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Immunology and Infection

विकास और एक Ultrasensitive एकल अणु सरणी डिजिटल एंजाइम के सत्यापन-मानव इंटरफेरॉन के लिए Immunosorbent परख से जुड़े-α

doi: 10.3791/57421 Published: June 14, 2018
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम एक एक अणु सरणी डिजिटल एलिसा परख के विकास और सत्यापन का वर्णन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो मानव नमूनों में सभी IFN-α उपप्रकारों का अति-संवेदनशील पता लगाने में सक्षम बनाता है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य के लिए एक इंटरफेरॉन (IFN) के विकास और सत्यापन का वर्णन है-α एकल अणु सरणी डिजिटल एंजाइम से जुड़े ImmunoSorbent परख (एलिसा) परख । इस प्रणाली के ठहराव मानव IFN-α प्रोटीन की अभूतपूर्व संवेदनशीलता के साथ, और IFN की अन्य प्रजातियों के लिए कोई क्रॉस-जेट के साथ सक्षम बनाता है ।

प्रोटोकॉल का पहला मुख्य चरण एंटीबॉडी पेयर का चुनाव है, जिसके बाद कैप्चर एंटीबॉडी के विकार को paramagnetic मोतियों की माला, और पता लगाना biotinylation का एंटीबॉडी. इस कदम के बाद, परख विंयास के रूप में विभिंन मानकों, डिटेक्टर एंटीबॉडी एकाग्रता, और बफर संरचना जब तक इष्टतम संवेदनशीलता हासिल की है संशोधित किया जा सकता है । अंत में, विशिष्टता और विधि के reproducibility परिणामों में विश्वास सुनिश्चित करने के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं । यहां, हम ०.६९ fg/एमएल का पता लगाने की एक सीमा के साथ एक IFN-α एकल अणु सरणी परख विकसित उच्च संबंध स्व-प्रतिरक्षित नियामक (अरे) में biallelic उत्परिवर्तनों के साथ रोगियों से पृथक एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन के कारण स्व-प्रतिरक्षित polyendocrinopathy सिंड्रोम प्रकार 1/स्व-polyendocrinopathy-कैंडिडिआसिस-ectodermal dystrophy (APS1/ महत्वपूर्ण बात यह है कि ये एंटीबॉडी सभी 13 IFN-α उपप्रकारों का पता लगाने में सक्षम है ।

यह नई पद्धति पहली बार attomolar सांद्रता पर मानव जैविक नमूनों में IFN-α प्रोटीन का पता लगाने और ठहराव की अनुमति देती है. इस तरह के एक उपकरण मानव स्वास्थ्य और रोग राज्यों में इस cytokine के स्तर की निगरानी में अत्यधिक उपयोगी हो जाएगा, सबसे विशेष रूप से संक्रमण, प्रतिरक्षा, और सूजन ।

Introduction

प्रकार मैं IFNs साइटोकिंस के एक परिवार है जो एंटीवायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं उद्घोष में एक केंद्रीय भूमिका निभा रहे हैं । वे पहले इसहाक और Lindenmann ६० साल1,2 से पहले की खोज की थी और अब यह ज्ञात है कि polypeptides के इस विषम परिवार के 14 विभिंन उपवर्गों (13 IFN-α उपप्रकार और 1 IFN-β) शामिल हैं । प्रकार मैं IFNs वायरल संक्रमण की मंजूरी के लिए आवश्यक हैं, लेकिन यह भी मानव रोग राज्यों की एक किस्म की विकृति में फंसाया गया है, स्व-प्रतिरक्षित विकारों प्रणालीगत एक प्रकार ल्यूपस (SLE), किशोर dermatomyositis (JDM) सहित, और टाइप मैं interferonopathies में जो गठन प्रकार मैं पैथोलॉजी3,4,5,6,7में IFN संकेत परिणाम प्रेरित ।

प्रकार का अध्ययन मैं जैविक नमूनों में प्रोटीन का स्तर IFN एक "हस्तक्षेप पदार्थ"1,2के रूप में अपनी प्रारंभिक पहचान के बाद से चुनौती दी गई है । वर्तमान में, सैंडविच एंजाइम से जुड़े ImmunoSorbent परख (एलिसा) IFN-α प्रोटीन का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है । विशिष्ट, सरल, और तेजी से होने के बावजूद, प्रकार मैं IFN एलिसाs वर्तमान महत्वपूर्ण सीमाओं, जैसे सीमित संवेदनशीलता के रूप में । इसके अलावा, सभी IFN-α उपप्रकार की माप एकाधिक परख के उपयोग की आवश्यकता है अपने स्वयं का पता लगाने की क्षमता और संवेदनशीलता के साथ । जबकि वाणिज्यिक एलिसा है कि IFN-α के विभिंन उपप्रकार का पता लगाने, उनकी संवेदनशीलता सीमित है (१.९५ स्नातकोत्तर/एमएल, १२.५ स्नातकोत्तर/एमएल, और १२.५ स्नातकोत्तर/एमएल, क्रमशः) जो अक्सर अपर्याप्त है जैविक नमूनों में IFN-α प्रोटीन का पता लगाने के लिए । इस सीमा को दूर करने के लिए, कई जैविक प्रॉक्सी परख प्रकार मैं प्रेरित जीन अभिव्यक्ति या कार्यात्मक गतिविधि को मापने के द्वारा IFN यों तोविकसित किया गया है8,9,10,11, 12 , 13 , 14. फिर भी, इन परख IFN-α प्रोटीन का एक सीधा माप प्रदान नहीं करते ।

