यहाँ हम एक एक अणु सरणी डिजिटल एलिसा परख के विकास और सत्यापन का वर्णन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो मानव नमूनों में सभी IFN-α उपप्रकारों का अति-संवेदनशील पता लगाने में सक्षम बनाता है ।
इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य के लिए एक इंटरफेरॉन (IFN) के विकास और सत्यापन का वर्णन है-α एकल अणु सरणी डिजिटल एंजाइम से जुड़े ImmunoSorbent परख (एलिसा) परख । इस प्रणाली के ठहराव मानव IFN-α प्रोटीन की अभूतपूर्व संवेदनशीलता के साथ, और IFN की अन्य प्रजातियों के लिए कोई क्रॉस-जेट के साथ सक्षम बनाता है ।
प्रोटोकॉल का पहला मुख्य चरण एंटीबॉडी पेयर का चुनाव है, जिसके बाद कैप्चर एंटीबॉडी के विकार को paramagnetic मोतियों की माला, और पता लगाना biotinylation का एंटीबॉडी. इस कदम के बाद, परख विंयास के रूप में विभिंन मानकों, डिटेक्टर एंटीबॉडी एकाग्रता, और बफर संरचना जब तक इष्टतम संवेदनशीलता हासिल की है संशोधित किया जा सकता है । अंत में, विशिष्टता और विधि के reproducibility परिणामों में विश्वास सुनिश्चित करने के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं । यहां, हम ०.६९ fg/एमएल का पता लगाने की एक सीमा के साथ एक IFN-α एकल अणु सरणी परख विकसित उच्च संबंध स्व-प्रतिरक्षित नियामक (अरे) में biallelic उत्परिवर्तनों के साथ रोगियों से पृथक एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन के कारण स्व-प्रतिरक्षित polyendocrinopathy सिंड्रोम प्रकार 1/स्व-polyendocrinopathy-कैंडिडिआसिस-ectodermal dystrophy (APS1/ महत्वपूर्ण बात यह है कि ये एंटीबॉडी सभी 13 IFN-α उपप्रकारों का पता लगाने में सक्षम है ।
यह नई पद्धति पहली बार attomolar सांद्रता पर मानव जैविक नमूनों में IFN-α प्रोटीन का पता लगाने और ठहराव की अनुमति देती है. इस तरह के एक उपकरण मानव स्वास्थ्य और रोग राज्यों में इस cytokine के स्तर की निगरानी में अत्यधिक उपयोगी हो जाएगा, सबसे विशेष रूप से संक्रमण, प्रतिरक्षा, और सूजन ।
प्रकार मैं IFNs साइटोकिंस के एक परिवार है जो एंटीवायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं उद्घोष में एक केंद्रीय भूमिका निभा रहे हैं । वे पहले इसहाक और Lindenmann ६० साल1,2 से पहले की खोज की थी और अब यह ज्ञात है कि polypeptides के इस विषम परिवार के 14 विभिंन उपवर्गों (13 IFN-α उपप्रकार और 1 IFN-β) शामिल हैं । प्रकार मैं IFNs वायरल संक्रमण की मंजूरी के लिए आवश्यक हैं, लेकिन यह भी मानव रोग राज्यों की एक किस्म की विकृति में फंसाया गया है, स्व-प्रतिरक्षित विकारों प्रणालीगत एक प्रकार ल्यूपस (SLE), किशोर dermatomyositis (JDM) सहित, और टाइप मैं interferonopathies में जो गठन प्रकार मैं पैथोलॉजी3,4,5,6,7में IFN संकेत परिणाम प्रेरित ।
प्रकार का अध्ययन मैं जैविक नमूनों में प्रोटीन का स्तर IFN एक “हस्तक्षेप पदार्थ”1,2के रूप में अपनी प्रारंभिक पहचान के बाद से चुनौती दी गई है । वर्तमान में, सैंडविच एंजाइम से जुड़े ImmunoSorbent परख (एलिसा) IFN-α प्रोटीन का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है । विशिष्ट, सरल, और तेजी से होने के बावजूद, प्रकार मैं IFN एलिसाs वर्तमान महत्वपूर्ण सीमाओं, जैसे सीमित संवेदनशीलता के रूप में । इसके अलावा, सभी IFN-α उपप्रकार की माप एकाधिक परख के उपयोग की आवश्यकता है अपने स्वयं का पता लगाने की क्षमता और संवेदनशीलता के साथ । जबकि वाणिज्यिक एलिसा है कि IFN-α के विभिंन उपप्रकार का पता लगाने, उनकी संवेदनशीलता सीमित है (१.