantidad de la radiosonda no contribuía a la dosis inyectada. La radiactividad de la cola sirve también como parámetro retrospectivo de calidad de la inyección.
    4. Pesar de todos los tejidos (use tubos previamente pesados).
    5. Tomar fotografías de los órganos cancerosos en luz del día y bajo la luz de la fluorescencia.
      Nota: Utilice un soporte de cámara para mantener constante la distancia entre la lente de cámara y órgano (o utilizar un instrumento comercial dedicado para este propósito).
    6. Integrar órganos/tejidos para histología aguas abajo en OCT o sumerja en formalina para su fijación. Para otras aplicaciones posteriores puede diferir preparación de la muestra.
    7. Radiosonda preparar estándares de calibración en duplicados, por ejemplo, 0 a 1000 BQ [18F] BF4.
      Nota: Estándares de calibración deben (i) se relacionan con las cuentas medidas por minuto valores de radiactividad (en kBq) y (ii) simplificar la corrección de la caries; 18 F puede reemplazar [18F] BF4.
    8. Contar la radiactividad de todos los tejidos cosechados usando un contador de γ junto con estándares de calibración de radiactividad de paso 6.1.7. Tenga en cuenta el tiempo de medición. Si tasas de conteo son demasiado altas (es decir, fuera de la linealidad de la calibración estándar o indicado por el detector demasiado tiempos muertos), volver a contar las radiosonda muestras dos semividas más adelante.
    9. Presentación de datos como %ID/g o valores de captación estándar (SUV) (Equ.2).
      SUV = Equation 2 (Equ.2)
    10. Deseche todos los tejidos cosechados que no son necesarios para más abajo análisis según normas de gestión de residuos local.
  2. Analizar los tejidos cancerosos por citometría o histología según las preferencias y el estándar de protocolos (como se describe en otra parte3,6,28).

Representative Results

El primer paso requiere la ingeniería genética de las células del cáncer del interés. Aquí, los resultados de lentivirales transduction de las células de cáncer de mama metastásico murino 4T1 inflamatoria y las células MDA-MB-231 metastásicas humanas con lentivirus se muestran partículas de ADN que codifican GFP NIS o NIS-RFP. Eficacia de transducción de señales varió de líneas celulares de cáncer (figura 2A, columna de la izquierda). Sin embargo, todos resultante transduced líneas fueron seleccionadas por FACS para pureza (figura 2A, derecha) de la célula de cáncer. Microscopia confocal de la fluorescencia (figura 2B) demostró la localización correcta de membrana plasmática de NIS-función FPs. NIS-FP se cuantificó mediante captación de radiotrazador que brinda NIS (figura 2-2E) y función de NIS y especificidad. En particular, no hubo diferencias significativas entre 4T1. NIS-GFP y 4T1. Expresando las líneas celulares con niveles similares de expresión de NIS NIS-RFP fueron encontradas (figura 2).

Tras completo en vitro caracterización de línea de celular, se crearon modelos de tumores con las líneas celulares de cáncer trazable recién generado. Por ejemplo, el 4T1. NIS-GFP tumor modelo, un modelo de cáncer de mama inflamatorio, aquí se muestra (figura 3). En animales con tumores longitudinal todo el cuerpo del animal doméstico proyección de imagen informado entonces sobre la progresión del tumor incluyendo la diseminación metastásica (figura 3B). El PET radiosonda [18F] BF4 era necesario para la proyección de imagen y recién se produjo en la mañana de cada mascota de sesión. Síntesis de [18F] BF4 se realizó mediante el método descrito de ARS. Por lo general, ~1.6 GBq 18F fue usada como entrada y obtuvo ~ 244 MBq [18F] BF4 en 40.5±3.9 min (N = 17). El producto fue había analizado por cromatografía en capa fina radio o cromatografía iónica y demostró una pureza radioquímica de 94.7±1.4%. El rendimiento radioquímico fue 19.4±4.0% (corregido de decaimiento).

El día 19 después de la inoculación del tumor, el tumor primario se identificó claramente con PET, pero no encontrado ninguna metástasis. Diez días después (día 29), los mismos ratones con tumores eran a imagen y metástasis a distancia en varios lugares en todos los animales (metástasis de pulmón, metástasis a varios nodos de linfa inguinales o axilares) fueron identificados. El ejemplo en la figura 3 demostró metástasis pulmonar extensa con varios nódulos claramente identificables y cuantificables en el pulmón (figura 3B-3E). Por otra parte, el animal presentó diseminación regional del tumor en la pared peritoneal y metástasis a la inguinal y ambos nodos de linfa axilares. % Valores de ID de cada metástasis en el pulmón (figura 3E) difieren ampliamente, pero también lo hicieron los volúmenes ocupados de los nódulos metastásicos subyacentes. Por el contrario, valores normalizados de volumen %ID/mL (figura 3E) fueron mucho más uniformes. Esto era comprensible para diversas metástasis en etapas similares de desarrollo (es decir, desarrollado entre los días 19 y 29; Figura 3B). En contraste, el valor normalizado de %ID/mL para el tumor primario fue más bajo que ésos para las metástasis de pulmón, que está en consonancia con una masa de tumor que tenía más tiempo para progresar y remodelación incluyendo la afluencia de otros tipos celulares (células del estroma, células inmunes) , particularmente en este modelo de cáncer de mama inflamatorio.