इस अध्ययन में, एकल अणु सरणी डिजिटल एलिसा प्रौद्योगिकी के लिए एकल IFN-α प्रोटीन अणुओं का पता लगाने के लिए एक परख विकसित किया गया था । डिजिटल एलिसा पारंपरिक एलिसा के रूप में ही बुनियादी रसायन विज्ञान का इस्तेमाल, तथापि, प्रतिक्रिया arrays में जगह लेता है ५०,००० व्यक्तिगत ४६ femtoliter आकार वेल्स15,16। एकल प्रोटीन अणुओं एंटीबॉडी-लेपित paramagnetic मोती द्वारा कब्जा कर लिया है और एक biotinylated का पता लगाने एंटीबॉडी, एक एंजाइम संयुग्मी, streptavidin-β-galactosidase (एसबीजी) के बंधन के बाद के साथ लेबल । बाद में, मोती एक fluorogenic एंजाइम सब्सट्रेट, resorufin-β-डी-galactopyranoside (RGP), के साथ एक अणु arrays में निलंबित कर रहे हैं । मात्रा प्रतिक्रिया २,०००,०००,००० बार17कम करके, फ्लोरोसेंट संकेत के एक उच्च स्थानीय एकाग्रता हासिल की है और एक अणु गिनती संभव हो, के रूप में प्रत्येक अणु एक संकेत है कि अब मज़बूती से18मापा जा सकता है उत्पंन करता है । संक्षेप में एकल अणु arrays एकल immunocomplexes गिनती और मनका (ाोएब) प्रति एंजाइमों की एक औसत संख्या का निर्धारण करने में सक्षम हैं । microwells जिसमें एक संकेत का पता चला है परमिट ठहराव/डिजिटलाईजेशन प्रोटीन अणुओं की गिनती, के रूप में वहां प्रोटीन एकाग्रता के बीच एक सीधा संबंध है और immunocomplexed-मोतियों के बीच अनुपात और मोतियों की कुल संख्या में मौजूद femtoliter-आकार कक्षों ।

Yeung एट अल. एक व्यापक पार मंच मूल्यांकन परख परिशुद्धता, संवेदनशीलता की तुलना के उद्देश्य के साथ नौ विभिंन प्रौद्योगिकियों और चार cytokine immunoassays का उपयोग कर अध्ययन किया, और विभिंन प्लेटफार्मों19भर में डेटा सहसंबंध । अध्ययन के प्रमुख निष्कर्षों में से एक यह है कि एकल अणु arrays और एकल अणु गिनती immunoassay मानव सीरम में उप के भीतर साइटोकिंस का पता लगाने के लिए सबसे अधिक संवेदनशीलता प्रस्तुत-pg/एमएल एकाग्रता रेंज । एकल अणु सरणी डिजिटल एलिसा cytokine की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है TNF-α और IL-6 Crohn की बीमारी में20, IFN-α में interferonopathy और ऑटो प्रतिरक्षा रोगियों में 7, और अलग पोस्ट-अनुवाद संशोधित रूपों सी के एक्स-सी आकृति chemokine 10 (CXCL10) क्रोनिक हेपेटाइटिस और स्वस्थ दाताओं में sitagliptin प्राप्त21,22। अन्य अनुप्रयोगों मधुमेह रेटिनोपैथी23के साथ रोगियों में rhodopsin का माप शामिल; neurofilament प्रकाश24 और amyloid के सीरम/प्लाज्मा माप के माध्यम से मस्तिष्क विकृतियों का अध्ययन-β 1-42 पेप्टाइड25, एकाधिक स्केलेरोसिस और अल्जाइमर रोग के संदर्भ में क्रमशः । एकल अणु सरणी परख भी एचआईवी वायरल जलाशय26के लक्षण वर्णन के रूप में बेहतर रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और भी डीएनए का पता लगाने के लिए27 और माइक्रो RNAs28। एकल अणु सरणी प्रौद्योगिकी का एक प्रमुख लाभ इस उच्च बहुमुखी प्रतिभा है, ब्याज की किसी भी analyte के खिलाफ एक परख के रूप में विकसित किया जा सकता है अगर एक विशिष्ट एंटीबॉडी जोड़ी उपलब्ध है । इसके अलावा, homebrew परख किट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, नए परख के विकास की अनुमति है, जो प्रोटोकॉल के नीचे एक संशोधित रूप में विस्तृत है ।

