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Immunology and Infection

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

doi: 10.3791/57421 Published: June 14, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll um die Entwicklung und Validierung eines einzelnen Moleküls Array digitale ELISA Assays, ermöglicht ultra-sensitive Detektion von allen IFN-α-Subtypen in humanen Proben zu beschreiben.

Abstract

Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung und Validierung einer Interferon (IFN) beschreiben-α Einzelmolekül Array digitale Enzyme-Linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Assay. Dieses System ermöglicht die Quantifizierung des menschlichen IFN-α Proteins mit noch nie da gewesenen Sensibilität, und keine Kreuzreaktivität für andere Arten von IFN.

Der erste wichtige Schritt des Protokolls ist die Wahl des Antikörper-Paars, gefolgt von der Konjugation des Antikörpers erfassen paramagnetischen Perlen und biotinylierungen von den detektionsantikörper. Nach diesem Schritt können verschiedene Parameter wie Test-Konfiguration, Detektor antikörperkonzentration und Puffer Zusammensetzung geändert werden, bis die optimale Empfindlichkeit erreicht ist. Schließlich sind Spezifität und Reproduzierbarkeit der Methode bewertet, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Hier entwickelten wir eine IFN-α Einzelmolekül Array Assays mit einem Limit von Erkennung von 0,69 fg/mL mit hoher Affinität Autoantikörper von Patienten mit biallelische Mutationen im autoimmune Regulator (AIRE) Protein verursacht autoimmune Polyendocrinopathy isoliert Syndrom Typ 1/autoimmune Polyendocrinopathy-Candidiasis-ektodermalen Dystrophie (APS1/APECED). Wichtig ist, aktiviert diese Antikörper Nachweis von allen 13 IFN-α-Subtypen.

Diese neue Methode ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von IFN-α-Protein im menschlichen biologischen Proben in Attomolar Konzentrationen zum ersten Mal. Ein solches Instrument werden sehr nützlich bei der Überwachung der Ebenen dieses Zytokin in Gesundheit und Krankheit Staaten und vor allem Infektionen, Autoimmunität, Autoinflammation.

Introduction

Art I IFNs sind eine Familie von Zytokinen, die eine zentrale Rolle in der Orchestrierung antivirale Immunantwort. Sie wurden zuerst von Isaacs und Lindenmann 60 Jahren entdeckt,1,2 , und es ist nun bekannt, dass diese heterogene Familie von Polypeptiden besteht aus 14 verschiedenen Unterklassen (13 IFN-α-Subtypen und 1 IFN-β). Ich IFNs sind unerlässlich, um die Räumung von Virusinfektionen, sondern haben auch in der Pathologie der unterschiedlichsten Krankheiten Staaten, darunter die Autoimmunerkrankungen systemischer Lupus erythematodes (SLE), juvenile Dermatomyositis (JDM), in Verbindung gebracht und der Typ Ich Interferonopathies in welchem konstitutive Ergebnisse I IFN-induzierte Signalisierung in Pathologie3,4,5,6,7.

Studium der Typ I IFN Protein Ebenen in biologischen Proben ist seit seiner ersten Identifikation als eine "störenden Substanz"1,2herausfordernd. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) ist derzeit die am weitesten verbreitete Methode zur Erkennung von IFN-α-Protein. Trotz des Seins gezielte, einfache und schnelle, Typ I IFN ELISAs vorhandene wichtige Einschränkungen, z. B. begrenzte Empfindlichkeit. Darüber hinaus erfordert die Messung alle IFN-α-Subtypen den Einsatz von mehreren Tests mit eigenen Erkennung Kapazität und Empfindlichkeit. Zwar gibt es kommerzielle ELISAs, die verschiedene Subtypen des IFN-α zu erkennen, ihre Empfindlichkeit ist begrenzt (1,95 Pg/mL, 12,5 Pg/mL und 12.5 Pg/mL, beziehungsweise) die ist oft unzureichend, IFN-α Proteins in biologischen Proben zu erkennen. Um diese Einschränkung zu umgehen, Typ I IFN mehrere biologische Proxy-Assays wurden entwickelt, um die Quantifizierung durch Messung induzierte Genexpression oder funktionelle Aktivität8,9,10,11, 12 , 13 , 14. dennoch diese Tests bieten kein direktes Maß für die IFN-α-Protein.

In dieser Studie wurde Einzelmolekül Array ELISA Digitaltechnik verwendet, um einen Test zum Nachweis von einzelnen IFN-α-Protein-Moleküle zu entwickeln. Digitalen ELISA nutzt die gleichen grundlegenden Chemie als konventionellen ELISA, jedoch die Reaktion findet statt in Arrays bestehend aus 50.000 einzelne 46 Femtoliter Größe Brunnen15,16. Einzelne Proteinmoleküle durch Antikörper-beschichtete paramagnetischen Perlen erfasst und mit einem biotinylierte detektionsantikörper, gefolgt durch die Bindung an ein Enzym-Konjugat Streptavidin-β-Galaktosidase (SBG) gekennzeichnet. Anschließend werden die Perlen mit einem Fluorogenic Enzym-Substrat, Resorufin-β-D-Galactopyranoside (RGP) in Einzelmolekül-Arrays ausgesetzt. Durch die Verringerung des Volumens Reaktion 2 Milliarden Mal17, eine hohe lokale Konzentration von Fluoreszenzsignal erreicht und Einzelmolekül zählt sind möglich, wie jedes Molekül erzeugt ein Signal, das nun zuverlässig sein kann gemessen18. Im Wesentlichen können Einzelmolekül-Arrays zählen einzelne Immunocomplexes und die Festlegung einer durchschnittlichen Anzahl von Enzymen pro Perle (AEB). Zählen die Mikrovertiefungen, in denen ein Signal erkannt wird, erlaubt Quantifizierung/Digitalisierung der Protein-Moleküle, da gibt es eine direkte Korrelation zwischen Proteinkonzentration und das Verhältnis zwischen Immunocomplexed-Perlen und eine Gesamtanzahl von Perlen in vorhanden die Femtoliter große Kammern.

