Summary
腫瘍血管内皮細胞は、腫瘍微小環境の重要な決定要因と病気のコースです。ここでは、ひと大腸癌と薬剤テストおよび病因の研究で使用される通常のコロンから純粋な実行可能な血管内皮細胞の隔離のためのプロトコルを説明します。
Abstract
ひと癌由来初代培養細胞は、病気の発症や進行に貢献する病原性のメカニズムを識別するために貴重なツールです。特に、血管の内面を構成する内皮細胞 (EC) は直接腫瘍からの酸素供給、栄養供給、廃棄物の除去に参加し、腫瘍の憲法にそれにより目立つように関与しています。微小環境 (TME)。腫瘍血管内皮細胞 (TECs) は、腫瘍と間質細胞間の通信によって確立された腫瘍内微小環境の細胞バイオ センサーとして使用できます。TECs は、療法のターゲットをとしても使用。したがって、文化のこれらの細胞は応答または抗血管新生治療に抵抗性のメカニズムの研究を許可します。最近、TECs が彼らから派生した特定の TME に基づく展示メモリのような効果のひと大腸癌 (CRC) から分離することを分られました。さらに、さまざまな要因の分泌によって、これらのテクスは特定 TME の確立に積極的に貢献します。たとえば、予後良好の Th1 TME のテクスは酸性とシステインのような 1 (SPARCL1) で豊富な抗血管新生腫瘍抑制因子の産生蛋白質を分泌します。SPARCL1 血管の恒常性を調節し、腫瘍細胞の増殖と移行を阻害します。したがって、人間の固体腫瘍から分離した純粋な実行可能な TECs の文化、腫瘍における血管系の役割機能研究のための貴重なツールです。ここでは、CRC と同様、主要な EC の通常のコロンからの分離の新しい最新のプロトコルを説明します。テクニックは機械的および酵素組織消化、反応、および蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えに基づいて-トリプル陽性細胞 (CD31、VE カドヘリン CD105) の並べ替え。このプロトコルで実行可能なテックや正常な内皮細胞 (NEC) 文化が 62.12 %facs 並べ替えに服従するときの成功率で大腸組織から隔離されかねない (66 の組織サンプルから 41 の純粋な EC 文化)。したがって、このプロトコルは、通常のコロンと CRC から人間の EC の文化を分離する堅牢なアプローチを提供します。
Introduction
腫瘍微小環境 (TME) は、免疫細胞や平滑筋細胞、線維芽細胞ペリサイト内皮細胞 (EC) などの細胞で構成される腫瘍間質で腫瘍細胞の密接な相互作用として定義されます。これらの細胞コンパートメント間の通信は、細胞外のマトリックス、または直接細胞細胞の接触によってパラクライン因子 (例えば、血管新生因子、サイトカイン) によって駆動することができます。管間質コンパートメントは育成、腫瘍の発生や進行によって設立された特定の TME を打ち消します。
腫瘍の血管システムに接続できるは、進行・転移疾患の鍵です。容器廃棄物1,2,3の除去と同様、酸素や栄養素の配信へのアクセスを得るために主に腫瘍ができます。EC は、血管の内面を構成する、したがってこのプロセスに積極的に参加する重要な細胞成分です。それはよく知られている腫瘍血管内皮細胞 (TEC) は、対応する通常内皮細胞 (NEC) 容器水漏れしたため、血管の木の動揺階層など多くの機能によって異なるまたは減らされた数に代表されるように成熟を削減EC4にだけ緩く接続されるペリサイト/壁画セルです。
したがって、TECs、発癌の研究に貴重な携帯ツールです。TECs は、主に腫瘍の成長と進行3を促進するためと考えられました。したがって、TECs は、監視ができるバイオ センサーおよび病原性のプロセスを開始、促進、または腫瘍に対抗の識別として使用できます。さらに、5のクリニックの治療上のターゲットです。その結果、孤立した TECs と対応する同社も使えますツールとして応答または抗血管新生治療に抵抗性のメカニズムを理解します。
過去には、これらのセル6,7を分離するためのプロトコルを開発し、識別 TECs はのみから違いはありませんが、また、彼らは8から派生した TME によって違います。このアプローチにより、SPARCL1 などの抗血管新生腫瘍抑制タンパク質の分泌によって特定の手ごろで TECs 積極的に腫瘍の増殖と進行を打ち消すことができることそれ示されました。これは、TECs がひと大腸癌 (CRC)8で予後良好な TME の確立に積極的に貢献するいると示されます。