Guiado por imágenes en vivo y la fluorescencia de las células cancerosas (visibles durante la disección de animales bajo la luz de la fluorescencia), pequeños órganos profundamente arraigados tales como nodos de linfa fueron confiablemente cosechados y, al mismo tiempo, evaluó (contenido) nódulo canceroso Figura 4A). Mientras que la señal de fluorescencia durante la disección animal era indicativa de la presencia de células tumorales, es importante para que esta clasificación fue acompañada por ex vivo mediciones de radiactividad de los tejidos cosechados. Figura 4B se muestran los valores de captación estándar (SUV) obtenidos para los diferentes tejidos a través de una cohorte de tres animales, que presenta con la metástasis. Endógeno expresar NIS órganos como la tiroides y las glándulas salivales (cosecha combinada) o el estómago demostró también la captación del radiotrazador alta esperada. Además, este enfoque de NIS-FP permitió sencillo cáncer célula identificación durante la histología (figura 4). Estos datos de ejemplo de histología de la inmunofluorescencia demostraron la vascularización del tumor en el 4T1. Modelo de tumor NIS-GFP. Estos datos también mostraron que el reportero GFP NIS residido principalmente en las membranas del plasma del tumor las células también en vivo (figura 4), validando así los resultados de absorción.

Figure 1
Figura 1. Esquema que detalla la configuración de la plataforma de síntesis de radiosonda automatizado para la producción de [18F] BF4 mediante el método de adición de flúor-18-a-boro trifluoruro. Nombres de reactivo están impresas en los tubos correspondientes en el esquema. QMA es la abreviatura de intercambio de aniones amonio cuaternario e indica el material usado separación cromatográfica de fase sólida. Detalles adicionales están disponibles en las tablas 1 y 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Resultados de la caracterización típica de líneas celulares de cáncer estable expresando GFP NIS o NIS-RFP. (A) las líneas celulares indicados se realizaron mediante lentivirus cesión o GFP NIS o NIS-RFP. La columna de la izquierda muestra la población transduced (verde o rojo fluorescente) en comparación con las células de los padres respectivas (gris; 4T1 y las células MDA-MB-231, respectivamente). Porcentajes muestran eficiencias de transducción de señales según lo determinado por citometría de flujo. La columna de la derecha muestra los resultados de flujo cytometric análisis después de la purificación de la FACS de las poblaciones mixtas en la columna de la izquierda. Todas las líneas celulares fueron encontradas para ser > 99% puro para indica células expresando NIS (citometría de flujo). (B) la microscopia Confocal de la fluorescencia de líneas celulares purificadas muestra localización de la membrana plasmática de GFP de NIS o NIS-RFP en las líneas celulares respectivos. WGA-Alexa633 fue utilizado como un marcador de membrana plasmática. (C, D) Validación funcional de la proteína NIS-FP expresada en los indicados recién generado líneas celulares de cáncer. Función de NIS se midió con la radiosonda 99 mTcO4 (50 kBq por millones de células). Como controles, se utilizaron células parentales así como fusión reportero expresando las células que fueron tratadas con el perclorato del sustrato Co NIS antes y durante el ensayo (control de especificidad). Resultados demuestran claramente la función de NIS-FP y especificidad en todas las líneas celulares. (E) validación funcional de 4T1. Líneas celulares FP-NIS utilizando [18F] BF4 como un marcador radiactivo para NIS. Otras condiciones eran idénticas a (C). Importante, la absorción relativa muy similar resultados se obtuvieron para ambas líneas 4T1-células con ambos radiotrazadores (figura 2 y E), lo que justifica el uso intercambiable de ambos para en vitro caracterización funcional de Líneas celulares expresan NIS-FP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Resultado representativo de metástasis [18F] BF4-PET/CT la proyección de imagen en un ratón con un 4T1 de seguimiento. Tumor de NIS-GFP. (A) 1 millón 4T1. Células de NIS-GFP se inyectaron en las almohadillas de grasa mamarias de ratones de 5-6 semanas de edad BALB/c CanN.Cg-Foxn1nu/Crl y crecimiento del tumor fue seguido en el tiempo usando pinzas. Debido a la fluorescencia de GFP de las células cancerosas, evaluación identificación visual crudo crecimiento fue también posible usar una antorcha de fluorescencia y gafas de filtro adecuado (ver recuadro). (B/izquierda) En día 19 post tumor la inoculación, el tumor primario (línea punteada amarilla) fue claramente identificado pero no metástasis. La imagen presentada es una proyección de máxima intensidad (MIP) de la imagen de PET. También se registraron las señales endógenas NIS (descriptores de blanco), es decir, la tiroides y las glándulas salivales (Th + SG), estómago (S) y, en niveles muy bajos, algunas partes de las glándulas mamarias y lagrimal. La señal de vejiga (B) proviene de la excreción de trazador. B (derecha) El día 29 post tumor la inoculación, se identificó claramente metástasis: metástasis múltiples en el pulmón (línea punteada amarilla) así como los nodos de linfa metastáticos (ILN, AxLN, puntas de flecha amarillas). La imagen presentada es un MIP de la imagen de PET/CT. El tumor primario (línea punteada amarilla) creció no sólo en una forma globular en este momento, pero también había invadido en la pared peritoneal. (C) una aplicación 3D de la técnica de umbral Otsu activado 3D representación superficial de los tejidos