Her præsenterer vi en protokol til at beskrive udviklingen og valideringen af et enkelt molekyle array digital ELISA assay, som gør det ultra-følsomme påvisning af alle IFN-α undertyper i menneskelige prøver.
Hovedformålet med denne protokol er at beskrive udviklingen og valideringen af et interferon (IFN)-α enkelt molekyle array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. Dette giver mulighed for kvantificering af menneskelige IFN-α protein med hidtil uset følsomhed, og ingen krydsreaktivitet for andre arter af IFN.
Det første vigtige skridt i protokollen er valget af antistof parret, efterfulgt af konjugation af capture antistof til Paramagnetiske perler, og biotinylation af detektor-antistof. Efter dette trin, kan forskellige parametre såsom assay konfiguration, detektor-antistof koncentration og buffer sammensætning ændres, indtil den optimale følsomhed er opnået. Endelig vurderes specificitet og reproducerbarhed af metoden for at sikre tillid til resultaterne. Her, udviklede vi en IFN-α enkelt molekyle array assay med en grænse på påvisning af 0.69 fg/mL ved hjælp af høj-affinitet autoantistoffer isoleret fra patienter med biallelic mutationer i den autoimmune regulator (AIRE) protein forårsager autoimmune polyendocrinopathy syndrom type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrofi (APS1/APECED). Vigtigere, aktiveret disse antistoffer registrering af alle 13 IFN-α undertyper.
Denne nye metode giver mulighed for påvisning og kvantificering af IFN-α protein i menneskelige biologiske prøver på attomolar koncentrationer for første gang. Et sådant værktøj vil være meget nyttig i kontrol af niveauerne for denne cytokin i menneskers sundhed og sygdomstilstande, de fleste især infektion, autoimmunitet og autoinflammation.
Type jeg IFNs er en familie af cytokiner, som spiller en central rolle i iscenesætte antivirale immunrespons. De blev først opdaget af Isaacs og Lindenmann 60 år siden1,2 , og det er nu kendt, at denne heterogene familie af polypeptider består af 14 forskellige underklasser (13 IFN-α undertyper og 1 IFN-β). Jeg IFNs er afgørende for regnskabsafslutningen for virale infektioner, men har også været impliceret i patologi af en række menneskelige sygdomstilstande, herunder autoimmune sygdomme systemisk lupus erythematosus (SLE), juvenil dermatomyositis (JDM), og typen Jeg interferonopathies i hvilke konstitutive type I IFN-induceret signalering-resultaterne i patologi3,4,5,6,7.
At studere type I-IFN protein niveauer i biologiske prøver har været udfordrende siden dets oprindelige identifikation som et “blande stof”1,2. I øjeblikket, er sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) den mest udbredte metode til påvisning af IFN-α protein. På trods af at være specifik, enkle og hurtige, type jeg IFN ringprøver præsentere vigtige begrænsninger, såsom begrænset følsomhed. Derudover kræver måling af alle IFN-α undertyper brug af flere assays hver med deres egen afsløring kapacitet og følsomhed. Mens der er kommercielle ringprøver, der registrerer forskellige undertyper af IFN-α, deres følsomhed er begrænset (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL og 12,5 pg/mL, henholdsvis) som er ofte utilstrækkelige til at opdage IFN-α protein i biologiske prøver. For at overvinde denne begrænsning, type flere biologiske proxy assays er blevet udviklet for at kvantificere I IFN-ved at måle induceret genekspression eller funktionelle aktivitet8,9,10,11, 12 , 13 , 14. alligevel disse assays giver ikke en direkte måling af IFN-α protein.