यहां, एक एक अणु सरणी परख के लिए विकास और मांयता कदम का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत किया है कि IFN-α प्रोटीन का पता लगाने के लिए बढ़ाया संवेदनशीलता में परिणाम । एकल अणु सरणी परख के लिए एंटीबॉडी अत्यधिक विशिष्ट होना चाहिए, संबंधित प्रोटीन के साथ पार जेट से परहेज (प्रजातियों यदि प्रासंगिक माना जाता विशिष्टता के साथ) । आदर्श रूप में, एक Kडी के साथ एंटीबॉडी 10 से छोटे-9 एम चुना जाना चाहिए; उच्च संबंध मजबूत बाध्यकारी सुनिश्चित करता है, एक उच्च संकेत के उत्पादन के साथ । कैनेटीक्स एंटीबॉडी-प्रतिजन बाइंडिंग के भी महत्वपूर्ण हैं, और तेजी से कश्मीरपर और धीमी गति kबंद प्रतिजन-एंटीबॉडी जटिल विधानसभा एहसान होगा । एक एंटीबॉडी जोड़ी है कि शास्त्रीय एलिसा में एक अच्छा प्रदर्शन है, 1-100 स्नातकोत्तर/एमएल का पता लगाने की सीमा (लोद) के साथ शुरू, एक अति संवेदनशील एकल अणु सरणी परख प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है । चांग और उनके सहयोगियों ने हर एक कदम पर होने वाली आणविक बातचीत की विस्तृत काइनेटिक अध्ययनों का प्रदर्शन किया, विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता की भविष्यवाणी करने के लिए18समीकरणों का एक सेट का प्रस्ताव. उंहोंने दिखाया कि एक अणु सरणी डिजिटल एलिसा एंटीबॉडी समानताएं की एक व्यापक रेंज के भीतर प्रभावी प्रतीत होता है (केडी ~ 10− 11 -10− 9 एम), साथ ही साथ कि संकेत पीढ़ी इस तरह के एंटीबॉडी की दर पर अधिक निर्भर है ।

उच्च अपनत्व एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए हम एंटीबॉडी के साथ रोगियों से अलग लाभ ले लिया स्व-प्रतिरक्षित polyendocrinopathy सिंड्रोम प्रकार 1/स्व-प्रतिरक्षित polyendocrinopathy-कैंडिडिआसिस-ectodermal dystrophy(APS1/ कारण है कि अभी तक समझ में नहीं आ रहे है के लिए, अरे की कमी व्यक्तियों के बड़े बहुमत के सभी IFN-α उपप्रकार के खिलाफ उच्च-avid एंटीबॉडी का एक मुख्य सेट विकसित29, और हम पूरक बाध्यकारी α के दो विरोधी IFN-एंटीबॉडी समानताएं क्लोन का चयन विभिंन IFN-α उपप्रकार के लिए, के रूप में आईसी५० मूल्यों का अनुमान है । एकल अणु सरणी प्रौद्योगिकी के साथ इन अद्वितीय उच्च संबंध एंटीबॉडी के संयोजन attomolar पर IFN-α के प्रत्यक्ष ठहराव (fg/एमएल) सांद्रता सक्षम होना चाहिए । इस तरह के ultrasensitive IFN-α प्रोटीन का पता लगाने के लिए विभिंन रोग सेटिंग्स में IFN प्रेरित प्रतिक्रिया के स्वभाव, विनियमन और जैविक प्रभाव की एक बेहतर समझ में योगदान देगा ।

Protocol

1. एंटीबॉडी का चयन

  1. प्रोटोकॉल की समीक्षा शुरू करने से पहले सभी महत्वपूर्ण कदम (तालिका 1) और इष्टतम एंटीबॉडी का चयन करें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए उच्च समानता anti-IFN-α एंटीबॉडी-IC50 जो की तालिका 2 में वर्णित है चुना गया । तरजीही, पारंपरिक एलिसा के साथ अच्छी तरह से काम करता है कि एक जोड़ी का चयन करें ।

2. Paramagnetic मोतियों को कैद एंटीबॉडी का विकार और विभिन्न सांद्रता के परीक्षण

नोट: एंटीबॉडी विकार प्रक्रिया के दौरान हमेशा मनका विकार बफर (बीसीबी) और मनका धो बफर (BWB) को बर्फ पर रखें ।