cancerosos; Estos se superponen en un MIP de PET. Las metástasis del pulmón se muestran en nodos de linfa axilares metastásicos, blanco en rojo, el nodo de linfa inguinal metastático en amarillo y el tumor primario que invadieron en la pared peritoneal en turquesa. (D) una imagen de Blow-up de la MIP de PET/CT (B/derecho) para indicar metástasis pulmón individual. (E) captación de radiotrazador en tejidos cancerosos fue cuantificado de imágenes 3D (% ID) y normalizada por sus respectivos volúmenes (%ID/mL). Las metástasis del pulmón individuales corresponden a la numeración en (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Ejemplos típicos de datos de ex vivo de ratones con tumores de FP-NIS. (A) durante la recolección de tejido para análisis de aguas abajo, las propiedades fluorescentes de las células tumorales expresan de NIS-FP sirven como un indicador guía disección de animales. Como ejemplos, los tejidos del animal en la figura 3, es decir, el pulmón con varias lesiones metastásicas y dos ganglios linfáticos positivos se muestran. Fotografía de luz natural, así como se muestran imágenes de fluorescencia. Las imágenes de fluorescencia fueron tomadas con la misma cámara las imágenes de luz pero bajo excitación luz azul (filtro de paso de banda de 450±10 nm) con un filtro de emisión verde (filtro de paso de banda de 530±30 nm) colocado delante de la lente de la cámara. (B) distribución del radiotrazador en órganos diferentes '(biodistribución del) de los animales con 4T1. Tumores de NIS-GFP (inoculación de día 29 post tumor, N = 3; 5 MBq [18F] BF4). Absorción estándar se calcularon los valores (SUV) y valores > 1 indican acumulación específica del radiotrazador en los órganos respectivos. Los datos muestran captación de radiotrazador específicos en los tejidos cancerosos, es decir, el tumor primario, nodos de linfa metastáticos (como identificados por disección bajo la luz de la fluorescencia y la proyección de imagen), pulmón (fue disecada en su conjunto sin separar las metástasis individuales), así como órganos endógeno expresar NIS, es decir, la tiroides y las glándulas salivales y el estómago. (C) histología de la inmunofluorescencia del tumor primario desde el mismo ratón como se muestra en la figura 3. El tumor primario fue cosechado, incrustado en OCT y congelado antes de ser seccionado (10 μm) y procesado para la tinción. Las células cancerosas expresa GFP NIS se identificaron directamente sin necesidad de anticuerpos. Los vasos sanguíneos fueron teñidos con un anticuerpo de conejo contra ratón PECAM-1/CD31 (2 μg/mL) y un anticuerpo secundario conjugado con Cy5 cabra anti-conejo. Núcleos fueron teñidos con 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole (1 μg/mL) y la muestra había montada en polivinílico (alcohol del vinilo - vinil acetato) con 2,5% (p/v) Dabco como un preservador de fluorescencia. Imágenes confocales fueron obtenidas usando un microscopio confocal con la configuración apropiada para 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole, GFP y Cy5. Estos datos de ejemplo muestran claramente la 4T1. Tumor de NIS-GFP es vascularizado pero también esa vascularización difiere en su grado (CF. arriba a la izquierda con la mitad inferior). También muestra que el reportero GFP NIS reside predominante en las membranas del plasma del tumor las células en vivo (recuadro), tal modo validar los resultados de absorción en vitro . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Válvula múltiple FASTlab Reactivos, solventes, cartucho o tubo * Datos de
V1 Tubería del silicón [18O] H2O residuos botella 14 cm
V2 0.9 solución de NaCl al %, 750 μl frasco de 11 mm
V3 Jeringa S1 1 mL
V4 cartucho de intercambio aniónico C1, previamente acondicionado con 1 M de NaCl (10 mL) y H2O (10 mL) por ejemplo Sep-Pak Accell Plus QMA más luz (aguas, cat. Jajaja WAT023525)
V5 Tubo de silicona en cartucho de intercambio aniónico C1 14 cm
V6 [18O] H2O /18F depósito de entrada Máximo de 5 mL
V7 Tubo de silicona a la vasija del reactor (izquierda; entrada de gas) 14 cm
V8 Tubo de silicona a la vasija del reactor (central puerto, entrada/salida del líquido) 14 cm
V9 Cerrado
V10 Cerrado
V11 Jeringa S2 5 mL
V12 15-corona-5, 46 mg en 800 μl MeCN frasco de 11 mm
V13 Trifluoroborate dietílico eterato, 0.14 μL en 850 μl MeCN (diluido 14 μl de BF3. OEt2 con 1 mL MeCN. Diluir 10 μl de esta solución a 850 μl con MeCN). frasco de 13 mm
V14 0.9 solución de NaCl %, 1 mL frasco de 13 mm
V15 Punto de bolsa de agua
V16 Acetonitrilo (MeCN), 1,5 mL frasco de 13 mm
V17 Tubo de silicona cartucho de alúmina neutra C2 14 cm
V18 Cartucho de alúmina neutra C2, previamente acondicionado con H2O (10 mL), acetona (10 mL) y aire (20 mL) por ejemplo Sep-Pak alúmina N más luz (aguas, cat. Jajaja WAT023561)
V19 Tubo de silicona en cartucho de intercambio aniónico C3 14 cm
V20 cartucho de intercambio aniónico C3, previamente acondicionado con 1 M de NaCl (10 mL) y H2O (10 mL) por ejemplo Sep-Pak Accell Plus QMA más luz (aguas, cat. Jajaja WAT023525)
T2s Tubo de silicona para frasco 40 cm
V22 Cerrado
V23 Cerrado
V24 Jeringa S3 5 mL
V25 Tubo de silicona a la vasija del reactor (lado derecho, orificio de aspiración) 40 cm
* Nota: Debido a las púas de plástico, el volumen muerto para 11 mm frascos y viales de 13 mm es aproximadamente de 0,35 mL y 0.4 mL, respectivamente. Por lo tanto, las cantidades reales de reactivos transferidas al reactor son ligeramente diferentes. Todas las cantidades indicadas en este método se refieren a las cantidades reales en cada frasco de reactivo.