I denne undersøgelse, blev enkelt molekyle array digital ELISA teknologi brugt til at udvikle en analyse til påvisning af enkelt IFN-α proteinmolekyler. Digital ELISA udnytter det samme grundlæggende kemi som konventionelle ELISA, men reaktionen foregår i arrays bestående af 50.000 individuelle 46 femtoliter størrelse wells15,16. Enkelt proteinmolekyler er fanget af antistof-Paramagnetiske perler og markeret med en biotinylated detektor-antistof, efterfulgt af bindingen af et enzymkonjugat, streptavidin-β-galactosidase (SBG). Efterfølgende er perlerne suspenderet med et fluorogenic enzym-substrat, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), til enkelt-molekyle arrays. Ved faldende volumen reaktion 2 milliarder gange17, en høj lokal koncentration af fluorescerende signal er opnået og enkelt molekyle tæller blive muligt, som hvert molekyle skaber et signal, som kan være pålideligt målt18. I det væsentlige er enkelt molekyle arrays i stand til at tælle enkelt immunocomplexes og fastlæggelse af et gennemsnitligt antal enzymer pr. perle (AEB). Tælle microwells som et signal detekteres tillader kvantificering/digitalisering af proteinmolekyler, som der er en direkte sammenhæng mellem proteinkoncentration og forholdet mellem immunocomplexed-perler og et samlet antal perler findes i femtoliter-store kamre.
Yeung mfl. udført en omfattende cross-platform evalueringsundersøgelse med ni forskellige teknologier og fire cytokin immunassays med formålet at sammenligne assay præcision, følsomhed og data sammenhæng på tværs af forskellige platforme19. Et af hovedresultaterne af undersøgelsen var, at enkelt molekyle arrays og enkelt molekyle tælle immunassay præsenteret den højeste følsomhed for påvisning af cytokiner i humant serum inden for sub-pg/mL koncentrationsområde. Enkelt molekyle array digital ELISA cytokin assays er blevet brugt til at studere rollen af TNF-α og IL-6 i Crohns sygdom20, IFN-α i interferonopathy og auto-immune patienter 7, og de forskellige post-translationally ændrede former for C-X-C motiv chemokine 10 (CXCL10) i kronisk hepatitis og raske donorer modtager sitagliptin21,22. Andre anvendelser omfatter måling af rhodopsin hos patienter med diabetisk retinopati23; undersøgelse af hjernen patologier gennem serum/plasma målinger af neurofilament lys24 og amyloid-β 1-42 peptid25, i forbindelse med multipel sklerose og Alzheimers sygdom, henholdsvis. Enkelt molekyle array assays kan også bruges til forbedret patogen detektion såsom karakterisering af HIV virus reservoir26, og også til påvisning af DNA27 og micro RNA’er28. En stor fordel ved enkelt molekyle array teknologi er denne høje alsidighed, som en assay mod enhver analysand af interesse kan udvikles, hvis en bestemt antistof par er tilgængelig. Derudover er homebrew assay kits kommercielt tilgængelig, så udviklingen af nye assays, protokol som er detaljeret beskrevet i en modificeret form nedenfor.
Her, præsenteres en detaljeret beskrivelse af trinene udvikling og validering for et enkelt molekyle array assay der resulterer i øget følsomhed for IFN-α protein påvisning. Antistoffer for enkelt molekyle array assays bør være meget specifikke, undgå cross reaktivitet med relaterede proteiner (med arter specificitet i betragtning, hvis relevant). Ideelt set bør være valgt antistoffer med en KD mindre end 10-9 M; høj affinitet sikrer stærke binding, med produktion af en højere signal. Kinetik af antigen-antistof-bindingen er også vigtig, og hurtig Kpå og langsom Koff vil favorisere antigen-antistof kompleks samling. Start med et antistof-par, der har en god præstation i klassisk ELISA, med en grænse detektionsgrænsen (LOD) af 1-100 pg/mL, øger chancerne for at opnå en meget følsomme enkelt molekyle array assay. Chang og kolleger udført detaljerede kinetiske studier af Biomolekylær interaktioner forekommer ved hvert enkelt skridt, foreslår en række ligninger til at forudsige analytiske følsomhed18. De viste at enkelt molekyle array digital ELISA synes at være effektiv inden for en bred vifte af antistof tilhørsforhold (KD ~ 10−11 – 10−9 M), samt at signal generation er mere afhængige af på sats af sådanne antistoffer.