  1. कैप्चर एंटीबॉडी बफ़र एक्सचेंज
    1. एंटी-IFN-α एंटीबॉडी ए की प्रारंभिक मात्रा लें 3 अलग मनका conjugations अनुपात (०.०३८ मिलीग्राम/एमएल, ०.०७५ मिलीग्राम/एमएल, और ०.३ मिलीग्राम/एमएल) का परीक्षण करने के लिए ।
      नोट: कम एंटीबॉडी कोटिंग सांद्रता फायदेमंद हो सकता है अगर परख एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत प्रस्तुत करता है । प्रारंभिक एंटीबॉडी मात्रा बफ़र विनिमय प्रक्रिया के दौरान अनुमानित 30% हानि के लिए खाता होना चाहिए । निर्माता के निर्देशों के अनुसार और प्रारंभिक पृष्ठभूमि को कम करने के क्रम में, ०.०५ मिलीग्राम/एमएल, ०.१ मिलीग्राम/एमएल, और ०.३ मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता का परीक्षण किया गया, हालांकि इन सटीक मूल्यों अक्सर के कारण प्राप्त नहीं थे aforementioned चर नुकसान में बफर विनिमय प्रक्रिया ।
    2. एंटीबॉडी के आवश्यक वॉल्यूम को एक साथ एक फ़िल्टर स्तंभ में जोड़ें बीसीबी के साथ, अप करने के लिए ५०० µ l
    3. > 10, 000 x 5 मिनट के लिए जी पर कॉलम केंद्रापसारक और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    4. 5 मिनट के लिए > 10, 000 x जी पर केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया और के माध्यम से प्रवाह त्यागना बीसीबी के ४५० µ एल की कुल मात्रा जोड़कर दो बार कॉलम धो लो ।
    5. फिल्टर एक साफ microcentrifuge ट्यूब में एंटीबॉडी युक्त स्तंभ उल्टा नीचे-नए ट्यूब के अंदर का सामना करना पड़ कॉलम के खुले हिस्से-और 1 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक ।
      नोट: यह चरण साफ़ एंटीबॉडी के संग्रह की अनुमति देगा । इस चरण के लिए कोई बफ़र अतिरिक्त आवश्यक है ।
    6. ५० µ एल बीसीबी के साथ झिल्ली धो और ८०० एक्स जी में 2.1.5 के रूप में 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    7. एक कम मात्रा spectrophotometer का उपयोग कर एंटीबॉडी की एकाग्रता को मापने ।
    8. वांछित एंटीबॉडी एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बीसीबी जोड़ें और अंतिम मात्रा नोट.
      नोट: २०० µ l का वॉल्यूम प्रोटोकॉल के शेष का वर्णन करने के लिए उपयोग किया जाएगा, यह खंड 2 खंड (2V) के रूप में संदर्भित किया जा रहा है । सभी निम्न एजेंट वॉल्यूम तदनुसार अनुकूलित किया जाएगा ।
    9. भंवर और बर्फ पर रखो ।
  2. Paramagnetic मनका तयारी
    1. स्थानांतरण २.८ x 108 मोती (१०० µ l = 1V) एक microfuge ट्यूब में ।
      नोट: मोतियों की मात्रा 2.1.8 में प्राप्त अंतिम मात्रा पर निर्भर है.
    2. पल्स स्पिन और 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक में डाल दिया, मंदक त्यागें, और चुंबक से हटा दें ।
    3. 5 एस के लिए BWB और भंवर के 2V जोड़ें ।
    4. BWB और दो बार बीसीबी के साथ दो बार -8 और 2.2.3 दोहराएं ।
    5. मोतियों की 1V के लिए जोड़ें १९० µ l बीसीबी, भंवर 5 एस, पल्स स्पिन, और बर्फ पर धोया मोती की दुकान.
  3. मनका सक्रियण
    1. 1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide हाइडरोक्लॉराइड (EDC) और भंवर जब तक समाधान सजातीय है की एक 10 मिलीग्राम की शीशी के लिए ठंडे बीसीबी की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. मोतियों की 1V के लिए धो मोती, भंवर के लिए ठंड पतला EDC के 10 µ एल जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए १,००० rpm पर एक शेखर में रहते हैं ।
      नोट: edc तैयारी और मोतियों के अलावा जलीय समाधान में edc अस्थिरता के कारण के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाना चाहिए । इसके अलावा, के रूप में edc अत्यधिक प्रतिक्रियाशील है, यह महत्वपूर्ण है edc अतिरिक्त के लिए एक समरूप मनका निलंबन से पहले आदेश विषम मनका सक्रियण को रोकने के लिए । EDC इसके बाद, मोती निलंबन में रखा जाना चाहिए ।
  4. मनका विकार के एंटीबॉडी
    1. भंवर और पल्स सक्रिय मोती स्पिन । अब एक चुंबकीय विभाजक में मोतियों को 1 मिनट के लिए रखें, बीसीबी supernatant को छोड़ दें, और चुंबक से ट्यूब निकालें ।
    2. बीसीबी की 2V के साथ मोतियों को धोएं. भंवर, पल्स स्पिन, और 1 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक में डाल दिया । फिर बीसीबी बफर को त्यागें और चुंबक से मोतियों को निकाल लें.
    3. जल्दी से ठंडा, बफर-विमर्श २०० µ एल (2V) एंटीबॉडी के सक्रिय मोतियों को जोड़ें ।
    4. भंवर और कमरे के तापमान पर शेखर में 2 ज के लिए रखो ।
  5. मनका अवरुद्ध और अंतिम साफ-अप
    1. पल्स स्पिन एंटीबॉडी-लेपित मोती निलंबन, 1 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक में डाल दिया, एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण, और एक कम मात्रा spectrophotometer के साथ एकाग्रता उपाय ।
      नोट: यह कदम है कि मोतियों संतृप्त कर रहे है के बारे में जानकारी प्रदान करेगा-शूंय से ऊपर कोई भी मान मनका संतृप्ति का संकेत होगा-घुलनशील एंटीबॉडी मोतियों को बांध करने में असमर्थ का पता लगाने के रूप में मध्यम श्रेणी का हो जाएगा ।
    2. चुंबक से संयुग्मित मोती निकालें, 5 एस, पल्स स्पिन के लिए BWB, भंवर के 2V जोड़ने, और 1 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक में डाल दिया ।
    3. एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण और एक कम मात्रा spectrophotometer का उपयोग कर एकाग्रता को मापने ।
      नोट: इस कदम के बारे में जानकारी प्रदान करेगा कि क्या एंटीबॉडी मोतियों को छुरा तय कर रहे हैं । इस supernatant में detectable एंटीबॉडी एकाग्रता मोतियों से एंटीबॉडी की टुकड़ी का संकेत देगी, जो नियमित रूप से होती है. इस परख अक्सर काम करता है भी जब कब्जा एंटीबॉडी की बहुत छोटी मात्रा में मोतियों से जुड़े रहते हैं ।
    4. चुंबक से संयुग्मित मोती निकालें, 5 एस, पल्स स्पिन के लिए BWB, भंवर के 2V जोड़ने, और 1 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक में डाल दिया ।
    5. चुंबक से संयुग्मित मोती निकालें, मनका अवरुद्ध बफर के 2V जोड़ने, 5 एस के लिए भंवर, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए शेखर में मशीन ।
    6. एंटीबॉडी-लेपित और अवरुद्ध मोतियों 2V के साथ 3x धोने, जैविक हथियारों के साथ एक बार, और मनका मंदक बफर के साथ 2x (सभी supernatants त्यागें) ।
    7. स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर लेपित और अवरुद्ध मोती मनका मंदक बफर के 2V के साथ प्रयोग तक ।
      नोट: बस का उपयोग करने से पहले, मोती एक बार डिटेक्टर के साथ धोया जाना चाहिए/२५० x मनका volume/20, चुंबकीय विभाजक का उपयोग कर के एक खंड का उपयोग कर के नमूने मंदक ।