Yeung Et Al. eine umfangreiche Cross-Plattform-Evaluierungsstudie mit neun verschiedenen Technologien und vier Zytokin-Immunoassays für den Vergleich der Assay-Präzision, Sensibilität und Datenkorrelation über die verschiedenen Plattformen19durchgeführt. Eines der wichtigsten Ergebnisse der Studie war, dass Einzelmolekül-Arrays und Einzelmolekül Immunoassay zählen die höchste Empfindlichkeit zur Erkennung von Zytokinen in humanem Serum innerhalb der Sub-Pg/mL Konzentrationsbereich vorgestellt. Einzelmolekül Array digitale ELISA Zytokin Assays wurden verwendet, um die Untersuchung der Rolle von TNF-α und IL-6 in Crohns Krankheit20, IFN-α in Interferonopathy und Auto-immun-Patienten 7, und die verschiedenen posttranslational modifiziert Formen des C-X-C Motiv-Chemokin 10 (CXCL10) in chronischer Hepatitis und gesunden Spendern erhalten Sitagliptin21,22. Weitere Anwendungen sind die Messung von Rhodopsin bei Patienten mit diabetischer Retinopathie23; die Untersuchung von Gehirn Pathologien durch Serum/Plasma Messungen der Neurofilamente Licht24 und Amyloid-β 1-42 Peptid25im Zusammenhang mit Multipler Sklerose und Alzheimer-Krankheit, beziehungsweise. Einzelmolekül Array Assays können auch für verbesserte Erregernachweis z. B. Charakterisierung der HIV Virus-Reservoir26, und auch für die Erkennung von DNA-27 und Mikro-RNAs28verwendet werden. Ein großer Vorteil der Einzelmolekül-Array-Technologie ist diese hohe Vielseitigkeit, wie ein Test gegen jeden Analyten von Interesse entwickelt werden kann, wenn ein spezifischer Antikörper-paar zur Verfügung steht. Darüber hinaus sind Homebrew Assay Kits im Handel erhältlich, soll die Entwicklung von neue Assays, das, die Protokoll die in abgewandelter Form unten beschrieben wird.

Hier ist eine detaillierte Beschreibung der Entwicklung und Validierung Schritte für ein einzelnes Molekül Array Assays, dass die Ergebnisse in erweiterte Empfindlichkeit für IFN-α Proteindetektion präsentiert. Antikörper für Einzelmolekül Array Assays sollte hochspezifische, Kreuz Reaktivität mit Verwandte Proteine (mit Arten Spezifität berücksichtigt, falls relevant) zu vermeiden. Im Idealfall sollte die Antikörper mit einem K-D kleiner als 10-9 M gewählt werden; hoher Affinität sorgt für starke Bindung mit der Produktion von einem höheren Signal. Die Kinetik der Antikörper-Antigen-Bindung sind auch wichtige und schnelle Kauf und langsam Koff wird Antigen-Antikörper-komplexen Baugruppe begünstigen. Beginnend mit einem Antikörper-Paar, das eine gute Leistung in klassischen ELISA, mit einer Begrenzung der Nachweisgrenze (LOD) von 1-100 Pg/mL, hat erhöht die Chancen auf einen hochempfindlichen Einzelmolekül-Array-Assay. Chang und Kollegen führte detaillierte kinetische Untersuchungen der biomolekularen Wechselwirkungen auftreten bei jedem einzelnen Schritt, schlägt eine Reihe von Gleichungen, analytische Empfindlichkeit18vorherzusagen. Sie zeigten dieses Einzelmolekül-Array digitale ELISA wirksam innerhalb einer breiten Palette von Antikörper Affinitäten zu sein scheint (KD ~ 10−11 - 10−9 M), ebenso wie die Signalerzeugung abhängiger auf der Rate der solche Antikörper ist.

Um hohe Affinität zu nutzen geben wir Antikörper isoliert von Patienten mit dem Syndrom autoimmune Polyendocrinopathy nutzten Antikörper 1/autoimmune Polyendocrinopathy-Candidiasis-ektodermalen Dystrophie (APS1/APECED)29. Aus Gründen, die noch nicht erforscht sind, wird die große Mehrheit der AIRE-defizienten Personen entwickeln eine Reihe von hoch-Avidität Antikörper gegen alle IFN-α-Subtypen29und ausgewählt wurden zwei Anti-IFN-α-Antikörper Klone von ergänzenden verbindliche Affinitäten für die IFN-α Subtypen, als durch IC50 Werte geschätzt. Die Kombination dieser einzigartigen High-Affinität Antikörper mit Einzelmolekül-Array-Technologie ermöglicht die direkte Quantifizierung der IFN-α bei Konzentrationen von Attomolar (fg/mL). So empfindsamen IFN-α Proteindetektion trägt zu einem besseren Verständnis der Natur, Verordnung und biologische Wirkung der IFN-induzierte Reaktion in verschiedenen Krankheiten Einstellungen.

Protocol

1. Auswahl von Antikörpern

  1. Überprüfen Sie vor Beginn des Protokolls alle wichtigen Schritte (Tabelle 1) und wählen Sie optimale Antikörper.
    Hinweis: Für dieses Protokoll wurden hohe Affinität Anti-IFN-α-Antikörper - die IC50 davon sind in Tabelle 2 beschrieben. Wählen Sie vorzugsweise ein paar, das funktioniert gut mit konventionellen ELISA.

(2) Konjugation von Capture Antikörper paramagnetischen Beads und Testen der verschiedenen Konzentrationen

Hinweis: Halten Sie immer Bead Konjugation Puffer (BCB) und Perle Wash Buffer (BWB) auf dem Eis bei der Antikörper Konjugation.