Tabla 1. Descripción de la distribución de cassettes para la síntesis de4 BF automatizado [18F] mediante el método de adición de flúor-18-a-boro trifluoruro (CF. figura 1).

Secuencia de pasos Comentario
[1 - 2] Presurice el sistema y limpie el colector con N2
[3-15] Enjuague la jeringa S3 dos veces con H2O (V15), lavar el colector con N2
[16-23] Viales de reactivo en posiciones V16, V14 y V13 V12, limpiar el colector con N2 entre cada frasco de presurizar
[24-26] Abra la entrada de la actividad (V6)
Conectar el frasco que contiene 18f el. Si el volumen total es > 5 mL, sólo introduzca la aguja hasta la mitad en el frasco antes de continuar.
[27-39] Cerrar la entrada de la actividad (V6), trampa 18F en cartucho QMA C1 (V5), recoge el [18O] H2O en la botella de residuos (V1). Si el volumen total es > 5 mL, hacer una pausa en la secuencia en el paso 37, volver al paso 26, inserte completamente la aguja en el frasco que contiene 18F y reanudar el proceso.
[40] Cerca de la [18O] H2O residuos botella (V1), lavar el colector con N2
[41] Presurice el frasco del eluyente en posición V2
[42-44] Abra la válvula V8 de reactor, aspirar el eluyente desde V2 en jeringa S1
[45-50] Eluir cartucho QMA C1 en el reactor (V8) con solución salina de jeringa S1, la temperatura del reactor a 90 ° C
[51] Lave el cartucho QMA C1 con N2 y aumentar la temperatura del reactor a 105 ° C
[52-53] Sorteo de acetonitrilo de V16 en jeringa S2
[54-57] Acetonitrilo de transferencia de jeringa S2 al reactor (V8)
[58-60] Calentar el reactor a 120 ° C por 5 min evapórese el solvente con una corriente del N2 al reactor (V7).
[61-65] Ajustar la temperatura a 105 ° C, seco jeringa S1 N2
[66-69] Extraer la solución 15-corona-5 de V13 en jeringa S2, aumentar la temperatura del reactor a 120 ° C
[70-71] Reducir la temperatura a 105 º C, lavar el colector con N2
[72] Enfriar el reactor (fije la temperatura a 40 ° C) durante 5 min.
[73-78] Ajustar la temperatura del reactor a 80 ° C, la solución de 15-corona-5 de transferencia de jeringa S2 al reactor (V8)
[79-81] Dibujar el BF3. OEt2 solución de V14 en jeringa S2
[82-87] Transferir el BF3. OEt2 solución de la jeringa S2 al reactor (V8), descargue la línea reactor con N2
[88] Lavar el colector con N2
[89] Reaccionar durante 5 minutos, dejar que la temperatura vuelva a RT
[90-95] Transferir la mezcla de reacción (V8) en jeringa S2
[96-104] Pasar la mezcla de reacción a través del cartucho de alúmina N C2, en jeringa S3
[105] Lavar el colector con N2
[106-109] Volver la mezcla de reacción a jeringa S2
[110-112] Vacíe la jeringa S3, dibujar H2O (V15) en jeringa S2 para diluir la mezcla de reacción
[113-115] Carga de la mezcla de reacción en cartucho QMA C3
[116-118] Dibujar el H2O (V15) en jeringa S2
[119-124] Enjuague el reactor (V8) con H2O de jeringa S2, aspirar el líquido de lavado en jeringa S2
[125-128] Pasar el líquido de lavado a través de cartuchos C2 y C3
[129-130] Secar los cartuchos y el colector con N2
[131-136] Jeringa de lavado S1 con H2O (V15)
[137-142] Jeringa de lavado S2 con H2O (V15)
[143] Lavar el colector con N2
[144-147] Dibujar el H2O (V15) en jeringa S2
[148-151] Limpiar cartucho QMA C3 con H2O de jeringa S2
[152-153] Secar el cartucho QMA C3 con N2 y lavar el colector con N2
[154-157] Eluir cartucho QMA C3 con 0.9% NaCl (V14) en jeringa S3
[158-161] El producto de transferencia de jeringa S3 el frasco de colección (V21)
[162-163] Ras cartucho QMA C3 con N2 al frasco de colección (V21)
[164-166] Lavar el colector con N2
[167-170] Cartuchos color C2 y C3 (para residuos de botella) y el colector con N2
[171] Enjuague el tubo de la colección (V21) con N2