९५ स्नातकोत्तर/एमएल, १२.५ स्नातकोत्तर/एमएल, और १२.५ स्नातकोत्तर/एमएल, क्रमशः) जो अक्सर अपर्याप्त है जैविक नमूनों में IFN-α प्रोटीन का पता लगाने के लिए । इस सीमा को दूर करने के लिए, कई जैविक प्रॉक्सी परख प्रकार मैं प्रेरित जीन अभिव्यक्ति या कार्यात्मक गतिविधि को मापने के द्वारा IFN यों तोविकसित किया गया है8,9,10,11, 12 , 13 , 14. फिर भी, इन परख IFN-α प्रोटीन का एक सीधा माप प्रदान नहीं करते ।
इस अध्ययन में, एकल अणु सरणी डिजिटल एलिसा प्रौद्योगिकी के लिए एकल IFN-α प्रोटीन अणुओं का पता लगाने के लिए एक परख विकसित किया गया था । डिजिटल एलिसा पारंपरिक एलिसा के रूप में ही बुनियादी रसायन विज्ञान का इस्तेमाल, तथापि, प्रतिक्रिया arrays में जगह लेता है ५०,००० व्यक्तिगत ४६ femtoliter आकार वेल्स15,16। एकल प्रोटीन अणुओं एंटीबॉडी-लेपित paramagnetic मोती द्वारा कब्जा कर लिया है और एक biotinylated का पता लगाने एंटीबॉडी, एक एंजाइम संयुग्मी, streptavidin-β-galactosidase (एसबीजी) के बंधन के बाद के साथ लेबल । बाद में, मोती एक fluorogenic एंजाइम सब्सट्रेट, resorufin-β-डी-galactopyranoside (RGP), के साथ एक अणु arrays में निलंबित कर रहे हैं । मात्रा प्रतिक्रिया २,०००,०००,००० बार17कम करके, फ्लोरोसेंट संकेत के एक उच्च स्थानीय एकाग्रता हासिल की है और एक अणु गिनती संभव हो, के रूप में प्रत्येक अणु एक संकेत है कि अब मज़बूती से18मापा जा सकता है उत्पंन करता है । संक्षेप में एकल अणु arrays एकल immunocomplexes गिनती और मनका (ाोएब) प्रति एंजाइमों की एक औसत संख्या का निर्धारण करने में सक्षम हैं । microwells जिसमें एक संकेत का पता चला है परमिट ठहराव/डिजिटलाईजेशन प्रोटीन अणुओं की गिनती, के रूप में वहां प्रोटीन एकाग्रता के बीच एक सीधा संबंध है और immunocomplexed-मोतियों के बीच अनुपात और मोतियों की कुल संख्या में मौजूद femtoliter-आकार कक्षों ।
Yeung एट अल. एक व्यापक पार मंच मूल्यांकन परख परिशुद्धता, संवेदनशीलता की तुलना के उद्देश्य के साथ नौ विभिंन प्रौद्योगिकियों और चार cytokine immunoassays का उपयोग कर अध्ययन किया, और विभिंन प्लेटफार्मों19भर में डेटा सहसंबंध । अध्ययन के प्रमुख निष्कर्षों में से एक यह है कि एकल अणु arrays और एकल अणु गिनती immunoassay मानव सीरम में उप के भीतर साइटोकिंस का पता लगाने के लिए सबसे अधिक संवेदनशीलता प्रस्तुत-pg/एमएल एकाग्रता रेंज । एकल अणु सरणी डिजिटल एलिसा cytokine की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है TNF-α और IL-6 Crohn की बीमारी में20, IFN-α में interferonopathy और ऑटो प्रतिरक्षा रोगियों में 7, और अलग पोस्ट-अनुवाद संशोधित रूपों सी के एक्स-सी आकृति chemokine 10 (CXCL10) क्रोनिक हेपेटाइटिस और स्वस्थ दाताओं में sitagliptin प्राप्त21,22। अन्य अनुप्रयोगों मधुमेह रेटिनोपैथी23के साथ रोगियों में rhodopsin का माप शामिल; neurofilament प्रकाश24 और amyloid के सीरम/प्लाज्मा माप के माध्यम से मस्तिष्क विकृतियों का अध्ययन-β 1-42 पेप्टाइड25, एकाधिक स्केलेरोसिस और अल्जाइमर रोग के संदर्भ में क्रमशः । एकल अणु सरणी परख भी एचआईवी वायरल जलाशय26के लक्षण वर्णन के रूप में बेहतर रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और भी डीएनए का पता लगाने के लिए27 और माइक्रो RNAs28। एकल अणु सरणी प्रौद्योगिकी का एक प्रमुख लाभ इस उच्च बहुमुखी प्रतिभा है, ब्याज की किसी भी analyte के खिलाफ एक परख के रूप में विकसित किया जा सकता है अगर एक विशिष्ट एंटीबॉडी जोड़ी उपलब्ध है । इसके अलावा, homebrew परख किट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, नए परख के विकास की अनुमति है, जो प्रोटोकॉल के नीचे एक संशोधित रूप में विस्तृत है ।