以前の研究は固体腫瘍から人間 TECs を分離ましょう。これらの研究の重要な目標は、例えば、新しい腫瘍血管内皮マーカー (TEMs)9の同定。TECs マイクロダイゼクションを変質を避けるために適用した後の即時の使用や文化でテック表現の損失の戦略。ただし、フォロー アップ研究では、このアプローチの10の深刻な欠点として壁画セルの汚染人口が識別されます。私たちの研究室で初めて人間 CRC 患者6,7から純粋な実行可能な TECs の分離を許可するプロトコルを開発します。孤立した EC 文化の高純度を確保 TECs の複数の磁気細胞選択 (MAC) のラウンドでのアプローチが選択されました。ただし、このアプローチには、文化による工芸品のリスク増加が比較的長い栽培期間 (平均 6 週間) が必要。したがって、次のステップでは、目的は手術と最初の純粋培養の収穫と栽培時間を短縮されました。この目標を達成するために初期の腫瘍の複合機械および酵素ベースの組織解離を用いた改良されたプロトコルは続いて蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え-トリプル ラベル EC の並べ替えを開発しました。これは、時間の短縮分離平均 3 週間の機能研究の増加生存率とテックと NEC の純粋培養の結果します。高い成功率を生体から純粋な実行可能なテックと NEC の文化の分離は、個別化治療レジメンの開発中にテスト患者固有の薬物のための新しい道を開くことができます。分離アプローチは、次の段落で詳しく説明します。
Protocol
分離プロセスは大学医療センター エアランゲン (#159_15 B、TuMiC 研究) 倫理委員会によって承認されています。患者の選択基準は次のとおり: CRC、UICC のない術前治療、炎症性腸疾患の既往のない - IV 段階します。
1. 手術と組織の単一細胞の分離のための準備
- CRC 患者から手術検体を採取 (癌組織 > 0.5 g、中央非壊死部; 正常な大腸組織 > 腫瘍部位から遠い 10 cm)。
- 得られた組織の部分が大抵 < 癌、1 g ですが > 通常のコロン 1 g。もし作品 > さらにティッシュの処理の新鮮なメスを使用して複数の 1 g 個に分割され、1 g が得られます。
注: 腫瘍組織部分が発症から 0.5 g 以下、分離通常失敗します。 - 収集新鮮に冷たいハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) ペニシリン/ストレプトマイシン/amphothericin B を添加した氷の 40 mL の滅菌鉗子を使用して組織の部分が固定されていない (1 %hbss-ペン/連鎖球菌/ampho) 50 mL 遠心チューブ内に迅速に転送して、実験室。
注: 結腸組織は、細菌/真菌発症からの頻繁に非常に汚染されています。分離の全体の手順中にペン/連鎖球菌/ampho は、汚染微生物を排除するためにすべてのソリューションに追加する必要があります。 - 少なくとも 4 回 40 mL 氷で各組織の部分を洗浄冷たい HBSS-ペン/連鎖球菌/ampho (手順 1.3 参照) 50 mL 遠沈管滅菌鉗子を使用して次のチューブに 1 つ遠心分離機管から順次組織部分を移すようにで。
- 70% エタノールで各ステップ後きれいな鉗子。
- 癌と正常の大腸組織部分別鉗子を使用します。
- すべての組織の部分の重量を量る。
注: は、計量のスケールに直接組織部分を入れてはいけません。洗浄後、組織の部分に入る前に、と後に組織を含む最後の遠心管の重量を量る。減算して個々 の組織の部分の重量を計算します。
2. 単一細胞懸濁液の生成
注: すべての回でしっとり組織を維持することをお勧めします。
- それが存在する場合は、滅菌鉗子を用いた無菌細胞培養シャーレの組織部分を転送することによって、手術標本から接続されている脂肪、その他の非腫瘍組織または潜在的壊死部分を削除します。
- HBSS-ペン/連鎖球菌/ampho の 3-5 mL を追加してすべての回でしっとりティッシュの部分を保ちます。
- 新鮮な滅菌メス (図 1) を使用して組織の部分をトリミングします。組織識別が明確でない場合は、病理医を参照してください。
- 残りの組織を細かくミンチ (約 2 × 2 × 2 mm3) 湾曲した刃を持つ新鮮なメスを使用します。事前に予め温めておいた (37 ° C) 細胞培養液 (Dulbecco´s 改変イーグル培地 [DMEM] 基礎培地) 製造元によると満ちて組織解離チューブ (たとえば、gentleMACS C 管) に滅菌ピンセットでティッシュ部分を転送します。指示に従います。