For at udnytte høj affinitet type antistoffer tog vi fordel af antistoffer isoleret fra patienter med autoimmune polyendocrinopathy syndrom 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrofi (APS1/APECED)29. Af grunde, der endnu ikke er forstået, det store flertal af AIRE-mangel enkeltpersoner udvikle et kernesæt af høj-aviditet antistoffer mod alle IFN-α undertyper29og vi valgt to anti-IFN-α antistof kloner af supplerende bindende tilhørsforhold for de forskellige IFN-α undertyper, som anslået af IC50 værdier. Kombinationen af disse unikke høj-affinitet antistoffer med enkelt molekyle array teknologi aktiveret direkte kvantificering af IFN-α på attomolar (fg/mL) koncentrationer. Sådanne ultrasensitive IFN-α protein registrering vil bidrage til en bedre forståelse af naturen, regulering og biologiske effekt af IFN-induceret response i forskellige sygdom indstillinger.
Vi beskrevet heri, udvikling og validering af et stærkt reproducerbar, ultrasensitive enkelt molekyle array digital ELISA til direkte kvantificering af IFN-α protein i menneskelige prøver (trin opsummeret i tabel 1). Et af de mest afgørende skridt i udviklingen af analysen er valget af antistof par16, med kinetik og epitop bindende er nøglen til en vellykket assay. Det er vigtigt at undgå brug af parret monoklonale antistoffer at målrette den samme epitop eller at forårsage sterisk hindring. Polyklonale antistoffer kan bruges som påvisning antistoffer til at overvinde sådanne begrænsninger. Hvis den ønskede følsomhed ikke opnås ved enhver given skridt, bør yderligere optimering muligheder overvejes. Dette kan omfatte anvendelse af alternative antistof par, ændringer i parametre såsom protein type (f.eks. BSA < kasein), pH (6.0-8,5), ionisk styrke, stødpudeevne (fx NaCl og fosfat koncentrationer), carrier perler og/eller forekomsten af overfladeaktive stoffer. En lang række parametre optimeres con ved udvikling af et enkelt molekyle array assay. Dog samlet set betingelser, der giver høj signal: baggrund nøgletal og minimal bestemmelsesgrænseværdier er dem, foretrak (Se figur 1, figur 2og figur 3).
Vedrørende specificitet, IFN-α-Analysen viste ingen cross reaktivitet for eventuelle andre IFNs testet (β, γ, λ1, λ2, ω) (figur 4a) og var i stand til at afsløre alle 13 IFN-α undertyper (figur 4b). Analysen viste imidlertid en lavere affinitet for IFN-en2 subtype, (figur 4b og supplerende tabel 4). Interessant, blev forskellige følsomheder for de forskellige klasser af IFN-en2 (a, b, c) også observeret, hvilket kan skyldes forskellige fremstillings procedurer eller forskellige aminosyre-sekvenser, som IFN-en2 undertyper blev indhentet fra forskellige kommercielle leverandører. Med denne undtagelse gav alle IFN-α arter meget lignende svar. Specificiteten af analysen blev finpudset af forbehandling af prøver med anti-IFN-α en klon, som ophævet signal (figur 6 og supplerende tabel 6).
En af de vigtigste fordele ved denne teknologi er, at enhver analysand af interesse potentielt kan være målrettet16. Derudover kan forskellige biologiske prøver testes, serum, plasma, cerebrospinalvæske, cellulære lysates, kultur analysere31 og selv ånde32. Normalt, er en 1:3 fortynding af plasma udført for at undgå potentielle tilstopning af enkelt molekyle array analyzer. Men analysand af interesse kunne være til stede ved meget lave koncentrationer i de relevante biologiske prøve og højere koncentrationer af prøven kan være nødvendig (afhængigt af assay følsomhed)33. Selv om der er potentiale for multiplexing samtidig opretholde god følsomhed34, er det en mere udfordrende proces og assays til måling af større end 6 proteiner inden for de samme eksperimenter har endnu at være udviklet35.