  1. Erfassen Sie Antikörper Buffer Tausch
    1. Nehmen Sie erste Mengen von Anti-IFN-α-Antikörper A bis 3 verschiedene Wulst Konjugationen Verhältnisse (0,038 mg/mL, 0,075 mg/mL und 0,3 mg/mL) zu testen.
      Bemerkung: Die niedrigen Antikörper Beschichtung Konzentrationen kann vorteilhaft, wenn der Test eine hohe Hintergrundsignal präsentiert. Ersten Antikörper-Menge sollte einem geschätzten Verlust von 30 % bei den Puffer Austauschprozeß ausmachen. Nach Angaben des Herstellers und um erste Hintergrund zu verringern wurden Konzentrationen von 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL und 0,3 mg/mL getestet, obwohl diese genauen Werte oft nicht durch den oben genannten Variablen Verlust im Puffer gewonnen wurden, Austauschprozeß.
    2. Fügen Sie die gewünschte Lautstärke des Antikörpers in eine Filterspalte zusammen mit BCB, bis zu 500 µL.
    3. Zentrifugieren Sie die Säulen > 10.000 x g für 5 min und entsorgen der durchströmten.
    4. Waschen Sie die Spalte zweimal durch Zugabe von einem Gesamtvolumen von 450 µL BCB gefolgt von Zentrifugation bei > 10.000 x g für 5 min und die Durchströmung zu verwerfen.
    5. Setzen Sie die Filter Säule mit dem Antikörper zu einem sauberen Microcentrifuge Schlauch auf den Kopf gestellt - der offene Teil der Säule mit Blick auf das Innere des neuen Rohres - und bei 800 X g für 1 min zentrifugieren.
      Hinweis: Dieser Schritt ermöglicht Sammlung des gereinigten Antikörpers. Kein Puffer ist für diesen Schritt erforderlich.
    6. Waschen Sie die Membranen mit 50 µL BCB und Zentrifuge bei 800 X g für 1 min in 2.1.5.
    7. Messen Sie die Konzentration der Antikörper mit einem geringem Volumen Spektralphotometer.
    8. Fügen Sie BCB zur Erreichung der gewünschten antikörperkonzentration und beachten das Endvolumen hinzu.
      Hinweis: Ein Volumen von 200 µL wird verwendet werden, um den Rest des Protokolls, dieses Volumen bezeichnet als 2 Bände (2V) zu beschreiben. Die folgenden Reagenz Bände werden entsprechend angepasst werden.
    9. Wirbel und halten Sie auf dem Eis.
  2. Vorbereitung der paramagnetischen Bead
    1. Transfer 2,8 x 108 Perlen (100 µL = 1V) in ein Microfuge Gefäß.
      Hinweis: Das Volumen der Perlen ist das Endvolumen erreicht in 2.1.8 abhängig.
    2. Pulse Spin setzen einen Magnetabscheider für 1 min, Verdünnungsmittel zu verwerfen und von Magneten zu entfernen.
    3. Hinzufügen 2V BWB und Wirbel für 5 s.
    4. Wiederholen Sie 2.2.2 und 2.2.3 zweimal mit BWB und zwei weitere Male mit BCB.
    5. Fügen Sie für 1V Perlen 190 s Wirbel 5 µL BCB, Puls Spin, und speichern Sie die gewaschenen Perlen auf dem Eis.
  3. Perle-Aktivierung
    1. Fügen Sie 1 mL kalte BCB zu einem 10 mg Fläschchen 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) und Wirbel, bis die Lösung homogen ist.
    2. Fügen Sie 10 µL des kalten verdünnten EDC 1V von Perlen die gewaschenen Perlen, Wirbel und halten Sie in einem Shaker mit 1.000 u/min für 30 min bei Raumtemperatur hinzu.
      Hinweis: EDC Vorbereitung und Ergänzung zu den Perlen sollte so schnell wie möglich aufgrund von EDC Instabilität in wässrigen Lösungen erfolgen. Auch, wie EDC hoch reaktiv ist, ist es wichtig, dass eine homogene Wulst Suspension vor EDC Zugabe um heterogene Wulst Aktivierung zu verhindern. Nach EDC hinaus müssen Perlen in der Schwebe gehalten werden.
  4. Wulst Konjugation des Antikörpers
    1. Wirbel und Puls spin die aktivierten Perlen. Jetzt legen Sie die Perlen in einem Magnetabscheider für 1 min, verwerfen Sie BCB überstand und entfernen Sie das Rohr vom Magneten zu.
    2. Waschen Sie die Perlen mit 2V des BCB. Wirbel, Puls Spin und Magnetabscheider für 1 min setzen. Dann verwerfen des BCB-Puffers und die Perlen von den Magneten zu entfernen.
    3. Schnell kalt, Puffer ausgetauscht 200 µL (2V) des Antikörpers zu aktivierten Perlen hinzufügen.
    4. Wirbel und halten Sie für 2 h in den Shaker bei Raumtemperatur.
  5. Wulst Blocking und endgültige Bereinigung
    1. Pulse Spin der Antikörper-beschichtete Perlen-Aufhängung, setzen die Magnetabscheider für 1 min, überstand an einen neuen Schlauch übertragen und messen die Konzentration mit einem geringem Volumen-Spektrophotometer.
      Hinweis: Dieser Schritt wird informieren über ob die Perlen gesättigt sind-alle Werte größer als NULL zeigt Perlen Sättigung - Erkennung von löslichen Antikörper binden an die Perlen messbar werden.
    2. Entfernen Sie die konjugierten Perlen vom Magneten zu, fügen Sie 2V BWB, Wirbel für 5 s, Puls Spin und Put Magnetabscheider für 1 min.
    3. Den überstand auf einen neuen Schlauch übertragen und die Konzentration mit einem geringem Volumen Spektralphotometer messen.
      Hinweis: Dieser Schritt wird Aufschluss auf ob die Antikörper die Perlen stabil befestigt sind. Nachweisbaren antikörperkonzentration in diesen überstand zeigt Ablösung des Antikörpers aus Perlen, was regelmäßig geschieht. Dieser Test funktioniert oft auch wenn sehr geringe Mengen an Erfassung Antikörper an die Perlen bleiben.
    4. Entfernen Sie die konjugierten Perlen vom Magneten zu, fügen Sie 2V BWB, Wirbel für 5 s, Puls Spin und Put Magnetabscheider für 1 min.
    5. Konjugierte Perlen vom Magneten zu entfernen, fügen Sie 2V Bead blockieren Puffer, Wirbel für 5 s, und in den Shaker für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Waschen der Antikörper-beschichtete und blockierte Perlen mit 2V, einmal mit BWS, 3 X und 2 X mit Wulst Verdünnungsmittel Puffer (verwerfen alle Überstände).
    7. Speichern Sie die beschichteten und blockierten Perlen bei 4° C bis zur Verwendung mit 2V Bead Verdünnungsmittel Puffer.
      Hinweis: Kurz vor dem Einsatz, müssen Perlen einmal mit Detektor/Sample Diluent mit einem Volumen von 250 x Perle Band/20, mit dem Magnetabscheider gewaschen werden.

