ट्यूमर endothelial कोशिकाओं ट्यूमर microenvironment के महत्वपूर्ण निर्धारकों और रोग के पाठ्यक्रम हैं । यहां, मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा और सामांय बृहदांत्र से शुद्ध और व्यवहार्य endothelial कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल के लिए दवा परीक्षण और रोगजनन अनुसंधान में इस्तेमाल किया जाएगा वर्णित है ।
प्राथमिक मानव कार्सिनोमा से अलग कोशिकाओं मूल्यवान उपकरण रोगजनकों रोग के विकास और प्रगति के लिए योगदान तंत्र की पहचान कर रहे हैं । विशेष रूप से, endothelial कोशिकाओं (ईसी) वाहिकाओं की भीतरी सतह का गठन, सीधे ऑक्सीजन वितरण, पोषक तत्वों की आपूर्ति में भाग लेने, और अपशिष्ट उत्पादों को हटाने के लिए और ट्यूमर से, और कर रहे है जिससे ट्यूमर के संविधान में प्रमुखता से शामिल microenvironment (टीएमई) । ट्यूमर endothelial कोशिकाओं (TECs) ट्यूमर और stromal कोशिकाओं के बीच संचार द्वारा स्थापित intratumoral microenvironment के सेलुलर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । TECs भी चिकित्सा के लक्ष्य के रूप में सेवा करते हैं । तदनुसार, संस्कृति में इन कोशिकाओं की प्रतिक्रिया या विरोधी angiogenic उपचार के लिए प्रतिरोध के तंत्र पर अध्ययन की अनुमति । हाल ही में, यह पाया गया कि TECs मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा (सीआरसी) से अलग स्मृति प्रदर्शन विशिष्ट टीएमई वे से प्राप्त किए गए के आधार पर प्रभाव की तरह । इसके अलावा, इन TECs सक्रिय रूप से विभिंन कारकों के स्राव द्वारा एक विशिष्ट टीएमई की स्थापना के लिए योगदान करते हैं । उदाहरण के लिए, एक prognostically अनुकूल Th1-टीएमई में TECs विरोधी angiogenic ट्यूमर-दमन कारक स्रावित प्रोटीन, अम्लीय और cysteine में अमीर-1 की तरह (SPARCL1) । SPARCL1 पोत homeostasis को नियंत्रित करता है और ट्यूमर सेल प्रसार और प्रवास को रोकता है । इसलिए, शुद्ध, व्यवहार्य मानव ठोस ट्यूमर से अलग TECs की संस्कृतियों tumorigenesis में संवहनी प्रणाली की भूमिका पर कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं । यहां, एक नया अप करने की तारीख सामांय बृहदांत्र से प्राथमिक चुनाव आयोग के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सीआरसी वर्णित है । तकनीक यांत्रिक और एंजाइमी ऊतक पाचन, immunolabeling, और प्रतिदीप्ति सक्रिय कोशिका छँटाई (FACS)-ट्रिपल पॉजिटिव कोशिकाओं (CD31, VE-cadherin, CD105) की छंटाई पर आधारित है । इस प्रोटोकॉल के साथ, व्यवहार्य टेक या सामांय endothelial सेल (पूर्वोत्तर क्षेत्र परिषद) संस्कृतियों ६२.१२% की सफलता की दर के साथ बृहदांत्र ऊतकों से अलग किया जा सकता है जब FACS के अधीन-छंटाई (41 66 ऊतक नमूनों से शुद्ध ईसी संस्कृतियों) । तदनुसार, इस प्रोटोकॉल सामांय बृहदांत्र और सीआरसी से मानव चुनाव आयोग संस्कृतियों को अलग करने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करता है ।
ट्यूमर microenvironment (टीएमई) ट्यूमर स्ट्रोमा, जो कोशिकाओं के endothelial कोशिकाओं (ईसी), pericytes, fibroblasts, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में शामिल है के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के एक करीबी बातचीत के रूप में परिभाषित किया गया है । इन सेलुलर डिब्बों के बीच संचार paracrine कारकों (जैसे, angiogenic वृद्धि कारकों, साइटोकिंस), extracellular मैट्रिक्स, या सीधे सेल सेल से संपर्क द्वारा संचालित किया जा सकता है । stromal डिब्बे को बढ़ावा या ट्यूमर दीक्षा या प्रगति प्रतिक्रिया, विशिष्ट स्थापित टीएमई के आधार पर हो सकता है ।
