Tumor endotelceller er vigtige determinanter af tumor mikromiljø og forløbet af sygdommen. Her, er en protokol til isolering af ren og levedygtige endotelceller fra menneskelige colorectal karcinom og normal kolon skal anvendes i drug test og patogenese forskning beskrevet.
Primærelementer isoleret fra menneskelige karcinomer er værdifulde værktøjer til at identificere patogene mekanismer bidrager til udvikling af sygdom og progression. Især endotelceller (EF) som udgør den indvendige overflade af fartøjer, direkte deltage i ilttilførsel, næringsstofforsyning og fjernelse af affaldsprodukter til og fra tumorer, og dermed en fremtrædende deltager i forfatningen af tumor mikromiljø (TME). Tumor endotelceller (TECs) kan bruges som cellulære biosensorer af intratumoral mikromiljø etableret af kommunikation mellem tumor og stromale celler. TECs også fungere som mål for terapi. I overensstemmelse hermed, tillade disse celler i kultur studier på mekanismer af svar eller modstand mod anti-angiogene behandling. For nylig, blev det konstateret at TECs isoleret fra menneskelige colorectal karcinom (CRC) udstille hukommelse-lignende effekter baseret på den specifikke TME de blev afledt. Desuden, disse TECs bidrage aktivt til oprettelsen af en specifik TME af udskillelsen af forskellige faktorer. For eksempel udskiller TECs i en prognostically gunstige Th1-TME den anti-angiogene tumor-undertrykkende faktor udskilles protein, sure og rigt på cystein-lignende 1 (SPARCL1). SPARCL1 regulerer fartøj homøostase og hæmmer tumor celleproliferation og migration. Dermed er kulturer af ren, levedygtig TECs isoleret fra menneskelige solide tumorer et værdifuldt redskab for funktionelle studier på det vaskulære system i tumordannelse rolle. Her, er en ny up-to-date protokol til isolering af primære EF fra den normale kolon samt CRC beskrevet. Teknikken er baseret på mekaniske og enzymatiske væv fordøjelsen, immunolabeling og fluorescens aktiveret celle sortering (FACS)-sortering af triple-positive celler (CD31, VE-cadherin, CD105). Med denne protokol, levedygtig TEC eller normal endotel celle (NEC) kulturer kunne være isoleret fra tyktarmen væv med en succesrate på 62.12% når de udsættes for FACS-sortering (41 ren EF kulturer fra 66 vævsprøver). Derfor giver denne protokol en robust tilgang for at isolere menneskelige EF kulturer fra normale kolon og CRC.
Tumor mikromiljø (TME) defineres som en tæt samspil mellem tumorceller og tumor stroma, der består af celler som endotelceller (EF), pericytes, fibroblaster, glatte muskelceller eller immunceller. Kommunikationen mellem disse cellulære rum kan være drevet af paracrine faktorer (fx angiogene vækstfaktorer, cytokiner), af den ekstracellulære matrix, eller direkte celle-celle kontakt. Stromale rummet kan fremme eller modvirke tumor initiering eller progression, afhængigt af den specifikke TME etableret.
En tumor evne til at forbinde med fartøjet system er nøglen til progression og metastaser af sygdommen. Fartøj systemet tillader tumor overvejende til at få adgang til levering af ilt og næringsstoffer samt fjernelse af affaldsprodukter1,2,3. EF udgør den indvendige overflade af fartøjer, og er derfor vigtige cellulære komponenter, der deltager aktivt i denne proces. Det er velkendt, at tumor endotelceller (TEC) er anderledes end deres tilsvarende normale endotelceller (NEC) af mange funktioner såsom forstyrret hierarki af vaskulær træ, skibet leakiness, eller reduceret modning, som eksemplificeret af et reduceret antal pericytes/vægmaleri celler, der er kun løst tilknyttet EF4.