3. Erkennung Antikörper Biotinylierungen

  1. Detektion Antikörper Buffer Tausch
    1. 260 µg der zwei Anti-IFN-α Ab Klone zu nehmen.
      Hinweis: Dies nimmt Rücksicht auf eine Verlust von 30 % bei Buffer Tausch und ermöglicht die Prüfung von zwei verschiedenen Biotin/Antikörper-Verhältnisse.
    2. 2.1 mit Biotinylierungen Reaktion Puffer (BRB) anstelle von BCB gehen.
    3. Messen Sie das Volumen und die Antikörper-Konzentrationen und Regeln Sie die Lautstärke um eine Endkonzentration von 1 mg/mL zu erhalten.
      Hinweis: Dies ist eine vorgeschlagene Konzentration ab, sondern optimiert werden, wenn der Test nicht die gewünschte Empfindlichkeit erreicht.
  2. Erkennung-Antikörper-Biotinylierungen
    1. Die N-Hydroxysuccinimide-Polyethylen-glycol4-Biotin (NHS-PEG4-Biotin) auf Raumtemperatur bringen und erneut mit einer Gesamtfläche von 400 µL destilliertes Wasser, eine 3,4 mM-Konzentration zu erreichen.
    2. Entscheiden das Biotin: Antikörper-Verhältnis zu testen und mischen detektionsantikörper entsprechend verdünnten Biotin (60:1 Verhältnis entspricht 100 µL detektionsantikörper und 4,5 µL von Biotin).
      Hinweis: Um zu beginnen, testen Sie Verhältnis 30: 1 zu 60:1.
    3. Wirbel der Antikörper-Biotin-Mix, pulse Spin und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      Hinweis: Keine Notwendigkeit zu schütteln.
  3. Biotinylierte Erkennung Antikörper Reinigung
    1. Biotinylierte Antikörper zu übertragen, um einen neuen Filter und wie 2.1, 3 Waschschritte mit BRB durchführen (400, 450 und 450 µL) und eine abschließende Auflistung.
    2. Messen Sie das Volumen und die Konzentration der gereinigten, biotinylierte detektionsantikörper und Speicher bei 4 ° C bis zur Verwendung.

(4) Assay-Optimierung

Hinweis: Verwenden der Einzelmolekül-Array-Analyzer-Software in ein Homebrew Konfiguration30.
Die Einzelmolekül Array Analyzer Maschine wird durch die Software, die auszuführenden Assay Standardisierungen, zum Beispiel Quantifizierungen, um externe Parameter ändern ausführen können (Perle, Detektor, SBG, RGP Konzentrationen; Probe Verdünnungen...) und interne Parameter (Anzahl der Schritte, Inkubationszeiten...), optimale Assay-Bedingungen zu erreichen und kann auch verwendet werden, um die Ergebnisse (Hintergrund, LOD, Mengen) berechnen. Der Aufbau der Einzelmolekül-Array-Analyzer und für jede Runde der Optimierung erforderlichen Reagens-Mengen zu berechnen finden Sie unter Anweisungen des Herstellers. Durchführen Sie die ersten Runden der Optimierung mit einer 2-Schritt-Konfiguration.

  1. Testen Sie Kombinationen von Capture Antikörper konjugiert Perlen und biotinylierte detektionsantikörper in beiden Konfigurationen.
    1. Testen Sie Kombinationen der drei verschiedenen Anti-IFN-α A Antikörper-Konzentrationen mit zwei verschiedenen Anti-IFN-α B biotinylierungen Verhältnisse zu erfassen, als Erkennung und Erfassung Antikörper und Vice Versa (Abbildung 1) durch Auswahl der geeigneten Bedingungen im der Analyzer-Software.
    2. Wählen Sie die empfindlichste Kombination, d. h. die Bedingungen, die die niedrigsten LOD anbieten und verwenden Sie es für weitere Schritte
      Hinweis: Abbildung 1 zeigt, wie eine 0,3 mg/mL Anti-IFN-α ein Wulst antikörperkonzentration und Biotin: Antikörper-Verhältnis von 30: 1 mit dem Anti-IFN-α-B-Antikörper führten die höchste Empfindlichkeit, ausweislich einer Detailgenauigkeit von 11,6 fg/mL. (Siehe zusätzliche Tabelle 1). Diese Kombination wird für alle zukünftigen Schritte verwendet werden. Beachten Sie, dass die große Sensibilität mit diesem bestimmten Test vor jeder Runde der Optimierung erreicht.

Figure 1
Abbildung 1: Auswahl der Antikörper Orientierung erfassen antikörperkonzentration auf Perlen und biotinylierungen Verhältnis. Die zwei möglichen unterschiedlichen Konfigurationen wurden getestet, mit dem Anti-IFN-α A als Capture-Antikörper und Anti-IFN-α B als Erkennung Antikörper (A) und Vice Versa (B). IFNα - 2c wurde als Antigen eingesetzt. Verschiedene Aufnahme-Antikörper-Konzentrationen sowie Biotin: Antikörper (B:A)-Verhältnisse wurden für beide Konfigurationen getestet. Gepunktete Linie zeigt LOD für den besten Zustand; Anti-IFN-α ein 0,3 mg/mL als Abscheidung und Anti-IFN-α B Biotin: Detektor Antikörper Verhältnis von 30 (LOD = 11,6 mg/mL, ein AEB-Wert des 0.017265 entspricht). Eine 2-stufige Konfiguration verwendet wurde. Biotin: Antikörper (B:A). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Vergleichen Sie eine 2 vs. 3-Schritt-Konfiguration.
    Hinweis: In einer 3-Stufen-Konfiguration gibt es drei verschiedene inkubationsschritte, eine mit dem Capture-Antikörper, eins mit den detektionsantikörper und ein Finale Dritter für die SBG-Enzym-Kennzeichnung. Jedoch in einer Konfiguration mit 2-stufigen erfassen und erkennen Antikörper sind gleichzeitig mit der Analyten von Interesse inkubiert.
    1. 4.1.2 Auswahl der 2- und 3-Stufen-Konfigurationen vorkonfiguriert in das Analysegerät, folgende Hersteller Anweisungen30den Einzelmolekül-Array-Analyzer mit der Erfassung und Detektor antikörperkonzentration und Verhältnisse ausgeführter.
    2. Wählen Sie die Konfiguration, die für die höchste Empfindlichkeit ermöglicht und halten Sie sie für zukünftige Schritte
      Hinweis: Wie in Abbildung 2 und ergänzenden Tabelle 2dargestellt, gab die 2-Schritt-Konfiguration leicht höhere Empfindlichkeit und Signal/Hintergrund-Verhältnis für jede Konzentration getestet. Deshalb wurde die 2-Schritt-Konfiguration für zukünftige Schritte gehalten.

