En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Summary

Vi presenterar en enkel och pålitlig protokoll för att mäta järnhalten i växt vävnader med metoden kolorimetriska berlinerblått.

Abstract

Järn, en av de viktigaste mikronäringsämnen i levande organismer, är involverad i grundläggande processer, såsom andning och fotosyntesen. Järnhalten är ganska låg i alla organismer, uppgående i växter till cirka 0,009% av torrvikt. Hittills är en av de mest exakta metoderna för att mäta järnkoncentrationen i växt vävnader lågan absorption atomspektroskopi. Men denna metod är tidskrävande och dyra och kräver särskild utrustning inte vanligt förekommande i växten laboratorier. Därför behövs en enklare, men korrekt metod som kan användas rutinmässigt. Metoden kolorimetriska berlinerblått används regelbundet för kvalitativa järn färgning i djur- och växtarter histologiska sektioner. I denna studie anpassade vi den Prussian Blue metod för kvantitativa mätningar av järn i tobak lämnar. Vi validerat riktigheten av denna metod som använder både atomspektroskopi och berlinerblått färgning för att mäta järnhalten i samma prover och hittade en linjär regression (R² = 0.988) mellan de två förfarandena. Vi dra slutsatsen att metoden berlinerblått för kvantitativa järn mätning i växt vävnader är exakt, enkel och billig. Den linjära regressionen som presenteras här kan dock inte lämpliga för andra växtarter, på grund av eventuella interaktioner mellan provet och reagens. Inrättandet av en regressionskurvan behövs således för olika växtarter.

Introduction

Järn (Fe) är en viktig mikronäringsämnen i alla levande organismer. I växter är det en viktig mikronäringsämnen¹ på grund av dess deltagande i grundläggande processer, såsom andning, fotosyntes och klorofyll biosyntes. Hög ansamling av fritt järn joner är skadligt att plantera celler på grund av reaktioner som leder till utsläpp av fria radikaler som orsakar oxidativ stress. För att upprätthålla järn homeostas inom cellen växt, joner lagras i vakuoler och binds inom ferritins, protein burar direkt involverade i järn homeostas² och den huvudsakliga lagringsstrukturen för järn i alla levande organismer. Samtidigt påverkar järnbristanemi en betydande andel av befolkningen, vilket resulterar i ett ökande behov av anläggningen Fe biofortification. Tack vare de unika egenskaperna hos växten ferritin erbjuder mat berikning med ferritin-järn en lovande strategi för att bekämpa problemet med undernäring³.

Järnjonerna är främst i två oxidationstal, nämligen den järnhaltiga (tvåvärda Fe^{2 +} eller järn (II)) och järnklorid (trivalent Fe^{3 +} eller järn (III)) former. Flera andra former av järn, såsom järn kluster⁴, finns också i celler. FE lagras som järnoxid inom cellen och naturligt bildar hematites (Fe₂O₃) och ferryhidrites ((Fe^{3 +})₂O₃•0.5 H₂O) under fysiologiska villkor⁵. De hydroxider bildades dessa reaktioner, särskilt den ferric formen, har mycket låg löslighet. Järn lagring är följaktligen påverkas av pH-värdet i lösningen och till stor del är en solid state över pH 5⁶.

Med tanke på den dålig löslighet och höga reaktivitet FE, måste dess överföring bland växt vävnader och organ vara associerad med lämplig kelaterande molekyler. Dessutom måste dess redox staterna mellan järn och järn (III) formulär¹ kontrolleras. Inom blad, ca 80% av järn finns i fotosyntetiska celler, på grund av dess viktiga roller i elektronen transportsystemet, i biosyntesen av subfamiljen, klorofyll och andra heme molekyler, och i bildandet av Fe-S kluster⁷. När det gäller järn överskott inom cellen, är överskottet flyttad till den vakuol där metallen lagras i ferritin molekyler⁸.

Järn kan mätas i växt vävnader genom flera metoder, inklusive flame atomic absorption spektroskopi⁹ (Fahlström) eller kolorimetriska analyser¹⁰, den förra är långt mer exakta än de senare. FAAS är en mycket noggrann teknik som gör det möjligt att bestämma elementärt sammansättningen av ett prov på grundval av elektromagnetiska utsläpp av de enskilda elementen. FAAS konverterar metalljoner till atomic stater genom lågan-uppvärmning av provet, leder till ion excitation och utsläppen av en viss våglängd när en viss Jon återgår till dess grundtillståndet. Utsläppen från de olika jonerna separeras genom en monokromator och upptäcks av en absorption sensor¹¹. FAAS serverar således att direkt beräkna halter järn. Andra tekniker för att visualisera järn i biologiska vävnader finns dock tillgängliga. Induktivt kopplad plasma-massa spektroskopi (ICP-MS)¹² är en mycket exakt teknik för mätning av järn och andra spårämnen men bristen på utrustning, både Falk och ICP-MS, är ett vanligt problem. Däremot, järn mätning av kaliumtiocyanat kolorimetri¹³ saknar precision och misslyckas att upptäcka små variationer mellan prover. Prussian blue färgning^14,15,16,17 är en indirekt metod baserad på reaktionen av järnklorid kaliumferrocyanid (K₄Fe(CN)₆) med Fe katjoner, producerar en stark blå färg, och används för kvalitativa järn upptäckt i histologiska delar av djur- och växtarter vävnader.