Dermed er TECs værdifulde cellulære værktøjer at studere carcinogenese. TECs ansås primært at fremme tumor vækst og progression3. TECs kan således bruges som biosensorer, der giver mulighed for overvågning og identifikation af patogene processer, der indlede, fremme eller modvirke tumordannelse. Derudover er de terapeutiske mål i klinik5. Derfor kan isoleret TECs og tilsvarende NECs også bruges som værktøjer til at forstå mekanismerne i svar eller modstand mod anti-angiogene behandling.
I fortiden, vi udviklede en protokol til at isolere disse celler6,7 og identificeret at TECs er ikke kun adskiller sig fra NECs, men også adskiller sig fra hinanden alt efter TME de blev afledt fra8. Gennem denne tilgang blev det vist, at TECs i visse TMEs aktivt modvirke tumorvækst og progression af sekretion af anti-angiogene tumor-undertrykkende proteiner som SPARCL1. Det angives, at TECs bidrager aktivt til oprettelse af en prognostically gunstige TME i menneskelige colorectal karcinom (CRC)8.
Tidligere undersøgelser har forsøgt at isolere menneskelige TECs fra solide tumorer. Et vigtigt mål for disse undersøgelser var, fx identifikation af nye tumor endotel celle markører (tering)9. En strategi for umiddelbar brug af TECs efter laser microdissection blev anvendt for at undgå ændring eller tab af TEC fænotype i kultur. Men opfølgende undersøgelser identificeret vægmaleri celler kontaminerende indbyggere som en alvorlig ulempe ved denne tilgang10. Vores laboratorium var først til at udvikle en protokol, der tillod isolering af ren, levedygtig TECs fra menneskelige CRC patienter6,7. Blev valgt en tilgang med flere magnetiske celle udvalg (MLA) runder af TECs, som sikrede høj renhed af de isolerede EF kulturer. Men denne fremgangsmåde kræves en relativt lang dyrkning periode (6 uger i gennemsnit), som øger risikoen for kultur-induceret artefakter. Derfor, i det næste trin, målet var at reducere dyrkning tid mellem kirurgi og høst af den første ren kultur. For at nå dette mål, en forbedret protokol beskæftiger en kombineret mekaniske og enzymatiske-baserede væv dissociation af den oprindelige tumor, efterfulgt af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS)-sortering af triple-mærket EF, blev udviklet. Dette reduceret isolation tid i gennemsnit til tre uger, hvilket resulterer i TEF og NEC renkulturer med øget rentabilitet for funktionelle studier. Isolering af ren levedygtige TEC og NEC kulturer fra humane væv med høj succesrate kan åbne nye muligheder for patienten-specifikke drug test under udviklingen af individualiseret behandling regimer. Isoleret tilgang er detaljeret beskrevet i de følgende afsnit.
Hovedsagelig, har tre forskellige metoder været ansat med hidtil at isolere ren og levedygtige NECs og TECs fra humane solid væv, nemlig (1) immunomagnetic berigelse, (2) laser microdissection, og (3) FACS-sortering af EF brøkdel. I de fleste publikationer var immunomagnetic berigelse af celler efter generation af en enkelt cellesuspension af mekanisk disintegration brugte11,12,13. For eksempel, immunomagnetic rensning af human dermal mikrovaskulære EF (HDMEC) af E-selectin antistoffer efter tumornekrosefaktor (TNF)-α behandling fra neonatal foreskins13 er blevet rapporteret til isolering af menneskelige EF fra gliom af væv fordøje, percoll forløb, og markeringen ved hjælp af anti-CD31/CD105 og VE-cadherin-antistoffer12, eller af anti-CD105 antistoffer fra humane bryst karcinom11. Protokoller, der beskæftigede laser microdissection eller FACS-sortering er mindre hyppigt rapporteret. Laser microdissection blev brugt, for eksempel, for at identificere potentielle pan-tumor endotel celle markører (tering) i EF stammer fra menneskelige colorectal karcinom med analyse af cellerne umiddelbart efter dissektion9. FACS-sortering ved hjælp af anti-CD31-antistoffer blev med succes demonstreret til isolering af EF brøkdel fra udifferentierede menneskelige embryonale stamceller-celler14.