Tabla 2. Descripción de pasos en el archivo de secuencia XML.

Discussion

El primer paso para representar el cáncer células trazable en vivo por este método requiere de la ingeniería para expresar el reportero de la fusión de NIS-FP. La elección de la proteína fluorescente en el reportero de fusión es crítica como oligomerizing proteínas fluorescentes puede llevar al reportero artificial clustering, afectando así negativamente su función. Hemos tenido éxito con proteínas fluorescentes monoméricas probadas como mEGFP (con la mutación monomerizing A206K36,37), mTagRFP o mCherry. NIS puede ser de humanos o de origen de ratón (HNI o msNIS) dependiendo de la finalidad del experimento y el modelo de cáncer. Eficiencia de transducción generalmente varía entre líneas celulares de cáncer diferentes. Sin embargo, líneas celulares de cáncer generados son purificar posteriormente por FACS en este protocolo, reduciendo así la necesidad de optimizar las condiciones de la transducción de señales. Transducción de señales con alta multiplicidad de infección no siempre es aconsejable como integración de construir múltiples en el genoma es probable que resulte en la mayor expresión de la construcción, sino también modificación genoma más no deseado/no reglada. Por lo tanto, es importante que policlonal células transduced crecer para la estabilidad de la expresión (supervisado por citometría de flujo) y evitar clasificar los clones más brillantes sólo por FACS. También representa la validación funcional de características no-reportero crucial antes de estas células deben ser utilizadas para los experimentos en vivo . Una alternativa recientemente desarrollada para genes virales es gene edición tecnología38, que ofrece más control sobre los sitios de integración viral. Análisis por citometría de flujo y el immunoblotting de expresión es importante. Citometría de flujo permite la adquisición de datos basado en la población unicelular, por ejemplo, para examinar si hay cualquier deriva en niveles de expresión del periodista con el tiempo. Se basa en la parte de la FP, a menos que también se tiñen las células con un anticuerpo dirigido contra NIS superficial o total. Citometría de flujo no informan sobre la integridad del reportero de fusión. Por el contrario, immunoblotting informa sobre la integridad de la periodista de fusión. El peso molecular del NIS y la FP debe agregarse para determinar el peso molecular esperado del elegido NIS-FP. Confocal fluorescencia microscopía demostrado fusión reportero colocalización con la aglutinina de germen de trigo de marcador de membrana del plasma en todos los recién hecho de líneas celulares. Esta fue la localización celular esperada para la mayoría de la proteína e indica un acontecimiento dinámico para posterior validación funcional. Si mínimo/no NIS-FP se encuentra en la membrana plasmática (por ejemplo, sólo en compartimentos celulares internos), esto indicaría un problema biológico celular el reportero de la fusión de esta línea celular, o una mutación potencial del reportero de fusión que afecta a su tráfico intracelular. Cabe destacar que no hemos observado un caso en cualquiera de las células de cáncer que hemos probado hasta ahora, que incluye: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (melanoma humano); MCF-7 y MDA-MB-231, MDA-MB-436 (cáncer de mama humano); NCI-H1975 (cáncer de pulmón humano); SK-Hep1 (cáncer de hígado humano); 4T1, 4T1.2, cl 66 4, 67NR, FARN168 (cáncer de mama inflamatorio murino); B16F0, B16F3, B16F10 (melanoma murino); MTLn3 (adenocarcinoma de mama rata).