Figure 2
Abbildung 2:2 Vs 3-Schritt-Konfiguration Vergleich. Die 2- und 3-Stufen-Konfigurationen wurden bewertet mit 0,3 mg/mL Anti-IFN-α ein Antikörper als Abscheidung und Anti-IFN-α B als detektionsantikörper im Verhältnis 30 Biotin: Antikörper. IFNα - 2c wurde als Antigen eingesetzt. In einem 3-Stufen-Zustand gibt es drei verschiedene inkubationsschritte, eine mit dem Capture-Antikörper, eins mit den detektionsantikörper und ein Finale Dritter für die SBG-Enzym-Kennzeichnung. Jedoch in einer Konfiguration mit 2-stufigen erfassen und erkennen Antikörper sind gleichzeitig mit der Analyten von Interesse inkubiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Detektor-Antikörper und SBG-Konzentration-Optimierung
    1. Testen Sie drei unterschiedliche Konzentrationen der Detektor Antikörper (0,1 0,3 und 0,6 µg/mL) zusammen mit drei unterschiedlichen Konzentrationen der SBG (50, 150 und 250 pM) wie oben30beschrieben.
    2. Wählen Sie die Konzentrationen, die die höchste Empfindlichkeit gibt und halten Sie sie für zukünftige Schritte.
      Hinweis: Abbildung 3 zeigt, dass Detektor 0,3 µg/mL und SBG 150 Uhr waren die Bedingungen, die die optimale LOD zeigte. Diese Bedingungen gab auch geringe natürliche Grundbelastung und mittlere Amplitude, ein Verhalten, das gute Standardabweichung (SD) Werte (ergänzende Tabelle3) produziert. Typische Konzentrationen im Bereich zwischen 0,1 - 1 µg/mL für die detektionsantikörper und 50-200 pM für SBG, obwohl höhere Konzentrationen (z.B. bis zu 300 pM) für Letzteres ist möglicherweise erforderlich. Es ist wichtig, die Bedingungen zu vermeiden, die höher als 0,02 AEB Hintergründe dargestellt wird. Erhöhung der Konzentration der Detektor monoklonaler Antikörper (mAb) oder SBG Signalantwort und Hintergrund verbessern. Wenn das Inkrement in Signal die Änderung im Hintergrund überwindet, wird jedoch die LOD verbessern. Eine Situation kann auftreten, in denen eine Abnahme im Hintergrund besser Diskriminierung zwischen niedrigen Kalibratoren ermöglicht.

Figure 3
Abbildung 3: Optimierung der Detektor und SBG Konzentration. Drei verschiedene Konzentrationen der biotinylierte Detektor Antikörper (0,1 0,3 und 0,6 µg/ml) zusammen mit drei unterschiedlichen Konzentrationen der SBG (50, 150 und 250 pM) bewertet wurden. Gepunktete Linie zeigt LOD für den besten Zustand; Detektor-Antikörper bei 0,3 mg/mL und SBG 150 pM (LOD = 0,09 mg/mL, ein AEB-Wert des 0.017184 entspricht). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Weitere Optimierungsschritte
    1. Wenn die gewünschte Empfindlichkeit nicht erreicht worden ist, testen Sie unterschiedliche Inkubationszeiten für die einzelnen Schritte mit den vorkonfigurierten Optionen im Analyzer-Software.
    2. Wenn der Test nicht Empfindlichkeit genug ist, optimieren Sie die Anzahl der Perlen pro Assay mit den vorkonfigurierten Optionen im Analyzer-Software.
      Hinweis: Sobald Prüfung von biologischen Proben beginnt, Probenvolumen ist ein zusätzlicher Parameter, die anfällig für Optimierung. Stellen Sie sicher, dass Proben nach der Gesundheit und Sicherheit Verfahren behandelt werden.

5. Test Spezifität und Reproduzierbarkeit

  1. Testen Sie IFN-α-Assay Spezifität, durch das Testen des Tests mit IFN-α-Subtypen und andere verwandte Proteine (Abb. 4a und 4 b).

Figure 4
Abbildung 4: Spezifität und Sensitivität des optimierten IFNα Einzelmolekül Array Assays. (A) IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω und rekombinante Proteine, zusammen mit (B) 16 Subtypen des IFN-α getestet wurden, IFN-γ, darunter drei IFN-α2-Arten (IFN-α2a, IFN α2b und IFN-α2c). Adaptiert von Rodero Et Al. 2017. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Beurteilen Sie die Reproduzierbarkeit des optimierten Assays durch drei unabhängige wiederholte Experimente durchführen und die Bewertung von Inter-Assay Variabilität (Abbildung 5).
  2. Berechnen Sie die Detailgenauigkeit des Assays
    Hinweis: Die LOD war berechnet den Mittelwert der drei Rohlinge + 3 Standardabweichungen (SD), damit man einen Wert von 0,23 fg/mL. Der Verdünnungsfaktor Standardprobe 1:3 ist, gibt die Aufnahme der Verdünnungsfaktor eine Detailgenauigkeit von 0,69 fg/mL.

Figure 5
Abbildung 5: Reproduzierbarkeit des optimierten Pan-IFN-α Einzelmolekül Array Assays. Drei unabhängige Läufe wurden mit zwei verschiedenen Partien Perlen durchgeführt. Für die zweite Partie wurden zwei unabhängige Experimente durchgeführt. Jede Messung wurde Duplikate erworben. Die gestrichelte Linie steht die LOD, definiert durch mittlere leere durchschnittliche Enzym pro Perle + SD alle Läufe. IFN-α17 diente als Referenz, unter Berücksichtigung, dass die abgeleitete Standardkurve repräsentativ für alle anderen IFN-α-Subtypen, ist wie in Abbildung 4 bdargestellt. Plot zeigt Mittelwert und SD (Fehlerbalken). Gepunktete Linien zeigen LOD für die verschiedenen Läufe; Ausführung 1: 0.0.73. fg/mL AEB = 0.006238, Ausführung 2: 0.113 fg/mL AEB = 0.007119, laufen 3: 0.043 fg/mL AEB = 0.05518). Adaptiert von Rodero Et Al. 2017. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