3. डिटेक्शन एंटीबॉडी Biotinylation

  1. डिटेक्शन एंटीबॉडी बफ़र एक्सचेंज
    1. ले दो एंटी IFN-α एबी क्लोन के २६० µ g ।
      नोट: यह बफर एक्सचेंज के दौरान एक 30% नुकसान को ध्यान में लेता है और दो अलग बायोटिन/एंटीबॉडी अनुपात के परीक्षण की अनुमति देता है ।
    2. २.१ के रूप में बीसीबी के बजाय Biotinylation प्रतिक्रिया बफर (BRB) का उपयोग कर आगे बढ़ें ।
    3. मात्रा और एंटीबॉडी सांद्रता उपाय और 1 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मात्रा समायोजित करें ।
      नोट: यह एक सुझाव शुरू एकाग्रता है, लेकिन यह अगर परख आवश्यक संवेदनशीलता को प्राप्त नहीं करता है अनुकूलित किया जा सकता है ।
  2. डिटेक्शन एंटीबॉडी Biotinylation
    1. कमरे के तापमान के लिए एन-hydroxysuccinimide-पॉलीथीन-glycol4-बायोटिन (एन एच एस-PEG4-बायोटिन) लाओ और आसुत जल के ४०० µ एल की कुल के साथ reसस्पैंड एक ३.४ mM एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए ।
    2. बायोटिन तय: एंटीबॉडी अनुपात का परीक्षण करने के लिए और मिश्रण का पता लगाने एंटीबॉडी और पतला बायोटिन तदनुसार (60:1 अनुपात के बराबर होती है १०० µ l का पता लगाने के एंटीबॉडी और ४.५ µ एल के बायोटिन).
      नोट: शुरू करने के लिए, परीक्षण 30:1 और 60:1 अनुपात ।
    3. भंवर एंटीबॉडी-बायोटिन मिश्रण, नाड़ी स्पिन और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए गर्मी ।
      नोट: नहीं मिलाने की जरूरत है ।
  3. Biotinylated डिटेक्शन एंटीबॉडी शुद्धिकरण
    1. biotinylated एंटीबॉडी को एक नए फ़िल्टर में स्थानांतरित करें और २.१ के रूप में आगे बढ़ें, BRB (४००, ४५०, और ४५० µ l) के साथ 3 वाशिंग चरण निष्पादित कर रहा है और एक अंतिम संग्रह ।
    2. मात्रा और शुद्ध, biotinylated का पता लगाने एंटीबॉडी और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के उपयोग तक की एकाग्रता को मापने ।

4. परख अनुकूलन

नोट: एक Homebrew विंयास30में एकल अणु सरणी विश्लेषक सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ।
एकल अणु सरणी विश्लेषक मशीन सॉफ्टवेयर मानकीकरण चलाने के लिए अनुमति देता है कि द्वारा नियंत्रित है, नमूना quantifications प्रदर्शन करने के लिए, बाहरी मापदंडों को संशोधित करने के लिए (मनका, डिटेक्टर, एसबीजी, RGP सांद्रता; नमूना कमजोर पड़ने...) और आंतरिक पैरामीटर (कदम की संख्या, मशीन समय...) इष्टतम परख शर्तों को प्राप्त करने के लिए, और भी परिणाम की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (पृष्ठभूमि, लोद, मात्रा) । एकल अणु सरणी विश्लेषक के सेटअप और अनुकूलन के प्रत्येक दौर के लिए आवश्यक एजेंट वॉल्यूम की गणना करने के लिए, निर्माता के निर्देश देखें । 2-चरण कॉंफ़िगरेशन का उपयोग करके ऑप्टिमाइज़ेशन के पहले राउंड निष्पादित करें ।

  1. दोनों कॉन्फ़िगरेशन में कैप्चर एंटीबॉडी-संयुग्मित मोतियों और biotinylated डिटेक्शन एंटीबॉडी का परीक्षण संयोजन ।
    1. तीन अलग विरोधी का परीक्षण संयोजन-IFN-α एक कब्जा दो अलग विरोधी IFN-α बी biotinylation अनुपात के रूप में पता लगाने और कब्जा एंटीबॉडी के साथ एंटीबॉडी सांद्रता, और इसके विपरीत (चित्रा 1) में उपयुक्त स्थितियों के चयन द्वारा विश्लेषक सॉफ्टवेयर ।
    2. सबसे संवेदनशील संयोजन का चयन करें, कि है, शर्तों है कि सबसे कम लोद प्रस्ताव है, और यह आगे कदम के लिए उपयोग करें
      नोट: चित्रा 1 से पता चलता है कि कैसे एक ०.३ मिलीग्राम/एमएल विरोधी IFN-α एक एंटीबॉडी मनका एकाग्रता और एक बायोटिन: एंटीबॉडी अनुपात के साथ 30:1 विरोधी IFN-α बी एंटीबॉडी उच्चतम संवेदनशीलता के परिणामस्वरूप, ११.६ fg/एमएल के एक लोद द्वारा सबूत के रूप में । ( अनुपूरक तालिका 1देखें) । यह संयोजन सभी भावी चरणों के लिए उपयोग किया जाएगा । सूचना है कि महान अनुकूलन के किसी भी दौर से पहले इस विशेष परख के साथ हासिल की संवेदनशीलता ।