Disse metoder har forskellige fordele og ulemper, der skal overvejes. Fordele for den immunomagnetic-baseret tilgang er at ingen omfattende udstyr er påkrævet, udvælgelse kan foretages nogen tid, og celle berigelse er hurtig (ca. 15 min.) i forhold til FACS-sortering (ca. 1 h). Manglen på matrix i en længere periode kan fremkalde celledød i EF af anoikis. Derfor, tilsætning af rho kinase inhibitor Y-27632 til FACS buffer var ansat til at forhindre cell anoikis15.
Ulemperne ved immunomagnetic berigelse er, at flere runder af udvælgelse er nødvendig for at opnå renhed over 99%. Desuden, celle dyrkning mellem enrichments er nødvendige for celle opsving, hvilket øger alder kulturer støtte kultur-induceret artefakter. Laser microdissection har den fordel, at celler kan blive anvendt straks, som reducerer kultur-induceret artefakter men indeholder risikoen for kontaminering af celler fra tilstødende væv områder10. Desuden microdissection ikke er etableret i hvert laboratorium. Ulemperne ved metoden FACS-sortering-baserede omfatter, ligner laser microdissection, at udstyr er omfattende og omkostningskrævende. I overensstemmelse hermed, må dette udstyr ikke være tilgængelige når som helst. I en klinisk indstilling, hvor tilgængeligheden af væv af interesse ikke kan være præcis planlagt, kan det tilføje en yderligere ulempe.
De store fordele ved FACS-sortering er dog at EF brøkdel kan mærkes af flere antistoffer parallelt. Således, en strengere gating strategi kan være ansat som vil sikre en høj renhed. Baseret på erfaring, var ingen re sortering af EF brøkdel påkrævet, i modsætning til den foregående Mac-baseret protokol, hvor flere runder af udvalg skulle være ansat. Dette førte til et betydeligt reduceret dyrkningen tid indtil renhed fra seks uger (MACS tilgang) til tre uger i FACS tilgang, hvilket resulterer i en forbedret cellernes levedygtighed muliggør en langvarig tidsvindue for analyse. Endelig bruger den FACS-sortering-baseret strategi, en forbedring af den samlede isolation succesrate kunne være opnået (stigning på 12,5%). Afslutningsvis baseret FACS-sortering strategi beskæftiger 3 antistoffer parallelt efter væv digest af kombinerede mekaniske og enzymatiske væv fordøjelsen havde mange fordele, der etableret denne protokol som den foretrukne metode til isolering af TECs og NECs fra menneskelige colorectal karcinom og kolon.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christian Flierl, Katja Petter, Christina Schnürer (alle Division af molekylære og eksperimentel kirurgi), Uwe Appelt, Michael Mroz (Core enhed FACS-sortering) og Simon Völkl (Core enhed FACS-Immunomonitoring) for fremragende teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af tilskud til EN/MS af interdisciplinære Center for klinisk forskning (IZKF) af University Medical Center Erlangen, tysk Research Foundation (DFG: FOR 2438, SP2) og Lutz-Stiftung, af et tilskud af Robert-Pfleger-Stiftung VSS samt tilskud til MS fra tyske Research Foundation [DFG: KFO257 (delprojekt 4), SFB 796 (delprojekt B9)].
HBSS 1x | Gibco by Life Technologies | 14175-053 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
amphotericin B | Gibco by Life Technologies | 15290-026 | |
Scalpels, disposable | Feather | No. 23 | |
gentleMACS octo dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
human tumor dissociation kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
DMEM | Gibco by Life Technologies | 21969-035 | |
EGM-2-MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
Cell strainer, 100 µm | Falcon | 352360 | |
StemPro Accutase | Gibco by Life Technologies | A11105-01 | |
Cell counter, automated | Coulter Counter | Z1 | |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
CD31-FITC | BD Pharmingen | 555445 | |
CD144/VE-cadherin-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
FACS-Sorting device | Beckman Coulter | MoFlo XDP |