(6) Protein-Wettbewerb-Assay

  1. Führen Sie einen Protein-Wettbewerb-Assay (siehe Abbildung 6 Legende) die Spezifität des Assays demonstrieren.
    Hinweis: Plasma-Proben von Patienten mit SLE (n = 5) dienten.
    1. Bei auf Viren Verdacht um in der biologischen Probe anwesend zu sein, bereiten Sie Inaktivierung Puffer durch Zugabe von 200 µL ein nicht Ioinic Tensid (0,5 % Nonidet P40 Ersatz), 40 mL-Detektor/Sample Verdünnungsmittel und Vortex kräftig.
    2. Zentrifugieren Sie biologische Proben mit den Analyten von Interesse bei 10.000 g für 15 min bei 4 ° C, zelltrümmer zu entfernen.
    3. Mix-185 µL Detektor/Verdünnungsmittel oder Inaktivierung Probenpuffer mit 100 µL biologischen Probe (Endverdünnung Faktor 3) und 15 µL Anti-IFN-α-Antikörper A (anfängliche Konzentration 1 mg/mL, Endkonzentration 50 Ug/mL) oder Puffer. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Führen Sie Beispiele mit und ohne Anti-IFN-α-Antikörper in der Einzelmolekül-Array-Analyser wie oben beschrieben aus.
      Hinweis: Im Falle von Signalsättigung, sollten Proben weiter verdünnt werden. 300 µL ist das Volumen für doppelte Analyse erforderlich.

Figure 6
Abbildung 6: Protein Wettbewerb Assay. Wettbewerb-Experimente wurden mit Proben aus fünf verschiedenen SLE-Patienten durchgeführt. Biologische Proben wurden bei 10,000 g für 15 min bei 4 ° c zentrifugiert. Sie wurden verdünnt 1/3 mit Detektor/Sample Verdünnungsmittel enthält NP40 für virale Inaktivierung. 15µl Anti-IFN-α-Antikörper A (anfängliche Konzentration 1 mg/mL, Endkonzentration 50 µg/mL) oder Puffer hinzugefügt wurden zu einem Gesamtvolumen von 300 µL. Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, für 30 min. Kontrollgruppe grau dargestellt wird und Proben behandelt mit Anti-IFN-α A Antikörper werden in schwarz angezeigt. Diagramm zeigt Mittelwert und SD (Fehlerbalken). Gestrichelte Linie steht LOD (AEB = 0.024774, 0.8037 fg/mL). Adaptiert von Rodero Et Al. 2017 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Representative Results

Zusammenfassend lässt sich sagen beschichtet eine Pan-IFN-α Einzelmolekül Array Assays mit einem Limit von Erkennung von 0,69 fg/mL, mit einer 2-Schritt-Konfiguration mit Capture Perlen mit 0,3 mg/mL Anti-IFN-α ein Antikörper und Anti-IFN-α B Erkennung Antikörper biotinylierte bei einem Biotin: Antikörper-Verhältnis von 30 wurde entwickelt. Die Konzentrationen für biotinylierte detektionsantikörper und SBG verwendet wurden 0,3 µg/mL und 150 pM, beziehungsweise. Dieser hochspezifischen Test ist in der Lage alle 13 IFN-α-Subtypen erkennen und reagiert nicht Kreuz mit anderen haben. So während es nicht möglich zu identifizieren und quantifizieren der einzelnen Arten der IFN-α, alle von ihnen erkannt werden und zusammen die einen Gesamtkonzentration Wert für IFN-α, das die 13 verschiedenen Unterklassen umfasst vermessen.

Um die mögliche diagnostische Wertigkeit des neu entwickelten Assays zu erkunden, wurden IFN-α Proteins im Plasma und Serum von gesunden Personen gemessen und verglichen mit Proben von Patienten mit SLE und JDM. Wie in Abbildung 7dargestellt, wurden hohe Niveaus des IFN-α Proteins in beiden Kohorten Krankheit im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen nachgewiesen. Die gepunktete Linie zeigt die LOD eine konventionelle kommerziell erhältlichen ELISA, illustrieren, wie dieser Ansatz nicht IFN-α Proteins bei diesen Patientengruppen trotz der ihr bekannten Verbänden von dieses Zytokin mit diesen Phänotypen erkennen würde. Darüber hinaus könnte IFN-α über 5 Protokolle, Größenordnung, quantifiziert werden, illustrieren den Dynamikbereich des Assays mit nachweisbaren Konzentrationen zwischen 1-10 fg/mL die hochsensiblen Charakter des Tests bestätigt.

Figure 7
Abbildung 7: Quantifizierung der IFN-α Proteins in Plasma und Serum von Patienten Kohorten. Diese Zahl wurde von Rodero Et al.modifiziert. 2017. Plasma von gesunden Kontrollpersonen (n = 20) und Patienten mit SLE (n = 72) und JDM (n = 43) wurden mit dem Pan-IFNα Einzelmolekül-Array-Assay getestet. Analyse erfolgte mittels One-Way ANOVA Test (Kruskal-Wallis) und Dunns mehrere Vergleich zwischen den Gruppen getestet. Median ist dargestellt. Gepunktete Linie zeigt LOD eine Referenz menschlichen Anti-IFN-α ELISA (1,95 Pg/mL = 1950 fg/mL). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Schritt Überlegungen Referenz
(1) Antikörper paar Wahl Ziel verschiedene Epitope Tabelle 2
Hohe Affinität
Kauf schnell / langsam Kaus
2. Antikörper paar Orientierung Wählen Sie mit der niedrigsten Limit of Detection Abbildung 1
3. erfassen Sie antikörperkonzentration
(4) Biotin: Detektor-Antikörper-Verhältnis
5. 2 vs. 3-Schritt-Konfiguration Wählen Sie die Bedingung mit dem höchsten Signal: Hintergrund-Verhältnis Abbildung 2
(6) Detektor antikörperkonzentration Wählen Sie mit der niedrigsten Limit of Detection Abbildung 3
(7) SBG Konzentration
8. Besonderheiten Kreuzreaktivität zu bewerten Abbildung 4
(9) Empfindlichkeit Anerkennung der Subtypen zu bewerten, (falls zutreffend)
10. die Reproduzierbarkeit Assay-Variabilität zu bewerten Abbildung 5

Tabelle 1: Zusammenfassung der Schritte für die Entwicklung und Optimierung eines einzelnen Moleküls Array Assays. Diese Tabelle fasst die verschiedenen Schritte für die Entwicklung und Optimierung eines einzelnen Moleküls Array Assays, von der anfänglichen Auswahl der Antikörper paar bis die Beurteilung der Reproduzierbarkeit.