Función de NIS se medirá utilizando ensayos de absorción con sustratos radiactivos de NIS. Debido a la SPECT radiosonda 99 mTcO4 ser producidos por el generador y por lo tanto ampliamente disponibles en los hospitales sin necesidad de ninguna síntesis de radiosonda, así como un período más largo más conveniente (h 6,01 m 99 TC en comparación con los 110 min 18F), utilizamos este sustrato de NIS para la rutina validación funcional de líneas celulares expresan de nuevo NIS-FP. El bloqueo de células expresando NIS con el perclorato de sodio del sustrato Co NIS dio lugar a la esperada reducción/abolición de captación del radiotrazador, demostrando la especificidad de la captación del radiotrazador. Esta prueba de especificidad de NIS es un paso de crítica validación. Si un experimento de especificidad de NIS no resultaría en captación de radiotrazador reducido comparable a las respectivas células parentales, se ha producido un error técnico durante el experimento o la captación del radiotrazador no era debido a NIS. También es posible que pre-bloqueo perclorato de sodio reduce la captación del radiotrazador en una línea celular parental; Esto permitiría identificar líneas de células con expresión de NIS funcional endógeno (por ejemplo estimula tiroides células6).

Una ventaja fundamental de este protocolo de imagen es que la información es recogida en 3D y con el tiempo. Esto permite la comparación de imágenes desde el mismo animal en el tiempo, proporcionando así datos pareados y superando así los problemas causados por la variabilidad entre animales. Esto contrasta con los métodos de evaluación relacionados con metástasis más no-proyección de imagen que se basan en sacrificar animales diferentes en momentos diferentes. En la figura 3B es evidente extensión y consecuencia como metastásico avanzado con el tiempo en un animal individual. Las señales detectadas por imagen PET/CT son causadas fundamentalmente por la expresión de NIS. Esto incluye todas las señales de forma exógena NIS-expresar las células cancerosas, así como todos los órganos de expresión endógeno de NIS. Endógeno de las señales de NIS se encuentran en la tiroides y las glándulas salivales, el estómago y, en niveles bajos en algunas partes de las glándulas mamarias y lagrimal. Además de endógena expresión de NIS, NIS radiosonda [18F] BF4 también se excreta por los riñones, explicando así la captación del radiotrazador en vejigas llenas de orina. Captación renal ya no es detectable en el momento imágenes recomendada en este protocolo (radiotrazador 45 min post inyección6). Si las señales de vejiga llena de orina deben conducir a problemas de señal de fondo, la vejiga puede vaciarse mecánicamente bajo anestesia antes de la proyección de imagen. Lo importante, las señales endógenas pueden variar entre cepas animales. También cabe destacar que endógena expresión de NIS en las glándulas mamarias puede ser más alto en lactantes condiciones10. En el caso presentado y en los casos de las líneas de metastático de la célula con éxito caracterizados antes (CF. lista de arriba), no se encontró expresión de NIS endógeno a interferir significativamente en la detección de metástasis. Cabe destacar, que [18F] BF4 sigue siendo más disponible para la absorción en los tejidos cancerosos en comparación con el yoduro, porque yoduro es metabolizado en las hormonas de tiroides6. Este fenómeno podría contribuir también a cantidades mayores del radioiodide en el torrente sanguíneo en comparación con [18F] BF4- 6. Para diferentes aplicaciones (célula de cáncer en otros cánceres o aplicaciones de rastreo de la célula de cáncer), esto puede diferir, y por lo tanto se recomienda evaluar si la expresión endógena de NIS es probable que cause problemas de señal a fondo a través de Experimentos preliminares. Un aspecto importante en la proyección de imagen preclínica es la actividad molar de la radiosonda. El método descrito aquí utiliza ~1.5 GBq 18F como material inicial14 y se ha demostrado para producir actividades molares perceptiblemente sobre el método de sustitución previamente divulgados12. [18F] BF4 en actividades molares ≤1 GBq/μmol12 puede conducir a la absorción reducida en los tejidos expresión de NIS. Esto es de particular importancia cuando la cantidad inyectada de radiactividad por kilogramo es alta, es decir, cuando son pequeños animales como ratones reflejada39; es menos importante en el ser humano establecer40. Alta actividades molares son por lo tanto imprescindibles para la proyección de imagen de preclínica PET alta calidad. Actividades molares obtenidas por el boro trifluoruro además método14, que se muestra en forma automática en este protocolo, resolver este problema. Además, cabe destacar que el protocolo presentado para síntesis de4 BF [18F] no cumple con buenas prácticas de fabricación (GMP) y por lo tanto inadecuado para el uso en ensayos clínicos en humanos en esta forma. Un protocolo GMP (mediante el método de sustitución de 18F a radiolabel BF4) está disponible en otra parte40.