Figure 1
चित्रा 1: एंटीबॉडी अभिविन्यास का चयन, मोतियों और biotinylation अनुपात पर एंटीबॉडी एकाग्रता पर कब्जा. दो संभावित विभिंन विंयास का परीक्षण किया गया, विरोधी IFN-α एक के रूप में कब्जा एंटीबॉडी और विरोधी IFN-α बी के रूप में पता लगाने एंटीबॉडी (एक), और इसके विपरीत (ख) का उपयोग कर । IFNα-2c प्रतिजन के रूप में इस्तेमाल किया गया था । विभिंन कैप्चर एंटीबॉडी सांद्रता के साथ ही बायोटिन: एंटीबॉडी (B:A) अनुपात भी दोनों विंयास के लिए परीक्षण किया गया । बिंदीदार रेखा सबसे अच्छी हालत के लिए लोद से पता चलता है; विरोधी IFN-α एक ०.३ मिलीग्राम/एमएल के रूप में कब्जा और विरोधी IFN-α बी बायोटिन: डिटेक्टर एंटीबॉडी अनुपात के 30 (लोद = ११.६ मिलीग्राम/एमएल ०.०१७२६५ के एक ाोएब मूल्य के लिए इसी) । कोई 2-चरण कॉंफ़िगरेशन का उपयोग किया गया था । बायोटिन: एंटीबॉडी (B:A). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए

  1. एक 2 बनाम 3 कदम विंयास की तुलना करें ।
    नोट: एक 3 कदम विंयास में, वहां तीन अलग मशीन कदम, कब्जा एंटीबॉडी, पता लगाने एंटीबॉडी और एसबीजी एंजाइम लेबलिंग के लिए एक अंतिम एक तिहाई के साथ एक के साथ एक हैं । हालांकि, एक 2-कदम विंयास में, कब्जा और जांच एंटीबॉडी ब्याज की analyte के साथ एक साथ मशीन हैं ।
    1. 4.1.2 से कब्जा और डिटेक्टर एंटीबॉडी एकाग्रता और अनुपात के साथ एकल अणु सरणी विश्लेषक भागो 2 और 3 कदम विन्यास का चयन पूर्व विश्लेषक में विन्यस्त, निर्माता के निर्देशों का पालन30.
    2. विंयास कि उच्चतम संवेदनशीलता के लिए अनुमति देता है चुनें और यह भविष्य के कदम के लिए रख
      नोट: के रूप में चित्रा 2 और अनुपूरक तालिका 2में दिखाया गया है, 2-कदम विंयास हर एकाग्रता परीक्षण के लिए थोड़ा उच्च संवेदनशीलता और संकेत/ इसलिए, 2-चरण कॉंफ़िगरेशन भविष्य चरणों के लिए रखा गया था ।

Figure 2
चित्र 2:2 बनाम 3-चरण कॉंफ़िगरेशन तुलना । 2 और 3 कदम विंयास विरोधी IFN-α एक एंटीबॉडी के रूप में कब्जा और विरोधी IFN-α बी का पता लगाने एंटीबॉडी के रूप में एक 30 बायोटिन: एंटीबॉडी अनुपात में ०.३ मिलीग्राम/एमएल का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । IFNα-2c प्रतिजन के रूप में इस्तेमाल किया गया था । एक 3-कदम स्थिति सेटिंग में, वहां तीन अलग मशीन कदम, कब्जा एंटीबॉडी, पता लगाने एंटीबॉडी और एसबीजी एंजाइम लेबलिंग के लिए एक अंतिम तीसरे एक के साथ एक के साथ एक हैं । हालांकि, एक 2-कदम विंयास में, कब्जा और जांच एंटीबॉडी ब्याज की analyte के साथ एक साथ मशीन हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. डिटेक्टर एंटीबॉडी और एसबीजी एकाग्रता अनुकूलन
    1. परीक्षण तीन डिटेक्टर एंटीबॉडी के विभिंन सांद्रता (०.१, ०.३, और ०.६ µ g/एमएल) के साथ तीन एसबीजी के विभिंन सांद्रता (५०, १५०, और २५० बजे) के रूप में30से ऊपर वर्णित है ।
    2. एकाग्रता है कि उच्चतम संवेदनशीलता देता है और उंहें भविष्य के चरणों के लिए रखने का चयन करें ।
      नोट: चित्रा 3 से पता चलता है कि डिटेक्टर ०.३ µ g/mL और एसबीजी १५० pM शर्तों कि इष्टतम लोद दिखाया गया था । इन शर्तों को भी कम पृष्ठभूमि स्तर और मध्यम आयाम, अच्छा मानक विचलन (SD) मान (अनुपूरक तालिका 3) का उत्पादन करता है एक व्यवहार दिया है । ठेठ सांद्रता ०.१ के बीच सीमा-1 µ g/एमएल के लिए पता लगाने एंटीबॉडी और ५०-२०० बजे के लिए एसबीजी, हालांकि उच्च सांद्रता (जैसे बाद के ३०० बजे तक) की आवश्यकता हो सकती है । यह ०.०२ ाोएब से अधिक पृष्ठभूमि प्रदान करेगा कि शर्तों से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. डिटेक्टर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) या एसबीजी की एकाग्रता में वृद्धि दोनों संकेत प्रतिक्रिया और पृष्ठभूमि में वृद्धि होगी. हालांकि, अगर संकेत में वृद्धि पृष्ठभूमि में परिवर्तन दुर्गम, लोद में सुधार होगा । एक स्थिति पैदा कर सकता है जिसमें पृष्ठभूमि में कमी कम औजार के बीच बेहतर भेदभाव की अनुमति देता है ।