Antigen 8H 1 (A) 12H 5 (B) Sifalimumab Rontalizumab
IFNΑ1 28.3 51,3 460 22.63
IFNΑ2 2563 10.7 9.02 2.15
IFNΑ4 5.11 2.99 35,35 325.3
IFNΑ5 2.01 19.6 93.29 2.49
IFNΑ6 64,7 3.03 4.97 -
IFNΑ7 0,9 0,63 233.1 -
IFNΑ8 302 0,83 691 10,86
IFNΑ10 2,54 0,71 43.2 -
IFNΑ14 3224 2.1 14.52 0,9
IFNΑ16 1,83 32,99 59.18 28.65
IFNΑ17 2.21 0,77 890.9 23.86
IFNΑ21 2.78 12.87 1769 5.8

Tabelle 2: Pan-Alpha Antikörper Auswahl. IC50 (ng/mL) anhand der Interferon-stimulierten Response-Element (ISRE)-Luciferase Neutralisation Assay. Tabelle zeigt IC50-Werte der mAbs in Einzelmolekül-Array-Assay für alle IFN-α-Subtypen verwendet. 10.000 HEK 293 MSR-Zellen wurden in weiße Hälfte-Bereich-96-Well-Platten ausgesät und umgekehrt mit 50 ng Komplettformel ISRE Firefly Luciferase Reporter und Renilla-Luciferase-Konstrukte mit Transfektion Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Das Luciferase exprimierenden Konstrukt diente als eine interne Normalisierung Kontrolle. Zellen wurden über Nacht in reduziert Serum Medium ergänzt mit unwesentlichen Aminosäuren 0,1 mM, 1 mM Natrium Pyruvat, 0,5 % fötalen Rinderserum bei 37 ° C, 5 % CO2 in eine feuchte Atmosphäre inkubiert. Nach der Inkubation über Nacht wurden Zellen angeregt für 24 h mit Mischungen von rekombinanten menschlichen IFN-α mit oder ohne Anti-IFN-α mAbs oder Kontrolle IgG, die für 1 h bei 37 ° c preincubated worden war-haltigem medium Nach 24 Stunden der Stimulation wurden dual Luciferase Reporter Assays nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. «-» Nicht bestimmt. Sifalimumab ist ein vollständig humaner Immunglobulin G1 κ monoklonaler Antikörper, der bindet und neutralisiert die Mehrheit der IFN-α-Untertypen; Rontalizumab ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper gegen IFN-α. Adaptiert von Meyer Et Al. 2016 und Rodero Et al. 2017.

Ergänzende Tabelle1: Auswahl der Antikörper Orientierung erfassen antikörperkonzentration auf Perlen und biotinylierungen Verhältnis. Die zwei möglichen unterschiedlichen Konfigurationen wurden getestet, mit dem Anti-IFN-α A als Capture-Antikörper und Anti-IFN-α B als Erkennung Antikörper (A) und Vice Versa (B). IFNα - 2c wurde als Antigen eingesetzt. Verschiedene Aufnahme-Antikörper-Konzentrationen sowie Biotin: Antikörper (B:A)-Verhältnisse wurden für beide Konfigurationen getestet. Sättigung (SA). Orange: AEB-Werte, die für LOD Berechnung verwendet wurden; Diese Konzentrationen galten leer wie die AEB-Werte unverändert. LOD war als meine leere + 3SD. berechnet Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Tabelle 2: Test der 2 Vs 3-Schritt Konfiguration. Die 2- und 3 - Schritt-Konfigurationen wurden anhand IFNα - 2c, als Antigen. AEB-Werte werden auch als Signal/Rationen (S/B) Hintergrund für beide Bedingungen angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Tabelle3: Optimierung der Detektor und SBG Konzentration. Drei verschiedene Konzentrationen der biotinylierte Detektor Antikörper (0,1 0,3 und 0,6 µg/mL) zusammen mit drei unterschiedlichen Konzentrationen der SBG (50, 150 und 250 pM) bewertet wurden. AEB-Werte werden für die neun getesteten Bedingungen angezeigt. Orange: AEB-Werte, die für LOD Berechnung verwendet wurden; Diese Konzentrationen galten leer wie die AEB-Werte unverändert. LOD war als meine leere + 3SD. berechnet Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Tabelle 4: Spezifität und Sensitivität des optimierten IFNα Einzelmolekül Array Assays. Durchschnittliche Enzym pro Perlen Werte werden angezeigt wenn IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω und IFN-γ waren rekombinante Proteine getestet (A), zusammen mit den 16 Subtypen des IFN-α (B). «-» Nicht bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Tabelle 5: Reproduzierbarkeit des optimierten IFNα Einzelmolekül Array Assays. Die AEB-Mittelwerte für alle drei unabhängigen Läufe sind zu einer Konzentration von 10.000 fg/mL aufgetaucht. «-» Nicht bestimmt. Sättigung (SA). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Tabelle 6: Protein Wettbewerb Assay. Durchschnittliche Enzym pro Perlen Werte werden angezeigt, für alle Bedingungen getestet. Messungen erfolgten in zweifacher Ausfertigung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Discussion

Hier beschrieben wir die Entwicklung und Validierung von einer hoch reproduzierbare, Gromer Einzelmolekül Array digitale ELISA für direkte Quantifizierung des IFN-α Proteins in humanen Proben (Schritte in Tabelle 1zusammengefasst). Einer der wichtigsten Schritte bei der Entwicklung des Tests ist die Wahl der Antikörper Paar16, mit den Eigenschaften in Bezug auf die Kinetik und Epitop Bindung als Schlüssel zu einem erfolgreichen Test. Es ist wichtig, vermeiden den Einsatz von gekoppelte monoklonale Antikörper, die gezielt das gleiche Epitop oder sterische Behinderung verursachen. Polyclonal Antikörper könnte als Erkennung Antikörper verwendet werden, um diese Beschränkungen zu überwinden. Wenn die gewünschte Empfindlichkeit bei jedem gegebenen Schritt nicht erreicht wird, sollte weitere Optimierungsmöglichkeiten betrachtet werden. Dazu gehören die Verwendung von alternativen Antikörper Paare, Änderungen in den Parametern wie proteintyp (z.B. BSA < Kasein), pH (6,0-8,5), Ionenstärke, Pufferkapazität (z.B. NaCl und Phosphat-Konzentrationen), Träger Perlen und/oder Anwesenheit von Tensiden. Eine Vielzahl von Parametern werden con optimiert, wenn einen einzelnes Molekül Array Assay Entwicklung. Jedoch insgesamt Bedingungen, die hohe Signal: Hintergrund-Verhältnisse und minimale LODs geben die sind bevorzugt (siehe Abbildung 1, Abbildung 2und Abbildung 3).