एक ट्यूमर की क्षमता पोत प्रणाली के साथ कनेक्ट करने के लिए प्रगति और रोग के मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है । पोत प्रणाली ट्यूमर मुख्य रूप से ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के वितरण के रूप में अच्छी तरह से अपशिष्ट उत्पादों1,2,3को हटाने के लिए पहुंच प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है । चुनाव आयोग के जहाजों की भीतरी सतह का गठन, और इसलिए महत्वपूर्ण सेलुलर घटक है कि सक्रिय रूप से इस प्रक्रिया में भाग लेते हैं । यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि ट्यूमर endothelial कोशिकाओं (टेक) उनके इसी सामांय endothelial कोशिकाओं को अलग कर रहे है (परिषद) कई सुविधाओं के द्वारा इस तरह के संवहनी पेड़, पोत leakiness, या की कम संख्या के रूप में उदाहरण के रूप में कम परिपक्वता के परेशान पदानुक्रम pericytes/भित्ति कोशिकाओं है कि केवल ढीला चुनाव आयोग से जुड़ी4।
इसलिए, TECs कैंसरजनन अध्ययन करने के लिए मूल्यवान सेलुलर उपकरण हैं । TECs मुख्य रूप से ट्यूमर विकास और प्रगति3को बढ़ावा देने के लिए विचार किया गया । इस प्रकार, TECs के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि निगरानी और रोगजनक प्रक्रियाओं की पहचान की अनुमति है कि आरंभ, पालक, या प्रतिक्रिया tumorigenesis । इसके अलावा, वे क्लिनिक5में चिकित्सीय लक्ष्य हैं । नतीजतन, पृथक TECs और इसी एनईसीएस भी उपकरणों के लिए प्रतिक्रिया या विरोधी angiogenic उपचार के लिए प्रतिरोध के तंत्र को समझने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
अतीत में, हम एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए इन कोशिकाओं को अलग6,7 और पहचान की है कि TECs एनईसीएस से ही अलग नहीं हैं, लेकिन यह भी टीएमई वे8से प्राप्त किए गए थे पर निर्भर करता है एक दूसरे से अलग । इस दृष्टिकोण के माध्यम से, यह दिखाया गया है कि कुछ TMEs में TECs सक्रिय रूप से SPARCL1 जैसे विरोधी angiogenic ट्यूमर दमन प्रोटीन के स्राव द्वारा ट्यूमर के विकास और प्रगति को प्रभावहीन कर सकते हैं । यह संकेत दिया कि TECs सक्रिय रूप से मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा (सीआरसी)8में एक prognostically अनुकूल टीएमई की स्थापना में योगदान दे रहे हैं ।
पिछला अध्ययन ठोस ट्यूमर से मानव TECs को अलग करने का प्रयास किया । इन अध्ययनों का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य था, जैसे, नए ट्यूमर endothelial सेल मार्करों (TEMs)9की पहचान । लेजर microdissection के बाद TECs के तत्काल उपयोग की रणनीति में परिवर्तन या संस्कृति में टेक phenotype के नुकसान से बचने के लिए लागू किया गया था । हालांकि, अनुवर्ती अध्ययन के इस दृष्टिकोण के एक गंभीर खामी के रूप में भित्ति कोशिकाओं की एक प्रदूषित जनसंख्या की पहचान10। हमारी प्रयोगशाला पहले एक प्रोटोकॉल है कि शुद्ध के अलगाव की अनुमति विकसित करने के लिए किया गया था, मानव सीआरसी के रोगियों से व्यवहार्य TECs6,7। TECs के कई चुंबकीय सेल चयन (एमएसीएस) दौर के साथ एक दृष्टिकोण है कि अलग ईसी संस्कृतियों की उच्च शुद्धता सुनिश्चित चुना गया था । हालांकि, इस दृष्टिकोण एक अपेक्षाकृत लंबी खेती की अवधि (औसत पर 6 सप्ताह), जो संस्कृति प्रेरित कलाकृतियों के जोखिम में वृद्धि की आवश्यकता है । इसलिए, अगले कदम में, उद्देश्य पहले शुद्ध संस्कृति की सर्जरी और फसल के बीच खेती के समय को कम करने के लिए किया गया था । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, एक उंनत प्रोटोकॉल प्रारंभिक ट्यूमर के एक संयुक्त यांत्रिक और एंजाइमी आधारित ऊतक पृथक्करण, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटाई (FACS)-ट्रिपल-लेबल ईसी की छंटाई, विकसित किया गया था के बाद रोजगार । यह औसत पर तीन सप्ताह के लिए अलगाव समय कम, शुद्ध टेक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए वृद्धि की व्यवहार्यता के साथ परिषद संस्कृतियों में जिसके परिणामस्वरूप । शुद्ध व्यवहार्य टेक और परिषद संस्कृतियों का अलगाव उच्च सफलता दर के साथ मानव ऊतकों से रोगी के लिए नए रास्ते खोल सकते है विशेष दवा परीक्षण व्यक्तिगत चिकित्सा परहेजों के विकास के दौरान । आइसोलेशन approach निम्न अनुच्छेदों में विस्तृत है ।
मुख्यतः, तीन विभिंन तरीकों से नियोजित किया गया है इस प्रकार अभी तक के लिए शुद्ध और व्यवहार्य एनईसीएस और TECs मानव ठोस ऊतकों से अलग है, अर्थात् (1) immunomagnetic संवर्धन, (2) लेजर microdissection, और (3) FACS-ईसी अंश की छंटाई । अधिकांश प्रकाशनों में, यांत्रिक विघटन द्वारा एक एकल कोशिका निलंबन के बाद की कोशिकाओं के immunomagnetic संवर्धन11,12,13का उपयोग किया गया था । उदाहरण के लिए, E-selectin एंटीबॉडी द्वारा मानव अधययन microvascular ईसी (HDMEC) का immunomagnetic शुद्धिकरण ट्यूमर परिगलन कारक के बाद (TNF)-नवजात चमड़ियों से α उपचार13 ऊतक द्वारा तंत्रिकाबंधार्बुद से मानव चुनाव आयोग के अलगाव के लिए सूचित किया गया है डाइजेस्ट, percoll ढाल, और चयन विरोधी CD31/CD105 और VE-cadherin-एंटीबॉडी12, या विरोधी द्वारा मानव स्तन कार्सिनोमा11से CD105 एंटीबॉडी का उपयोग कर । लेजर microdissection या FACS-छंटाई कार्यरत प्रोटोकॉल कम बार रिपोर्ट किया गया है । लेजर microdissection इस्तेमाल किया गया था, उदाहरण के लिए, संभावित पैन-ट्यूमर endothelial सेल मार्करों (TEMs) की पहचान करने के लिए तुरंत विच्छेदन9के बाद कोशिकाओं के विश्लेषण के साथ मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा से व्युत्पंन । FACS-विरोधी CD31-एंटीबॉडी का उपयोग कर छंटाई सफलतापूर्वक विभेदित मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं14से ईसी अंश के अलगाव के लिए प्रदर्शन किया गया था ।
इन तरीकों अलग फायदे और नुकसान है कि विचार किया जाना है । immunomagnetic के लिए लाभ-दृष्टिकोण आधारित है कि कोई व्यापक उपकरणों की आवश्यकता है, चयन किसी भी समय आयोजित किया जा सकता है, और सेल संवर्धन तेजी से (लगभग 15 मिनट) के रूप में FACS की तुलना में (लगभग 1 ज) छंटाई । समय की एक लंबी अवधि के लिए मैट्रिक्स की कमी anoikis द्वारा चुनाव आयोग के सेल मौत पैदा कर सकता है । इसलिए, FACS बफ़र के लिए rho कळेनासे अवरोधक Y-२७६३२ के अलावा सेल anoikis15को रोकने के लिए नियोजित किया गया था ।
immunomagnetic संवर्धन के नुकसान है कि चयन के कई दौर के लिए 99% से ऊपर शुद्धता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, संवर्धन के बीच सेल खेती सेल वसूली, जो संस्कृति प्रेरित कलाकृतियों का समर्थन संस्कृतियों की उंर बढ़ जाती है के लिए आवश्यक है । लेजर microdissection लाभ है कि कोशिकाओं को तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है जो संस्कृति प्रेरित कलाकृतियों को कम कर देता है, लेकिन आसन्न ऊतक क्षेत्रों से कोशिकाओं द्वारा संदूषण के जोखिम में शामिल10. इसके अलावा, microdissection हर प्रयोगशाला में स्थापित नहीं है । FACS के नुकसान-छंटाई आधारित दृष्टिकोण में शामिल हैं, लेजर microdissection के समान है, कि उपकरण विस्तृत और लागत गहन है । तदनुसार, यह उपकरण किसी भी समय सुलभ नहीं हो सकता है । एक नैदानिक सेटिंग में, जहां ब्याज के ऊतकों की उपलब्धता बिल्कुल नहीं की योजना बनाई जा सकता है, यह एक और नुकसान जोड़ सकते हैं ।