Proyección de imagen PET/CT permite la visualización de captación del radiotrazador, que es indicativo de captación de radiotrazador mediada por NIS derivados de las células cancerosas expresa NIS-FP. Más importante aún, las señales de PET asociadas pueden cuantificarse. Es necesario aplicar los procedimientos para asegurar una diferenciación consistente e imparcial de las señales relevantes de cualquier fondo potencial umbral confiable. Como el fondo varía en diferentes lugares en vivo, es importante considerar la segmentación y umbralización local y regional. Un tal método fue desarrollado por y el nombre de Otsu34, y su aplicación 3D se emplea para la representación 3D del tumor primario y las metástasis en este protocolo. Generalmente, la imagen vista por el observador visualmente corresponde mejor a los valores de dosis (% ID) cuantificados % inyectado. En cuanto a la cuantificación basada en imágenes, también es importante normalizar los valores de radiactividad medidos de los diferentes tejidos a sus volúmenes. Hay dos formas predominante usadas de expresar resultados normalizados, ID (i) % por volumen (por ejemplo, %ID/mL) y el valor de absorción (ii) estándar (SUV35). Se diferencian en que %ID/mL tiene en cuenta el volumen individual, mientras que SUV es una medida que está en relación con la media radiactividad en el animal entero. También es importante tener en cuenta que la proyección de imagen de NIS representa el volumen de tumor vivo (LTV) accesible, porque las células muertos/muerte no sintetizar ATP puede no importación radiosonda10. Esto explica la gran área de baja señal dentro del tumor primario (tumor "en forma de donut") indicando zonas de muerte celular/necrosis de tumoral. Lo importante, LTV era una medida más confiable de la carga del tumor en comparación con el volumen de crudo tumor accesible por las medidas del calibrador (que no tiene en la viabilidad de la cuenta y evalúa sólo regiones del tumor superficial).

Una ventaja importante de esta estrategia de rastreo es evidente cuando cosecha los tejidos después de un sacrificio animal. Guiado por imágenes en vivo y con la ayuda de las células cancerosas fluorescente durante la disección de animales, órganos/metástasis pequeñas y profundas también pueden ser confiablemente cosechadas. Metodología de conservación/secciones de tejido congelado permite la proyección de imagen directa de la fluorescencia de GFP sin necesidad de tinción con un anticuerpo anti-GFP, pero a costa de la preservación de tejidos estructurales reducidos en comparación con formalina-fijo metodología de parafina-encajado (FFPE). Este último crítico requiere también coloración anti-FP, ya que el método FFPE es incompatible con la preservación intacta de proteínas fluorescentes (debido a deshidratación/fijación/rehidratación). Mientras que la señal de fluorescencia es indicativa de la presencia de células tumorales, es importante para que esta clasificación es confirmada por ex vivo mediciones de radiactividad de los tejidos cosechados ('biodistribución'). Mediciones de radioactividad ex vivo son más sensibles que la detección visual de fluorescencia, por lo tanto, puede permitir la identificación de cáncer dependiente de la célula las señales que de lo contrario permanecerían sin ser detectada. En el caso de un terminal de sesión, es fundamental conocer exactamente las cantidades de radiotrazador inyectado, así como los tiempos de las mediciones de radiactividad del radiotrazador, inyección animal, animal de sacrificio y calibrar las mediciones del contador de centelleo de tejidos cosechados. Esto es crucial para garantizar la corrección para el decaimiento de la radiosonda y así habilitar análisis de biodistribución confiable.

PET-TAC permite la proyección de imagen había repetida no invasivo cuantificación 3D de progresión del tumor incluyendo la evaluación de la diseminación metastásica a nivel de todo el cuerpo. Esta característica es una ventaja significativa sobre los métodos convencionales, que a menudo se basan en grandes cohortes de animales que son sacrificados para la evaluación de la progresión del tumor en diferentes puntos del tiempo. Las ventajas de este enfoque basado en la proyección de imagen son: (i) altamente sensible no invasiva 3D en vivo de cuantificación, (ii) una reducción significativa en el número de animales debido a la posibilidad de repetición de imagen, (iii) la adquisición de datos pareados longitudinales de posteriores sesiones mejora las estadísticas excluyendo variabilidad entre animales, que a su vez más reduce el número de animales, la proyección de imagen (iv) producción automatizada [18F] BF4 en actividades específicas de alto y (v) la opción intrínseca ex vivo confirmación en los tejidos por métodos de fluorescencia como microscopia o citometría.

