Un método colorimétrico para medir el contenido de hierro en plantas

Summary

Presentamos un protocolo sencillo y fiable para medir el contenido de hierro en los tejidos de la planta usando el método colorimétrico de azul de Prusia.

Abstract

Hierro, uno de los micronutrientes más importantes en los organismos vivos, está involucrado en procesos básicos, tales como la respiración y la fotosíntesis. Contenido de hierro es más bien bajo en todos los organismos, por importe de cerca de 0.009% de peso seco en plantas. Hasta la fecha, uno de los métodos más exactos para medir la concentración de hierro en los tejidos vegetales es la espectroscopía de absorción atómica por llama. Sin embargo, este enfoque es lento y costoso y requiere un equipo específico no comúnmente en laboratorios de la planta. Por lo tanto, es necesario un método más simple, pero preciso que puede ser utilizado rutinariamente. El método colorimétrico de azul de Prusia se utiliza regularmente para hierro cualitativo tinción en secciones histológicas animales y vegetales. En este estudio, hemos adaptado el azul de Prusia, método para la medición cuantitativa de hierro en el tabaco deja. Validamos la exactitud de este método usando Espectroscopia atómica y azul de Prusia de tinción para medir contenido de hierro en las mismas muestras y encontró una regresión lineal (R² = 0.988) entre los dos procedimientos. Concluimos que el método de azul de Prusia para la medición cuantitativa de hierro en los tejidos vegetales es precisa, simple y barato. Sin embargo, la regresión lineal presentada aquí puede no ser apropiada para otras especies de plantas, debido a las interacciones potenciales entre la muestra y el reactivo. Establecimiento de una curva de regresión es así necesario para diferentes especies de plantas.

Introduction

Hierro (Fe) es un micronutriente importante en todos los organismos vivos. En las plantas, es un micronutriente esencial¹ debido a su implicación en procesos básicos, como la biosíntesis de la clorofila, la fotosíntesis y la respiración. Alta acumulación de iones de hierro libre es dañino para las células debido a las reacciones que conducen a la liberación de radicales libres que causan el estrés oxidativo de la planta. Para mantener la homeostasis del hierro dentro de la célula de la planta, los iones se almacenan en vacuolas y secuestrados en ferritins y jaulas de proteínas directamente involucradas en la homeostasis de hierro² la estructura principal de almacenamiento de hierro en todos los organismos vivos. Al mismo tiempo, la anemia por deficiencia de hierro afecta a una proporción significativa de la población humana, resultando en una creciente necesidad de planta bioenriquecimiento del contenido de Fe. Debido a las propiedades únicas de ferritina de planta, enriquecimiento de alimentos con hierro de la ferritina ofrece una prometedora estrategia para combatir este problema de la desnutrición³.

Los iones de hierro son principalmente en dos Estados de oxidación, es decir, ferrosos (divalente del Fe^{2 +} o hierro (II)) y férrico (trivalente Fe^{3 +} o hierro (III)) formas. Varias otras formas de hierro, como hierro de grupos⁴, también se encuentran en las células. Fe se almacena como óxido de hierro dentro de la célula y naturalmente hematites de formas (Fe₂O₃) y ferryhidrites ((Fe^{3 +})₂O₃•0.5 H₂O) bajo condiciones fisiológicas⁵. Los hidróxidos formados en estas reacciones, especialmente la forma férrica, tienen muy baja solubilidad. Retención de hierro por lo tanto se ve afectada por el pH de la solución y es en gran parte en estado sólido por encima de pH 5⁶.

Teniendo en cuenta la pobre solubilidad y reactividad alta de Fe, su transferencia entre órganos y tejidos de la planta debe ser asociado con moléculas quelantes adecuadas. Por otra parte, se deben controlar sus Estados redox entre las formas ferrosa y férrica¹ . Dentro de hojas, aproximadamente el 80% del hierro se encuentra en células fotosintéticas, debido a su papel esencial en el sistema de transporte de electrones, en la biosíntesis de los citocromos, clorofila y otras moléculas de hemo y en la formación de Fe-S grupos de⁷. En el caso de hierro exceso dentro de la célula, el superávit se transloca en la vacuola donde el metal se almacena en moléculas de ferritina⁸.

Hierro puede medirse en los tejidos vegetales por varios métodos, incluyendo llama absorción atómica Espectroscopia⁹ (FAAS) o análisis colorimétrico¹⁰, el primero es mucho más precisa que la segunda. FAAS es una técnica muy precisa que permite determinar la composición elemental de una muestra sobre la base de la emisión electromagnética de los elementos individuales. FAAS convierte los iones del metal en Estados atómicos de llama-calentamiento de la muestra, llevando a ion excitación y emisión de una longitud de onda específica cuando un ion dado regresa a su estado de tierra. Las emisiones de los diferentes iones se separan por un monocromador y detectadas por un sensor de absorción¹¹. FAAS así sirve cuantificar directamente las concentraciones de hierro. Sin embargo, otras técnicas para la visualización de hierro en los tejidos biológicos están disponibles. Espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS)¹² es una técnica muy precisa para medir el hierro y otros oligoelementos, pero la falta de equipamiento, tanto para la FAAS y ICP-MS, es un problema común. Por otro lado, medición de hierro con tiocianato colorimetría¹³ carece de precisión y no detectar pequeñas variaciones entre las muestras. Azul prusiano tinción^14,15,16,17 es un método indirecto basado en la reacción de ferrocianuro férrico de potasio (K₄Fe(CN)₆) con cationes de Fe, produciendo un color azul fuerte y se utiliza para la detección cualitativa de hierro en secciones histológicas de los tejidos animales y vegetales.