हालांकि, FACS-छंटाई के प्रमुख लाभ है कि चुनाव आयोग अंश समानांतर में एकाधिक एंटीबॉडी द्वारा लेबल किया जा सकता है । इस प्रकार, एक कड़े गेटिंग रणनीति नियोजित किया जा सकता है जो एक उच्च शुद्धता सुनिश्चित करेगा । अनुभव के आधार पर, कोई फिर से चुनाव आयोग अंश की छंटाई की आवश्यकता थी, पिछले एमएसीएस आधारित प्रोटोकॉल के विपरीत, जहां चयन के कई दौर के लिए नियोजित किया जाना था । इस FACS दृष्टिकोण में तीन सप्ताह के लिए छह सप्ताह (एमएसीएस दृष्टिकोण) से शुद्धता तक एक काफी कम खेती के समय के लिए नेतृत्व किया, एक सुधार कक्ष व्यवहार्यता विश्लेषण के एक लंबे समय तक खिड़की को सक्षम करने में जिसके परिणामस्वरूप । अंत में, FACS-छंटाई आधारित रणनीति, समग्र अलगाव सफलता दर के एक सुधार का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है (12.5% की वृद्धि हुई है) । अंत में, FACS-छँटाई आधारित संयुक्त यांत्रिक और एंजाइमी ऊतक पाचन द्वारा ऊतक पचाने के बाद समानांतर में 3 एंटीबॉडी को रोजगार रणनीति कई फायदे है कि TECs के अलगाव के लिए पसंद की विधि के रूप में इस प्रोटोकॉल की स्थापना की थी और मानव कोलोरेक्टल कार्सिनोमा और बृहदांत्र से एनईसीएस ।
The authors have nothing to disclose.
हम ईसाई Flierl, Katja Petter, क्रिस्टीना Schnürer (आणविक और प्रायोगिक सर्जरी के सभी प्रभाग), Uwe Appelt, माइकल Mroz (कोर यूनिट FACS-छंटाई) और साइमन Völkl (कोर यूनिट FACS-Immunomonitoring) उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद । यह काम विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र Erlangen के नैदानिक अनुसंधान (IZKF) के लिए अनुशासनात्मक केंद्र के एन/एमएस के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG: २४३८ के लिए, SP2) और Lutz-Stiftung, एक अनुदान द्वारा रॉबर्ट-Pfleger-Stiftung को VSS के रूप में अच्छी तरह के रूप में जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन [DFG: KFO257 (उप परियोजना 4), SFB (उप परियोजना B9) से एमएस को संमानित किया अनुदान द्वारा] ।
HBSS 1x | Gibco by Life Technologies | 14175-053 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
amphotericin B | Gibco by Life Technologies | 15290-026 | |
Scalpels, disposable | Feather | No. 23 | |
gentleMACS octo dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
gentleMACS C-tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
human tumor dissociation kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
DMEM | Gibco by Life Technologies | 21969-035 | |
EGM-2-MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
Cell strainer, 100 µm | Falcon | 352360 | |
StemPro Accutase | Gibco by Life Technologies | A11105-01 | |
Cell counter, automated | Coulter Counter | Z1 | |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
CD31-FITC | BD Pharmingen | 555445 | |
CD144/VE-cadherin-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
FACS-Sorting device | Beckman Coulter | MoFlo XDP |