यहां, एक एक अणु सरणी परख के लिए विकास और मांयता कदम का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत किया है कि IFN-α प्रोटीन का पता लगाने के लिए बढ़ाया संवेदनशीलता में परिणाम । एकल अणु सरणी परख के लिए एंटीबॉडी अत्यधिक विशिष्ट होना चाहिए, संबंधित प्रोटीन के साथ पार जेट से परहेज (प्रजातियों यदि प्रासंगिक माना जाता विशिष्टता के साथ) । आदर्श रूप में, एक Kडी के साथ एंटीबॉडी 10 से छोटे-9 एम चुना जाना चाहिए; उच्च संबंध मजबूत बाध्यकारी सुनिश्चित करता है, एक उच्च संकेत के उत्पादन के साथ । कैनेटीक्स एंटीबॉडी-प्रतिजन बाइंडिंग के भी महत्वपूर्ण हैं, और तेजी से कश्मीरपर और धीमी गति kबंद प्रतिजन-एंटीबॉडी जटिल विधानसभा एहसान होगा । एक एंटीबॉडी जोड़ी है कि शास्त्रीय एलिसा में एक अच्छा प्रदर्शन है, 1-100 स्नातकोत्तर/एमएल का पता लगाने की सीमा (लोद) के साथ शुरू, एक अति संवेदनशील एकल अणु सरणी परख प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है । चांग और उनके सहयोगियों ने हर एक कदम पर होने वाली आणविक बातचीत की विस्तृत काइनेटिक अध्ययनों का प्रदर्शन किया, विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता की भविष्यवाणी करने के लिए18समीकरणों का एक सेट का प्रस्ताव. उंहोंने दिखाया कि एक अणु सरणी डिजिटल एलिसा एंटीबॉडी समानताएं की एक व्यापक रेंज के भीतर प्रभावी प्रतीत होता है (केडी ~ 10− 11 -10− 9 एम), साथ ही साथ कि संकेत पीढ़ी इस तरह के एंटीबॉडी की दर पर अधिक निर्भर है ।
उच्च अपनत्व एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए हम एंटीबॉडी के साथ रोगियों से अलग लाभ ले लिया स्व-प्रतिरक्षित polyendocrinopathy सिंड्रोम प्रकार 1/स्व-प्रतिरक्षित polyendocrinopathy-कैंडिडिआसिस-ectodermal dystrophy(APS1/ कारण है कि अभी तक समझ में नहीं आ रहे है के लिए, अरे की कमी व्यक्तियों के बड़े बहुमत के सभी IFN-α उपप्रकार के खिलाफ उच्च-avid एंटीबॉडी का एक मुख्य सेट विकसित29, और हम पूरक बाध्यकारी α के दो विरोधी IFN-एंटीबॉडी समानताएं क्लोन का चयन विभिंन IFN-α उपप्रकार के लिए, के रूप में आईसी५० मूल्यों का अनुमान है । एकल अणु सरणी प्रौद्योगिकी के साथ इन अद्वितीय उच्च संबंध एंटीबॉडी के संयोजन attomolar पर IFN-α के प्रत्यक्ष ठहराव (fg/एमएल) सांद्रता सक्षम होना चाहिए । इस तरह के ultrasensitive IFN-α प्रोटीन का पता लगाने के लिए विभिंन रोग सेटिंग्स में IFN प्रेरित प्रतिक्रिया के स्वभाव, विनियमन और जैविक प्रभाव की एक बेहतर समझ में योगदान देगा ।
साथ ही, हम मानव नमूनों में IFN-α प्रोटीन के प्रत्यक्ष ठहराव के लिए एक अत्यधिक reproducible, ultrasensitive एकल अणु सरणी डिजिटल एलिसा के विकास और सत्यापन का वर्णन ( 1 तालिकामें संक्षेप कदम) । परख के विकास में सबसे महत्वपूर्ण कदम में से एक एंटीबॉडी जोड़ी16का विकल्प है, कैनेटीक्स और epitope एक सफल परख के लिए महत्वपूर्ण जा रहा है बाध्यकारी के संदर्भ में विशेषताओं के साथ । यह एक ही epitope या कि कारण steric बाधा लक्ष्य युग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उपयोग से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. Polyclonal एंटीबॉडी पहचान एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ऐसी सीमाओं को दूर । यदि किसी भी कदम पर वांछित संवेदनशीलता प्राप्त नहीं है, आगे अनुकूलन संभावनाओं पर विचार किया जाना चाहिए । यह वैकल्पिक एंटीबॉडी जोड़े, प्रोटीन प्रकार (जैसे BSA < कैसिइन), पीएच (६.