注: ロッキング ツールのようなメスを使用しようとします。組織の損傷を避けるために、細胞を押さないようにしてください。 - ダイジェスト/分離プログラム"37C_h_TDK_1"、manufacturer´s、次の命令を使用して人間のティッシュの腫瘍解離キットとの組み合わせで (gentleMACS Octo 発生器) のような組織の発生器を使用して組織の作品。
- 常温 (RT) 300 × g で 1 分間解離チューブを遠心します。
- 予め温めておいた (37 ° C) で 0.5% ウシ胎児血清 (FBS) (DMEM-低) 血清ピペットを使用して各管に DMEM の 10 mL を追加し、セルをピペッティングにより 50 mL 遠心管の上にセル ストレーナー (100 μ m 孔サイズ) を使用して細胞懸濁液をフィルタ リングフィルターの上に懸濁液。
- 血清ピペットによって各 MAC 管に再度 DMEM 低の 10 mL を追加し、残りのセルを 50 mL 遠心管の上にセル ストレーナーに転送します。
- 追加の 10 mL の血清ピペットを使用して低 DMEM 培地で一度セル ストレーナーを洗浄します。
- 常温 300 x g で 7 分の細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します。
- 予め温めておいた内皮細胞基本培地 (EBM)-2 の 5 mL の細胞を再懸濁します-微小血管 (MV) 培 (ロンザ) ペン/連鎖球菌/ampho 同じ 50 mL 遠心管中で。
- 1.5% ゼラチン リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5% CO2と 37 ° c で一晩プレコート T-25 細胞培養用フラスコでのプレート細胞懸濁液。
- 37 ° C、5% CO2で 24 時間のセルを孵化させなさい、慎重に約 5 mL の PBS、セル 2 回を洗浄し、新鮮な培地 5 mL を加えます。
- 中更新の 48 h 間隔で 80-90% の confluency (通常 5-7 日) まで 37 ° C および 5% の CO2の細胞を栽培してください。
3. 血管内皮細胞の FACS 並べ替え
注: は、例えば1 つの試薬で細胞の培養を汚損プロシージャを制限することによって、任意の時点で細胞を失うことを避けるために試み。
- Accutase (約 10 分)、1 mL でセルを外し、予め温めておいた (37 ° C) EBM 2 MV の中の 4 つの mL を追加します。
- デバイス (範囲 10-25 μ m) を数える自動細胞を使用して細胞数を決定します。
- RT で 250 x g と 4 分のための細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します。
- 予め温めておいた FACS バッファー内の細胞を再懸濁します (2.5% ウシ血清アルブミン [BSA] 5 mM EDTA pH 8.0、10 μ M 1 × PBS Y-27632) 細胞数 (5 x 106/mL) によると。
- FACS 染色抗体細胞数/FACS バッファー量に応じて追加: CD31 FITC (100 μ L/mL = 1/10)、CD144/血管内皮 (VE) - カドヘリン - PE (100 μ L/mL = 1/10), CD105 APC (25 μ L/mL = 1/40)、ミックス、光から保護された RT で 7 分間インキュベート軽くフリックし、(15 分の合計のインキュベーション時間) の別の 8 分間インキュベートします。
- 血清ピペットを使用してラベルの付いたセル懸濁液 2 mL の FACS バッファーを追加します。
- RT で 250 x g で 4 分間遠心し、上清を破棄します。
- FACS バッファーの 2 mL を追加して 2 回を洗って RT で 250 x g で 4 分間その後遠心分離を行うし、上澄みを廃棄します。
- 予め温めておいた EBM-2-MV-ペン/連鎖球菌/ampho の 500 μ L のセルおよび FACS 並べ替え楽器に転送細胞を再懸濁します。
- 血管内皮細胞は、FACS 装置の冷却される場合すぐに並べ替えのプロセス中に死んでしまいます。したがって、RT で血管内皮細胞の選別を行い、集められたセルを 37 ° C の定温器の後にすぐに転送。
注: FACS 装置は通常生殖不能!