Evne til at detektere og kvantificere cytokiner og andre biologiske relevante proteiner ved sådanne lave koncentrationer åbner op for en helt ny vifte af applikationer33,36. Det er velkendt, at mange proteiner udøve deres virkninger selv i meget lave koncentrationer, som indtil nu lå under detektionsgrænsen for den bedste ringprøver37. Mens andre immunoassay teknologi tilbyder fordele i forhold til konventionelle ELISA19, viser vi her, enkelt molekyle array digital ELISA er reproducerbare og robust platform for den ultrasensitive påvisning af lav koncentration cytokiner i menneskelige prøver. Som sådan, tilbyder denne teknologi enorme potentiale for biomarkør opdagelse og forbedret patient forvaltning af en lang række sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
DD og YJC anerkender støtte fra ANR (projekt IFNX, ingen. CE17001002) og ImmunoQure AG til at give monoklonale antistoffer. Vi takker Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki og Pierre Quartier for at levere kliniske prøver. YJC anerkender det Europæiske Forskningsråd (GA 309449: stipendium til YJC), og statslige subsidier forvaltes af nationale forskning agentur (Frankrig) under programmet “Investeringer for the Future” forsynet med henvisning ANR-10-IAHU-01.
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone | eBioscience | BMS216C | |
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone | eBioscience | BMS216BK | Not an ELISA kit but bulk abs |
IFN α2c | eBioscience | BMS305 | OK |
IFN αI (17) | PBL | 11150-1 | |
IFN α2a | PBL | 11100-1 | |
IFN α2a | PeproTech | No longer available | |
IFN α2b | PBL | 11105-1 | |
IFN α1 | PBL | 11175-1 | |
IFN α4a (M1) | PBL | 11177-1 | |
IFN α4b (a4) | PBL | 11180-1 | |
IFN αB2 (a8) | PBL | 11115-1 | |
IFN αC (a10) | PBL | 11120-1 | |
IFN αD (a1) | PBL | 11125-1 | |
IFN αG (a5) | PBL | 11135-1 | |
IFN αF (a21) | PBL | 11130-1 | |
IFN αH2 (a14) | PBL | 11145-1 | |
IFN αJ1 (a7) | PBL | 11160-1 | |
IFN αK (a6) | PBL | 11165-1 | |
IFN αWA (a16) | PBL | 11190-1 | |
IFN λ1 | PeproTech | 300-02L | |
IFN λ2 | PeproTech | 300-02K | |
IFN ω | PeproTech | 300-02J | |
IFN β | PeproTech | 300-02BC | |
IFN γ | PeproTech | 300-02 | |
Anti-IFN-α ELISA | PBL | 41115.1 | |
96-well plates | Corning | 3904 | |
ISRE-Reporter | Qiagen | CCS-008L | |
Fu-GENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem | ThermoFischer Scientific | 31985062 | |
Dual-Luciferase Reporter assay | Promega | E1910 | |
Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
Spectrophotometer NanoDrop 1000 | Thermo Scientific | No longer available | |
Amicon micocentrifuge tubes – 0.5mL filtres | Merck Millipore | UFC505096 | |
Bead Conjugation Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
Non-Encoded Paramagnetic Beads | Quanterix | 101360 | |
Bead Wash Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
EDC | Fisher Scientific | 11844071 | |
Bead Blocking Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
Bead Diluent Buffer | Quanterix | 101362 | |
Detector and Sample Diluent | Quanterix | 101359 | |
Biotinylation Reaction Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
NHS-PEG4-Biotin | Fisher Scientific | 11891195 | |
diH2O | |||
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) | Thermo Scientific | 75002478 | |
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) | IKA | MS2 | |
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
1.7mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) | VWR | 521-2844 | |
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) | Eppendorf | ||
Single molecule array (Simoa) reagents | |||
SBG, Bead and Detector Barcode Labels | Quanterix | 101652 | |
15 mL Reagent Bottles | Quanterix | 102411 | |
Simoa specimen 96-well plates | Quanterix | 101457 | |
Simoa Discs | Quanterix | 100001 | |
Simoa 2.0 conductive Tips | Quanterix | 101726 | |
Simoa Cuvettes | Quanterix | 100803 | |
Simoa SBG Reagent | Quanterix | 102295 | |
Simoa RGP Reagent | Quanterix | 101736 | |
Simoa System Buffer 1 | Quanterix | 100486 | |
Simoa System Buffer 2 | Quanterix | 100487 | |
Sealing Oil | Quanterix | 100206 | |
ddH2O | |||
Simoa HD-1 Analyzer | Quanterix | 100032 | |
Technologies | |||
Single molecule array (Simoa) | Quanterix | ||
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems | Singluex |