Figure 3
चित्रा 3: डिटेक्टर और एसबीजी एकाग्रता अनुकूलन । तीन अलग सांद्रता के biotinylated डिटेक्टर एंटीबॉडी (०.१, ०.३, और ०.६ µ g/एमएल) के साथ तीन एसबीजी के विभिंन सांद्रता (५०, १५०, और २५० बजे) का मूल्यांकन किया गया । बिंदीदार रेखा सबसे अच्छी हालत के लिए लोद से पता चलता है; ०.३ मिलीग्राम/एमएल और एसबीजी 150pM पर डिटेक्टर एंटीबॉडी (लोद = ०.०९ मिलीग्राम/एमएल ०.०१७१८४ के एक ाोएब मूल्य के लिए इसी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. अतिरिक्त ऑप्टिमाइज़ेशन चरण
    1. आवश्यक संवेदनशीलता प्राप्त नहीं किया गया है, तो विश्लेषक सॉफ़्टवेयर में कॉन्फ़िगर किए गए विकल्पों का उपयोग करते हुए विभिन्न चरणों के लिए विभिन्न मशीन समय का परीक्षण करें ।
    2. यदि परख पर्याप्त संवेदनशीलता नहीं है, परख विश्लेषक सॉफ्टवेयर में कॉंफ़िगर विकल्प का उपयोग कर प्रति मोतियों की संख्या का अनुकूलन ।
      नोट: एक बार जैविक नमूनों का परीक्षण शुरू होता है, नमूना मात्रा एक अतिरिक्त अनुकूलन के लिए अतिसंवेदनशील पैरामीटर है । सुनिश्चित करें कि नमूने स्वास्थ्य और सुरक्षा प्रक्रियाओं के अनुसार संचालित कर रहे हैं ।

5. परख विशिष्टता और Reproducibility

  1. परीक्षण IFN-α परख विशिष्टता, विभिंन IFN-α उपप्रकार और अंय संबंधित प्रोटीन के साथ परख परीक्षण द्वारा (चित्रा 4a और 4b) ।

Figure 4
चित्रा 4: विशिष्टता और अनुकूलित IFNα एकल अणु सरणी परख की संवेदनशीलता । (क) IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω, और IFN-γ रिकॉमबिनेंट प्रोटीन का परीक्षण किया गया, साथ में (ख) IFN-α के 16 उपप्रकार, जिनमें तीन IFN-α2 प्रकार (IFN-α2a, IFN-α2b, और IFN-α2c) शामिल हैं. Rodero एट अलसे अनुकूलित । २०१७. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

  1. तीन स्वतंत्र प्रदर्शन दोहराने प्रयोगों और अंतर परख परिवर्तनशीलता (चित्रा 5) का आकलन करके अनुकूलित परख के reproducibility का आकलन करें ।
  2. परख के लोद की गणना
    नोट: लोद तीन रिक्तियां के माध्य का उपयोग करते हुए परिकलित किया गया था + 3 मानक विचलन (SD), इस प्रकार ०.२३ fg/एमएल का एक मूल्य प्राप्त करने । के रूप में मानक नमूना कमजोर पड़ने कारक 1:3 है, कमजोर पड़ने कारक का समावेश ०.६९ fg/एमएल के एक लोद देता है ।

Figure 5
चित्रा 5: अनुकूलित पान के Reproducibility-IFN-α एकल अणु सरणी परख । तीन स्वतंत्र रन मोतियों की दो अलग बहुत का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । दूसरे लॉट के लिए दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया । प्रत्येक माप डुप्लिकेट में प्राप्त किया गया था । बिंदीदार रेखा लोद का प्रतिनिधित्व करता है, मनका प्रति मतलब रिक्त औसत एंजाइम द्वारा परिभाषित + सभी रन की एसडी । IFN-α17 एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया था, कि व्युत्पंन मानक वक्र सभी अंय IFN-α उपप्रकार के प्रतिनिधि है, के रूप में चित्रा 4bमें दिखाया गया है । भूखंड मतलब मूल्य और एसडी (त्रुटि सलाखों) से पता चलता है । डॉटेड रेखाएं विभिंन रनों के लिए लोद दिखाती हैं; भागो 1:०.०७३ fg/एमएल ाोएब = ०.००६२३८, भागो 2:०.११३ fg/एमएल ाोएब = ०.००७११९, भागो 3:०.०४३ fg/एमएल ाोएब = ०.०५५१८) । Rodero एट अलसे अनुकूलित । २०१७. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