- 血管内皮細胞は、FACS 装置の冷却される場合すぐに並べ替えのプロセス中に死んでしまいます。したがって、RT で血管内皮細胞の選別を行い、集められたセルを 37 ° C の定温器の後にすぐに転送。
- 細胞培養ディッシュ (例えば1.5% ゼラチン PBS で一晩プレコート 24 ウェル プレート) に直接並べ替え/収集トリプル陽性細胞は、予め温めておいた新鮮な媒体 (EBM-2-MV-ペン/連鎖球菌/ampho) の 0.5 mL でいっぱい。
メモ: は、顕微鏡を使用して並べ替え後細胞懸濁液を確認します。セルを一緒にクラスター化場合、は、ゆっくりとそれらを混合または媒体の追加によって細胞培養皿でもセル分布を取得を試みます。 - 中更新の 48 h 間隔で 90-100% の confluency まで細胞を育成し、細胞を目的のカルチャ皿サイズに拡張 (24 ウェル プレート → 12 ウェル プレート → 3.5 cm 皿 → T-25 T-75)。
4. 収穫と純粋な内皮細胞のキャラクタリゼーション
- 90-100% の confluency に細胞を収穫し、(例えば、 FACS 細胞化学、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) や血管内皮細胞機能の試金7,8) 適切な方法でそれらを特徴付けます。
- どちらの評価方法の選択と隔離されたセルを分析します。
Representative Results
NEC と後続 CD31/CD105/VE カドヘリン-駆動 FACS の並べ替えに続いて結合された機械/酵素組織解離によって人間の CRC からテックの分離の説明ここで (図 1A)。このプロトコルは、7つ前までの MAC ベースのプロトコルと比較すると純粋な実行可能な内皮細胞の最初の収穫まで時間短縮ウィンドウと改良されたプロトコルを表します。
次の手順を使用して、NEC とテックだった人間 CRC から分離された: (1) 複合機械および酵素組織解離法による単一細胞懸濁液の生成と 80-90% の confluency (図 1)、これらのセルの成長 (2) トリプル EC のラベリングCD31/CD105/VE カドヘリン螢光色素結合抗体、およびそれぞれのトリプル陽性細胞 (図 2A) の (3) FACS ソートします。注記のうち、重要なステップの分離のプロシージャの成功と、細胞はすぐに対象手術標本隔離プロシージャ (単一細胞懸濁液の生成 < 切除後 1 時間)。FACS-並べ替え、12,500 テックの平均を使用して (n = 12) 17,800 と NEC (n = 12、図 2B、左) 隔離されかねない 3.6 の平均と (図 2B、右) 合計セル人口の 5.6% を表します。その後、セルは T-75 (通路 1 と呼ばれる) と収穫またはさらに処理の分析まで拡大されました。以前の MAC ベースのプロトコルを使用して、注記の 49.6% の平均分離成功を達成した (n = n から 58 の純粋なテクス = 117 患者8) 純粋な EC と文化利用できる平均で手術後 6 週間。ここで記述されている新しい FACS ベースのプロトコルを使用して、最初の純粋な EC 文化得られた平均 62.1% の分離成功率と手術後 3 週間 (n = 41 純粋な EC 文化から n = 66 単一細胞懸濁液 FACS 並べ替えを受ける)。したがって、12.5% の分離率の増加は、3 週間に 6 から栽培時間の減少と並行して達成されました。栽培時のこの減少は向上細胞生存率につながったし、確立された文化の潜在的なカルチャ依存の遺物の誘導に露出の少ないを伴って寿命を延長します。
CD31 会 (図 3A) まず EC 純度のキャラクタリゼーションを行った。文化の CD31 陰性細胞 (図 3Aテック、NEC) を欠いているなら、彼らは逆のトランスクリプションの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (RT-qPCR) (図 3B) によって入力する詳細セルを受けた。平滑筋細胞・線維芽細胞 (デスミン) 上皮細胞 (サイトケラチン [CK の]-20)、白血球 (CD45) EC (CD31、CD105、VE カドヘリン、フォン ・ ヴィレブランド因子 [vWF]) の細胞型特異的プライマーが使用された (図 3B)。この qPCR ベースのセルを入力すると、0.1 の範囲の他のセルによって EC 文化の潜在的な汚染 2%、細胞の種類に応じてを使用すると、検出された8があります。
特に、我々 は以前彼らの対応する NEC 文化7と比較してテック文化の vWF 蛋白質の表現の優遇の損失を報告しました。新しく設立された隔離のプロトコルと所見でした (図 3C、意味 Ct 損失 NEC テック 0.687、 p = = 0.173、対応のある t 検定)。文化は、これらの品質管理に合格したマイコ プラズマ感染の検査し、後さらに実験に使用されます。