Hinsichtlich Spezifität, der IFN-α-Test zeigte kein Kreuz Reaktivität für andere IFNs getestet (β, γ, λ1, λ2, ω) (Abb. 4a) und war in der Lage alle 13 IFN-α-Subtypen (Abbildung 4 b). Der Test ergab jedoch eine geringere Affinität für die IFN-α2-Subtyp, (Abbildung 4 b und ergänzenden Tabelle 4). Interessanterweise wurden unterschiedliche Empfindlichkeiten für die einzelnen Klassen der IFN-α2 (a, b, C) auch beobachtet, die möglicherweise aufgrund unterschiedlichen Herstellungsverfahren oder andere Aminosäure-Sequenzen, wie die IFN-α2-Subtypen aus verschiedenen kommerziellen gewonnen wurden, Lieferanten. Mit dieser einzigen Ausnahme gab die IFN-α-Arten sehr ähnliche Reaktionen. Die Spezifität des Assays zeigte sich weiter durch Vorbehandlung der Proben mit der Anti-IFN-α ein Klon, die das Signal (Abb. 6 und ergänzenden Tabelle 6) aufgehoben.

Eines der wichtigsten Vorteile dieser Technologie ist, dass alle Analyten von Interesse kann potenziell gezielte16. Darüber hinaus können verschiedenen biologische Proben getestet werden, wie z. B. Serum, Plasma, Liquor cerebrospinalis, zelluläre Lysates, Kultur Überstände31 und sogar Atem32. In der Regel ist eine Verdünnung von 1:3 von Plasma durchgeführt, um zu vermeiden, mögliche Verstopfung der Einzelmolekül-Array-Analysator. Jedoch der Analyten von Interesse in sehr geringen Konzentrationen in die relevanten biologischen Probe vorhanden sein könnten und möglicherweise höhere Konzentrationen der Probe erforderlich (je nach Empfindlichkeit der Assay)33. Obwohl es Potenzial gibt für multiplexing unter Beibehaltung guter Empfindlichkeit34, ist es ein schwieriger Prozess und Assays für die Messung von größer als 6 Proteine innerhalb der gleichen Experimente haben noch35werden entwickelt.

Die Fähigkeit zu erkennen und zu quantifizieren, Zytokine und andere biologische relevante Proteine bei so niedrigen Konzentrationen eröffnet eine ganze Reihe neuer Anwendungen33,36. Es ist bekannt, dass zahlreiche Proteine ihre Wirkung auch bei sehr geringen Konzentrationen, ausüben, die bisher unter der Nachweisgrenze der besten ELISAs37lagen. Während andere Immunoassay-Technologien Vorteile gegenüber konventionellen ELISA19 bieten, zeigen wir hier, dass Einzelmolekül Array digitale ELISA eine reproduzierbare und robuste Plattform für den empfindsamen Nachweis geringer Konzentration Zytokine in ist humanen Proben. Diese Technologie bietet enormes Potenzial für die Entdeckung von Biomarkern und verbesserte Patientenmanagement eine Vielzahl von Krankheiten.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

DD und YJC anerkennen, Unterstützung von der ANR (Projekt IFNX, keine. CE17001002) und der ImmunoQure AG für die Bereitstellung von monoklonalen Antikörpern. Wir danken Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki und Pierre Quartier für die Bereitstellung von klinischer Proben. YJC erkennt das European Research Council (GA 309449: Stipendium für YJC), und einer staatlichen Förderung durch die National Research Agency (Frankreich) unter der "Investitionen für die Zukunft"-Programm mit der Referenz ANR-10-IAHU-01 verwaltet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone eBioscience BMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone eBioscience BMS216BK Not an ELISA kit but bulk abs
IFN α2c eBioscience BMS305 OK
IFN αI (17) PBL 11150-1
IFN α2a PBL 11100-1
IFN α2a PeproTech No longer available
IFN α2b PBL 11105-1
IFN α1 PBL 11175-1
IFN α4a (M1) PBL 11177-1
IFN α4b (a4) PBL 11180-1
IFN αB2 (a8) PBL 11115-1
IFN αC (a10) PBL 11120-1
IFN αD (a1) PBL 11125-1
IFN αG (a5) PBL 11135-1
IFN αF (a21) PBL 11130-1
IFN αH2 (a14) PBL 11145-1
IFN αJ1 (a7) PBL 11160-1
IFN αK (a6) PBL 11165-1
IFN αWA (a16) PBL 11190-1
IFN λ1 PeproTech 300-02L
IFN λ2 PeproTech 300-02K
IFN ω PeproTech 300-02J
IFN β PeproTech 300-02BC
IFN γ PeproTech 300-02
Anti-IFN-α ELISA PBL 41115.1
96-well plates Corning 3904
ISRE-Reporter Qiagen CCS-008L
Fu-GENE HD Transfection Reagent Promega E2311
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem ThermoFischer Scientific 31985062
Dual-Luciferase Reporter assay Promega E1910
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000 Thermo Scientific No longer available
Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres Merck Millipore UFC505096
Bead Conjugation Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic Beads Quanterix 101360
Bead Wash Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
EDC Fisher Scientific 11844071
Bead Blocking Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Bead Diluent Buffer Quanterix 101362
Detector and Sample Diluent Quanterix 101359
Biotinylation Reaction Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
NHS-PEG4-Biotin Fisher Scientific 11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) Thermo Scientific 75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) IKA MS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubes Eppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) ThermoFisher Scientific 12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) VWR 521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode Labels Quanterix 101652
15 mL Reagent Bottles Quanterix 102411
Simoa specimen 96-well plates Quanterix 101457
Simoa Discs Quanterix 100001
Simoa 2.0 conductive Tips Quanterix 101726
Simoa Cuvettes Quanterix 100803
Simoa SBG Reagent Quanterix 102295
Simoa RGP Reagent Quanterix 101736
Simoa System Buffer 1 Quanterix 100486
Simoa System Buffer 2 Quanterix 100487
Sealing Oil Quanterix 100206
ddH2O
Simoa HD-1 Analyzer Quanterix 100032
Technologies
Single molecule array (Simoa) Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems Singluex

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References

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Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).More

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