०-८.५), ईओण की शक्ति, बफर क्षमता (जैसे NaCl और फॉस्फेट सांद्रता), वाहक मोतियों के रूप में मापदंडों में परिवर्तन के उपयोग में शामिल हो सकते हैं, और/ मापदंडों की एक विस्तृत श्रृंखला जब एक एकल अणु सरणी परख विकसित कर अनुकूलित किया जाना है । हालांकि, कुल मिलाकर, स्थिति है कि उच्च संकेत दे: पृष्ठभूमि अनुपात और ंयूनतम LODs लोगों को पसंद कर रहे है ( चित्रा 1, चित्रा 2, और चित्रा 3देखें) ।
विशिष्टता के बारे में, IFN-α परख किसी भी अंय IFNs परीक्षण के लिए कोई क्रॉस जेट दिखाया (β, γ, λ1, λ2, ω) (चित्रा 4a) और सभी 13 IFN-α उपप्रकार (चित्रा 4b) का पता लगाने में सक्षम था । हालांकि, परख IFN-α2 उपप्रकार, (चित्रा 4b और अनुपूरक तालिका 4) के लिए एक कम अपनत्व दिखाया । दिलचस्प है, IFN-α2 (ए, बी, सी) के विभिंन वर्गों के लिए अलग संवेदनशीलता भी मनाया गया, जो अलग विनिर्माण प्रक्रियाओं या विभिंन एमिनो एसिड दृश्यों के कारण हो सकता है, के रूप में IFN-α2 उपप्रकार विभिंन वाणिज्यिक से प्राप्त किया गया आपूर्तिकर्ताओं. इस एकमात्र अपवाद के साथ, सभी IFN-α प्रजातियों बहुत ही प्रतिक्रिया दी । परख की विशिष्टता आगे विरोधी IFN-α एक क्लोन है, जो संकेत निष्प्रभाव (चित्रा 6 और अनुपूरक तालिका 6) के साथ नमूनों की पूर्व उपचार द्वारा प्रदर्शन किया गया ।
इस प्रौद्योगिकी का मुख्य लाभ में से एक है कि ब्याज की किसी भी analyte संभावित16लक्षित किया जा सकता है । इसके अलावा, विभिंन जैविक नमूनों का परीक्षण किया जा सकता है, जैसे सीरम, प्लाज्मा, मस्तिष्कमेरु द्रव, सेलुलर lysates, संस्कृति supernatants31 और यहां तक कि सांस३२। आमतौर पर, प्लाज्मा के एक 1:3 कमजोर पड़ने के लिए एक अणु सरणी विश्लेषक के संभावित कॉलेस्ट्रॉल से बचने के लिए किया जाता है । हालांकि, ब्याज की analyte प्रासंगिक जैविक नमूना में बहुत कम सांद्रता पर मौजूद हो सकता है और नमूना की उच्च सांद्रता (परख संवेदनशीलता पर निर्भर करता है)३३की आवश्यकता हो सकती है । हालांकि मल्टीप्लेक्स के लिए संभावित है, जबकि अच्छी संवेदनशीलता३४को बनाए रखने, यह एक और अधिक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया और एक ही प्रयोग के भीतर 6 से अधिक प्रोटीन को मापने के लिए परख है अभी तक३५विकसित किया जाना है ।
इस तरह कम सांद्रता पर साइटोकिंस और अंय जैविक प्रासंगिक प्रोटीन का पता लगाने और यों तो लगाता है३३,३६आवेदनों की एक पूरी नई रेंज खुल जाता है की क्षमता । यह सर्वविदित है कि कई प्रोटीन भी बहुत कम सांद्रता, जो अब तक सबसे अच्छा एलिसा३७का पता लगाने की सीमा से नीचे थे पर उनके प्रभाव डालती है । जबकि अंय immunoassay प्रौद्योगिकियों पारंपरिक एलिसा19से अधिक लाभ प्रदान करते हैं, हम यहां है कि एक अणु सरणी डिजिटल एलिसा प्रदर्शन कम एकाग्रता साइटोकिंस के ultrasensitive का पता लगाने के लिए एक reproducible और मजबूत मंच है मानव नमूने । इस तरह के रूप में, इस प्रौद्योगिकी के लिए भारी क्षमता प्रदान करता है की खोज और बेहतर रोगी प्रबंधन के रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है ।
The authors have nothing to disclose.