図 1: 純粋な内皮細胞は FACS 並べ替えによって人間の通常のコロンと CRC から分離できます。(A) EC 分離プロセスの必須の手順のフローチャート。(B) 脂肪組織 (黄)、その他の非腫瘍部分または潜在的壊死部分 (ブラウン) 手術標本 (左と中央のパネル) から除去し、腫瘍は 2-3 mm 側組織解離 (前のキューブに崩壊しました。右側のパネル)。(C) 単一細胞懸濁液は、組織解離 (左側のパネル) だった細胞培養皿で 24 時間培養した後に取得されます。その後、非付着性のセル PBS (中央のパネル) を使用して穏やかな洗浄により除去し、細胞の FACS 並べ替えする前に 80-90% の confluency に栽培した (右側のパネル)。(C) の下のパネルの画像は、位相差顕微鏡によって買収されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 単一細胞懸濁液の 3.6 5.6% の平均人間の CRC 患者から分離された、FACS によって並べ替えられていたトリプル プラス理事会(A) NEC とテックだったアンチ CD31-CD105 と - VE カドヘリン抗体と細胞のトリプル ラベリングを使用して FACS 並べ替え。12,500 TECs の (B) の平均 (n = 12)、17,800 で (n = 12) 人間の通常のコロンや並べ替えを使用して FACS-(CD31、CD105、VE カドヘリン陽性細胞、左右パネル)、平均 3.6 と合計セル値の 5.6% (右側のパネル) を表す CRC から分離することができます人口を採用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: NEC と人間 CRC からテック エクスプレス典型的な血管内皮細胞マーカー 。通常大腸血管内皮細胞 (NEC、n = 10) と腫瘍血管内皮細胞 (テック、n = 10) 人間の CRC からは CD31 (EC マーカー)-、CD105 (EC マーカー)-、VE カドヘリン (EC マーカー)-、vWF (EC マーカー) - 正と CK20 (CRC 細胞マーカー)-、デスミン (線維芽細胞/SMC マーカー)-、CD45 (白血球マーカー)-負の (A) CD31-免疫細胞化学によって決定される (肯定的な細胞 = 赤) と (B) RT qPCR (破線以下のデータ ポイントが否定する検出のサンプル)。(C) vWF は、同じ患者から対応するテック/NEC サンプル Rt-qpcr によって決定される式。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
主に、3 つの方法は人間の固体組織、すなわち (1) 免疫強化、レーザーマイクロダイ セクション (2) レーザー、および (3) EC の端数の FACS 並べ替えから純粋な実行可能なので、TECs を分離するため、これまでに採用されています。ほとんどの出版物の機械的な崩壊によって単一細胞懸濁液の生成後細胞の免疫強化は使用される11,12,13だったたとえば、免疫浄化のひと皮膚微小血管 EC (HDMEC) E セレクチン抗体による腫瘍壊死因子 (TNF) の後-新生児包皮13から α 治療は組織によって人間の EC 神経膠腫からの分離報告されていますダイジェスト、パーコールと反-CD31/CD105 と VE カドヘリン抗体12を使用して選択または人間からアンチ CD105 抗体による癌11。マイクロダイゼクションまたは FACS 並べ替えを採用するプロトコルはそれほど頻繁に報告されています。たとえば、潜在的な汎腫瘍を識別するために EC における血管内皮細胞マーカー (TEMs) から派生したひと大腸癌細胞の解析と解剖9の直後に、レーザ切断が使用されました。FACS 並べ替えアンチ CD31 抗体を用いて実証した EC 画分を分離するため胚性未分化のヒトから幹細胞14。
これらのアプローチは、異なる長所と短所を考慮する必要があります。免疫ベースのアプローチの利点は、精巧な装置は必要ありません、選択範囲は、いつでも行うことができるし、細胞の濃縮は、FACS 並べ替えと比較して高速 (約 15 分) (約 1 時間)。時間の長い期間のためのマトリックスの欠如は、EC のアノイーキスによる細胞死を引き起こす可能性があります。したがって、FACS バッファーに rho キナーゼ阻害剤 Y-27632 の添加は、細胞のアノイーキス15を防ぐために採用されました。