Metalliska (noll-valent) järn är sällsynta i litosfären. Dominerande icke-komplex jonisk form av järn i miljön styrs främst av mängden syre i omgivningen, med järn järn vara relativt rikligare i syrefria miljöer och järnklorid järn dominerar i aerob platser. Denna senare form är också dominerande i extremt sura miljöer, även om vilka smittämnen av järn järn oxidation skiljer sig ofta i anoxiska och sura omgivning¹⁸. När järn är solubilized i 4% HCl (pH 0) i aerob miljö, större delen av den utspädda järnet finns som den ferric bildar (Fe^{3 +})^19,20.

Reaktionerna mellan Fe joner och K₄Fe(CN)₆ är följande:

FE^{3 +}: FeCl₃ + K₄Fe(CN)₆ = KFe(III)Fe(II)(CN)₆¯ + 3KCl

FE^{2 +}: 4 FeCl₂ + 2 K₄Fe(CN)₆ = Fe₄(Fe(CN)₆)₂ + 8 KCl

I den aktuella studien frågade vi om Prussian blue färgning kan vara användbar för att mäta järnnivåer i lösning.

Inledningsvis verifierat vi sambandet mellan koncentrationen av Fe i vattenlösning och Prussian blue färgning. Fe (som FeCl₂, FeCl₃ eller en 1:1 blandning av två) koncentrationen i vattenlösningar mättes såväl av atomspektroskopi absorbans (OD) efter tillsats av berlinerblått. Figur 1 visar linjär regression kurvorna för mätningar som erhålls med varje metod. Vi slutsatsen att den Prussian blue metoden kan användas för kvantitativ analys av järnkoncentrationen i lösning.

Figur 1: Linjära regressioner mellan Fe koncentration mäts av FÄRM och ljusabsorbans (OD, 715 nm) erhålls genom metoden Prussian blue. De blå fyrkanter och linje representerar Fe^{2 +} lösningen, de röda fyrkanter och linjen representerar den Fe^{3 +} lösningen och de svarta rutorna och linje representerar en 1:1 blandning mellan Fe^{2 +} och Fe^{3 +}. De följande regressioner erhölls: [Fe^{2 +}] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R² = 0.989; [Fe^{3 +}] = 1 + 292 x OD, r = 0,999, R² = 0.997; och [Fe^{2 +/ 3 +}] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R² = 0.956. Fe^{2 +} givaren var FeCl₂ och Fe^{3 +} givaren var FeCl₃. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att anpassa den kolorimetriska Prussian blue metoden för kvantitativ järn analys av växt vävnader, mättes halten av järn av tobak leaf aska av lågan absorption atomspektroskopi och Prussian blue färgning. Det fanns bra samband mellan resultaten av de två teknikerna.

Protocol

1. växtskyddsmedel Material och tillväxtförutsättningar Utsäde en tobak (cultivar Samsun) utsäde per 5 x 5 cm kruka fylld med vanlig kruka mellan. Placera krukorna på brickor. Odla växterna i ett tillväxt rum villkor lång dag (16/8 h ljus/mörk) vid en konstant temperatur av 23 ° C. Vattna med kranvatten tills vatten avlopp från potten. Efter 50±5 dagar, börja Fe behandlingar i bevattning, enligt koncentrationerna som är lämpliga för experimentet. Till exempel använde vi en rad järn…

Representative Results

När detta protokoll genomförs korrekt, bör man få utmärkta korrelationen mellan resultaten av de Prussian blue och atomic spektroskopi metoderna. Därför kan metoden Prussian blue enkelt användas för att erhålla en exakt mätning av järnkoncentrationen i växtprover, som återspeglas i det följande experimentet. Tobaksplantor var odlas som beskrivs i protokollet och bevattnas med vatten som innehåller olika järnkonc…

Discussion

Järn mätning i växt vävnader är mycket viktigt för att utvärdera effekterna av bevattning eller andra miljöförhållanden. Vi beskrivit här, en enkel och noggrann kolorimetrisk metod för Fe innehåll mätning i tobaksblad, som lätt kan anpassas till andra växtarter och vävnader.

Optimera förutsättningarna för den kolorimetriska metoden, använde vi ett lågt pH medium (pH < 1,0) för att tillåta järn löslighet. Bränningen utfördes att frige alla former av järn och att sä…

Materials

Potassium Hexacyanoferrate(II)	Fisher Chemical	14459-95-1	Reagent for the Pussian Blue
Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm	Millec	SLGP033RS	Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution
Scintillation Vials	Fisherbrand	03-337-4	Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.
Disposable Syringe 10 ml	Medi-Plus	1931	Syringe used during the filtration
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	231-595-7	Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab	Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.	Tobacco cultivar used in this protocol
Glass Wool (Rock Wool)	Sigma-Aldrich	659997-17-3	Used in the procedure of burning samples in the furnace.