En vivo la célula de seguimiento es un campo creciente. Ha sido impulsado por los avances recientes en tecnología, que dio lugar a la resolución mejorada, límites de detección y capacidad de multiplex (a través de la proyección de imagen multimodal). En este protocolo, se aplica este concepto para el seguimiento de la progresión del tumor incluyendo metástasis de células de cáncer espontáneo en 3D por proyección de imagen de repetición. Las aplicaciones incluyen estudios destinados a desentrañar los mecanismos de la metástasis de células de cáncer espontáneo. Por ejemplo, las células tumorales trazable podrían utilizarse para estudiar el impacto de los componentes de la célula inmune diferente (como funcionales presente en cepas animales de diferentes niveles de immunocompromisation) sobre el proceso metastásico. Del mismo modo, el impacto de genes individuales, ya sea en la cepa animal o la línea celular de cáncer, podría ser estudiado. Además, el protocolo presentado podría ser utilizado para evaluar/validar la eficacia de fármacos específicos o conceptos terapéuticos en la progresión del tumor. Lo importante, este par de gene: radiosonda de reportero para la proyección de imagen del animal doméstico (NIS: [18F] BF4) también podría ser utilizado para diferentes aplicaciones de rastreo de la célula. Por ejemplo, varias terapias con células madre actualmente están surgiendo enfoques terapéuticos como prometedoras. Esto incluye terapias celulares para el tratamiento de cáncer41 sino también en medicina regenerativa43,44 ajustes y trasplante42 . Todo el cuerpo en vivo la célula de seguimiento se está convirtiendo en cada vez más importante para el desarrollo y la traducción clínica de la terapéutica celular, por ejemplo, para evaluar la seguridad y seguimiento farmacoterapéutico.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

La investigación fue apoyada por el King College de Londres y UCL centro integral de cáncer de la proyección de imagen, financiado por Cancer Research UK y EPSRC en asociación con el MRC y DoH (Inglaterra); el Instituto Nacional Centro de investigación biomédica de la investigación de la salud (NIHR) basado en el de Guy y St Thomas' NHS Foundation Trust y el College de Londres King; el centro de excelencia en ingeniería médica financiado por el Wellcome Trust y el EPSRC bajo la beca número WT 088641/Z/09/Z; un cáncer investigación Reino Unido multidisciplinario proyecto Premio a GOF y PJB y subvención de asociados para la salud de un rey a GOF. Los escáneres nanoPET/TC y nanoSPECT/TC fueron comprados y mantenidos por una subvención de equipos de la Wellcome Trust. Las opiniones expresadas son las de los autores y no necesariamente las del NHS, el NIHR o el DoH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole Thermo Scientific H3570 Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line ATCC CRl-2539 for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter Roche Diagnostics GmbH 5651697001 CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent Sedna Scientific 2501036
CASYton Isotonic Diluent Sedna Scientific 2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 Leica, Wetzlar, Germany Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness VWR International 631-0150
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
DMEM Sigma D5546 Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III  BD Biosciences Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine Sigma G7513 Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells ATCC HTB-26 for details see ATCC website
Mowiol 4-88 Sigma 81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G Addgene #12259 plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE Addgene #12251 packaging plasmid
pRSV-Rev Addgene #12253 packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Penicillin-Streptomycin Sigma P43330 Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate) Polysciences 17951 Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833 From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water 
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge Hettich Lab Technology
RPMI 1640 Sigma R0883 Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm Corning
Syringes 10 mL BD Emerald Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL  Life Technologies Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X  Sigma 59418C (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red 
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate  Life Technologies  W21404 Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper World Precision Instruments 501601
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5 Sigma-Aldrich 188832 CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous) Acros Organics 326811000
Boron trifluoride diethyl etherate Sigma-Aldrich 216607 BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes GE Healthcare FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets Macherey-Nagel 802021 RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light Waters WAT023525 Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light Waters WAT023561 Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP GE Healthcare
Nitrogen filter Millipore SE2M049I05 Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber Vet-Tech AN010R With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system Vet-Tech AN001B Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline Thermo Scientific Oxoid BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger Vet-Tech AN200 VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane  Sigma 59070-1L-D Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 85040C
Cover slips 22×50 mm VWR International SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT SLEE Medical two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson/Stratech 111-175-144 Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35  CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope Nikon Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound  VWR international 361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN Dako UK Ltd Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS) available from various suppliers. Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

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References

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Gen reportero de radionúclido-fluorescencia de imagen para seguir la progresión del Tumor en modelos de roedores Tumor
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Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).More

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

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