免疫強化の欠点は、複数回選択の 99% 以上の純度を達成するために必要なことです。また、濃縮間細胞培養、細胞回復支援文化による工芸品文化の年齢を増加するために必要。レーザーマイクロダイ セクションは細胞ができるという利点を使用すぐに文化による工芸品を低減、隣接組織エリア10から細胞による汚染のリスクが含まれています。さらに、すべての研究室では、レーザーマイクロダイ セクションは確立されません。FACS 並べ替えベースのアプローチの短所を含める、レーザーマイクロダイ セクション、機器は複雑で、コストがかかることに似ています。したがって、この装置がアクセスできない、いつでも。どこ興味の組織の可用性が丁度計画できない、臨床の現場でさらに不利な点を追加このします。
ただし、FACS 並べ替えの主な利点は、EC 分数が並列で複数の抗体によるラベル付けできます。したがって、高純度を保障する厳しいゲート戦略を採用できます。経験に基づき、EC の端数の並べ替えが必要だった、以前の MAC ベースのプロトコル選択を複数回が採用していたのとは対照的。これは、6 週間 (MAC アプローチ) 分析の長期の時間ウィンドウを有効にする改善された細胞生存率の結果、FACS アプローチの 3 週間前から純度まで大幅に削減栽培時間につながった。最後に、FACS 並べ替えベースの戦略を使用して、全体的な分離成功率の改善かもしれない (12.5% 増) を達成。結論としては、FACS 並べ替え並行戦略採用 3 抗体結合機械および酵素組織分解による組織ダイジェスト TECs の隔離のための選択の方法としてこのプロトコルを確立できる多くの利点を持っていた後ベースひと大腸癌および大腸からで。
Disclosures
著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。
Acknowledgments
我々 はキリスト教 Flierl、カーチャ ペター、クリスティーナ ・ Schnürer (すべて分子の部門および実験的手術)、Uwe Appelt に感謝 (コア単位 FACS 並べ替え) マイケル · ムロズとサイモン Völkl (コア単位 Immunomonitoring FACS) の優秀なテクニカル サポート。この仕事は大学医療センター エアランゲン、ドイツ研究振興協会に、臨床研究 (IZKF) のための EN/ms 学際センターの補助金によって支えられた (DFG: 2438、SP2 の) とルッツ 【 ロバート ・ Pfleger 財団の助成によりドイツ研究振興協会から MS に授与された補助金によってと同様、VSS に [DFG: KFO257 (サブ ・ プロジェクト 4) の SFB 796 (サブプロジェクト B9)]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS 1x | Gibco by Life Technologies | 14175-053 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| amphotericin B | Gibco by Life Technologies | 15290-026 | |
| Scalpels, disposable | Feather | No. 23 | |
| gentleMACS octo dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| human tumor dissociation kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| DMEM | Gibco by Life Technologies | 21969-035 | |
| EGM-2-MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Cell strainer, 100 µm | Falcon | 352360 | |
| StemPro Accutase | Gibco by Life Technologies | A11105-01 | |
| Cell counter, automated | Coulter Counter | Z1 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| CD31-FITC | BD Pharmingen | 555445 | |
| CD144/VE-cadherin-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| FACS-Sorting device | Beckman Coulter | MoFlo XDP |
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