Hierro metálico (cero-Valente) es rara en la litosfera. La forma iónica no complejado dominante de hierro en el medio ambiente sobre todo obedece a la cantidad de oxígeno en los alrededores, con hierro ferroso, siendo relativamente más abundantes en ambientes anóxicos y hierro férrico predomina en sitios de aeróbicos. Esta última forma también es dominante en ambientes extremadamente ácidos, aunque los agentes causantes de la oxidación de hierro ferroso diferencian a menudo en un ambiente anóxico y ácido¹⁸. Cuando el hierro es solubilizado en el 4% HCl (pH 0) en un ambiente aeróbico, la mayor parte del hierro diluido existe ya que el férrico (Fe^{3 +})^19,20.

Las reacciones entre los iones de Fe y K₄Fe(CN)₆ son las siguientes:

Fe^{3 +}: FECLAS₃ + K₄Fe(CN)₆ = KFe(III)Fe(II)(CN)₆̄ + 3KCl

Fe^{2 +}: 4 FECLAS₂ + 2 K₄Fe(CN)₆ =₄(Fe(CN)₆) Fe₂ + 8 KCl

En el presente estudio, preguntamos si la coloración azul prusiano puede ser útil para medir los niveles de hierro en solución.

Inicialmente, verificó la correlación entre la concentración de Fe en la solución acuosa y la coloración azul prusiano. La concentración de Fe (como FECLAS₂, FECLAS₃ o una mezcla 1:1 de los dos) en soluciones acuosas se midió absorbancia (OD) y espectroscopia atómica después de la adición de azul de Prusia. La figura 1 muestra las curvas de regresión lineal de las mediciones obtenidas por cada método. Llegamos a la conclusión que el método de azul prusiano puede utilizarse para el análisis cuantitativo de la concentración de hierro en solución.

Figura 1: regresiones lineales entre la concentración de Fe medición por FAAS y ligera absorbancia (OD, 715 nm) obtenidos por el método de azul prusiano. Los cuadrados azules y línea representan la solución de Fe^{2 +} , la línea y cuadrados rojos representan la solución de Fe^{3 +} y los cuadrados negros y línea representan una mezcla de 1:1 entre el Fe^{2 +} y Fe^{3 +}. Se obtuvieron las siguientes regresiones: [Fe^{2 +}] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R² = 0.989; [Fe^{3 +}] = 1 + 292 x OD, r = 0.999, R² = 0.997; y [Fe^{2 + / 3 +}] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R² = 0.956. El Fe^{2 +} donante era FECLAS₂ y el Fe^{3 +} donante era FECLAS₃. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para adaptar el método colorimétrico del azul prusiano para el análisis cuantitativo del hierro de los tejidos de la planta, se midió el contenido de hierro de las cenizas de hoja de tabaco por espectroscopía de absorción atómica por llama y coloración azul prusiano. Hubo buena correlación entre los resultados de las dos técnicas.

Protocol

1. Material y condiciones de crecimiento de la planta Semillas de tabaco uno (cultivar Samsun) de semilla por maceta de 5 cm x 5 cm llenan con medio pote estándar. Coloque las macetas sobre bandejas. Crecer las plantas en un cuarto de crecimiento bajo condiciones de día largo (16/8 h luz/oscuridad) a una temperatura constante de 23 ° C. Regar con agua del grifo hasta los desagües de agua de la olla. Después de días de 50±5, iniciar tratamientos de Fe en el riego, según las concentraciones adec…

Representative Results

Cuando este protocolo se lleva a cabo correctamente, se debe conseguir excelente correlación entre los resultados obtenidos por los métodos de espectroscopia atómica y azul prusiano. Por lo tanto, el método azul prusiano puede utilizar fácilmente para obtener una medición precisa de la concentración de hierro en muestras de la planta, como se refleja en el siguiente experimento. Plantas de tabaco cultivadas como se descri…

Discussion

Medición de hierro en los tejidos vegetales es muy importante para evaluar los efectos de riego u otras condiciones ambientales. Aquí, describimos un método colorimétrico fácil y preciso para la medición de contenido de Fe en hojas de tabaco, que puede ser fácilmente adaptado a otras especies de plantas y de los tejidos.

En la optimización de las condiciones para el método colorimétrico, utilizamos un medio de pH bajo (pH < 1.0) para permitir la solubilidad del hierro. El proceso de …

Materials

Potassium Hexacyanoferrate(II)	Fisher Chemical	14459-95-1	Reagent for the Pussian Blue
Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm	Millec	SLGP033RS	Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution
Scintillation Vials	Fisherbrand	03-337-4	Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.
Disposable Syringe 10 ml	Medi-Plus	1931	Syringe used during the filtration
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	231-595-7	Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab	Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.	Tobacco cultivar used in this protocol
Glass Wool (Rock Wool)	Sigma-Aldrich	659997-17-3	Used in the procedure of burning samples in the furnace.