डीडी और YJC ANR (परियोजना IFNX, सं से समर्थन स्वीकार करते हैं । CE17001002) और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए ImmunoQure एजी । हम ब्रिजित बडेर-Meunier, Nathalia Bellon, क्रिस्टीन Bodemer, एलेक्स Belot, इसाबेल Melki, और पियरे Quartier नैदानिक नमूने प्रदान करने के लिए धंयवाद । YJC यूरोपीय अनुसंधान परिषद (GA ३०९४४९: YJC को फैलोशिप), और एक राज्य सब्सिडी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (फ्रांस) द्वारा प्रबंधित “भविष्य के लिए निवेश” कार्यक्रम के संदर्भ ANR-10-िाहु-01 असर के तहत स्वीकार किया ।
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone | eBioscience | BMS216C | |
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone | eBioscience | BMS216BK | Not an ELISA kit but bulk abs |
IFN α2c | eBioscience | BMS305 | OK |
IFN αI (17) | PBL | 11150-1 | |
IFN α2a | PBL | 11100-1 | |
IFN α2a | PeproTech | No longer available | |
IFN α2b | PBL | 11105-1 | |
IFN α1 | PBL | 11175-1 | |
IFN α4a (M1) | PBL | 11177-1 | |
IFN α4b (a4) | PBL | 11180-1 | |
IFN αB2 (a8) | PBL | 11115-1 | |
IFN αC (a10) | PBL | 11120-1 | |
IFN αD (a1) | PBL | 11125-1 | |
IFN αG (a5) | PBL | 11135-1 | |
IFN αF (a21) | PBL | 11130-1 | |
IFN αH2 (a14) | PBL | 11145-1 | |
IFN αJ1 (a7) | PBL | 11160-1 | |
IFN αK (a6) | PBL | 11165-1 | |
IFN αWA (a16) | PBL | 11190-1 | |
IFN λ1 | PeproTech | 300-02L | |
IFN λ2 | PeproTech | 300-02K | |
IFN ω | PeproTech | 300-02J | |
IFN β | PeproTech | 300-02BC | |
IFN γ | PeproTech | 300-02 | |
Anti-IFN-α ELISA | PBL | 41115.1 | |
96-well plates | Corning | 3904 | |
ISRE-Reporter | Qiagen | CCS-008L | |
Fu-GENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem | ThermoFischer Scientific | 31985062 | |
Dual-Luciferase Reporter assay | Promega | E1910 | |
Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
Spectrophotometer NanoDrop 1000 | Thermo Scientific | No longer available | |
Amicon micocentrifuge tubes – 0.5mL filtres | Merck Millipore | UFC505096 | |
Bead Conjugation Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
Non-Encoded Paramagnetic Beads | Quanterix | 101360 | |
Bead Wash Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
EDC | Fisher Scientific | 11844071 | |
Bead Blocking Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
Bead Diluent Buffer | Quanterix | 101362 | |
Detector and Sample Diluent | Quanterix | 101359 | |
Biotinylation Reaction Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
NHS-PEG4-Biotin | Fisher Scientific | 11891195 | |
diH2O | |||
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) | Thermo Scientific | 75002478 | |
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) | IKA | MS2 | |
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
1.7mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) | VWR | 521-2844 | |
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) | Eppendorf | ||
Single molecule array (Simoa) reagents | |||
SBG, Bead and Detector Barcode Labels | Quanterix | 101652 | |
15 mL Reagent Bottles | Quanterix | 102411 | |
Simoa specimen 96-well plates | Quanterix | 101457 | |
Simoa Discs | Quanterix | 100001 | |
Simoa 2.0 conductive Tips | Quanterix | 101726 | |
Simoa Cuvettes | Quanterix | 100803 | |
Simoa SBG Reagent | Quanterix | 102295 | |
Simoa RGP Reagent | Quanterix | 101736 | |
Simoa System Buffer 1 | Quanterix | 100486 | |
Simoa System Buffer 2 | Quanterix | 100487 | |
Sealing Oil | Quanterix | 100206 | |
ddH2O | |||
Simoa HD-1 Analyzer | Quanterix | 100032 | |
Technologies | |||
Single molecule array (Simoa) | Quanterix | ||
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems | Singluex |