6. प्रोटीन प्रतियोगिता परख

  1. एक प्रोटीन प्रतियोगिता परख प्रदर्शन ( चित्रा 6 किंवदंती में वर्णित) और परख की विशिष्टता प्रदर्शित करता है ।
    नोट: SLE (n = 5) के साथ रोगियों से प्लाज्मा नमूनों का इस्तेमाल किया गया ।
    1. जब वायरस जैविक नमूना में मौजूद होने के लिए संदिग्ध हैं, एक गैर-ioinic surfactant (०.५% nonidet P40 स्थानापन्न) के २०० µ एल जोड़कर निष्क्रियता बफर तैयार ४० मिलीलीटर डिटेक्टर/नमूना मंदक, और भंवर जोरदार ।
    2. 15 मिनट के लिए १०,००० ग्राम में 4 डिग्री सेल्सियस पर ब्याज की analyte युक्त जैविक नमूने सेलुलर मलबे को दूर करने के लिए ।
    3. मिश्रण १८५ µ एल डिटेक्टर/नमूना मंदक या निष्क्रियता बफर के साथ १०० µ l जैविक नमूना (अंतिम कमजोर पड़ने फैक्टर 3) और 15 µ l विरोधी IFN-α एंटीबॉडी एक (प्रारंभिक एकाग्रता 1 mg/एमएल, अंतिम एकाग्रता ५० यूजी/ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    4. ऊपर बताए गए अनुसार एकल अणु सरणी विश्लेषक में एंटी-IFN-α एंटीबॉडी के साथ और बिना नमूने चलाएं ।
      नोट: संकेत संतृप्ति के मामले में, नमूने आगे पतला किया जाना चाहिए. इसके अलावा, ३०० µ एल मात्रा डुप्लिकेट विश्लेषण के लिए आवश्यक है ।

Figure 6
चित्रा 6: प्रोटीन प्रतियोगिता परख । प्रतियोगिता प्रयोगों पांच अलग SLE रोगियों से नमूनों का उपयोग किया गया । जैविक नमूनों में 15 मिनट के लिए १०.००० ग्राम में 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक थे । वे वायरल निष्क्रियता के लिए NP40 युक्त डिटेक्टर/नमूना मंदक के साथ 1/3 पतला थे । 15 µ l of anti-IFN-α एंटीबॉडी A (प्रारंभिक एकाग्रता 1 mg/अंतिम एकाग्रता ५० µ g/एमएल) या बफर ३०० µ एल की कुल मात्रा में जोड़ा गया था । मशीन 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर किया गया था । नियंत्रण समूह ग्रे और विरोधी IFN-α के साथ इलाज नमूनों में दिखाया गया है एंटीबॉडी काले रंग में दिखाए जाते हैं । ग्राफ से पता चलता है मतलब मूल्य और एसडी (त्रुटि सलाखों) । बिंदीदार रेखा लोद का प्रतिनिधित्व करता है (ाोएब = ०.०२४७७४, ०.८०३७ fg/ Rodero एट अल. २०१७ से अनुकूलित इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें कृपया ।

Representative Results

संक्षेप में, एक पैन-IFN-α एकल अणु सरणी परख ०.६९ fg/एमएल का पता लगाने की एक सीमा के साथ, कब्जा मोतियों के साथ लेपित एक 2-कदम विंयास का प्रयोग ०.३ मिलीग्राम/एमएल विरोधी IFN-α एक एंटीबॉडी और विरोधी IFN-α बी का पता लगाने एंटीबॉडी biotinylated में एक बायोटिन: एंटीबॉडी अनुपात में 30 का विकास हुआ । biotinylated डिटेक्शन एंटीबॉडी और एसबीजी के लिए उपयोग की जाने वाली सांद्रता क्रमशः ०.३ µ g/mL और १५० pM थी । यह अत्यधिक विशिष्ट परख सभी 13 IFN-α उपप्रकार का पता लगाने में सक्षम है और IFNs के अंय प्रकार के साथ प्रतिक्रिया पार नहीं है । इस प्रकार, जबकि यह संभव नहीं है की पहचान करने के लिए और IFN-α के प्रत्येक व्यक्ति प्रजातियों मात्रा, उन सभी का पता लगाया जा सकता है और एक साथ मापा IFN के लिए एक कुल एकाग्रता मूल्य दे-α, कि 13 विभिंन उपवर्गों शामिल हैं ।

इस नव विकसित परख के संभावित नैदानिक मूल्य का पता लगाने के लिए, IFN-α प्लाज्मा और सीरम में प्रोटीन स्वस्थ व्यक्तियों से मापा और SLE और JDM से पीड़ित रोगियों से नमूनों के साथ तुलना की गई । जैसा कि चित्रा 7में सचित्र, IFN-α प्रोटीन के उच्च स्तर दोनों रोग साथियों में स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में पाए गए । बिंदीदार रेखा एक पारंपरिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा की लोद इंगित करता है, illustrating कैसे इस दृष्टिकोण इन phenotypes के साथ इस cytokine के ज्ञात संघों के बावजूद इन रोगी समूहों में IFN-α प्रोटीन का पता नहीं होता । इसके अलावा, IFN-α परिमाण के 5 लॉग पर quantified हो सकता है, परख के व्यापक गतिशील रेंज illustrating, 1-10 fg/एमएल के बीच detectable स्तर के साथ परख के अत्यधिक संवेदनशील प्रकृति की पुष्टि ।

Figure 7
चित्रा 7: रोगी साथियों से प्लाज्मा और सीरम में IFN-α प्रोटीन की ठहराव । यह आंकड़ा Rodero एट अलसे संशोधित किया गया है । २०१७. स्वस्थ नियंत्रण से प्लाज्मा (n = 20) और SLE से पीड़ित रोगियों (n = ७२) और JDM (n = ४३) पान IFNα एकल अणु सरणी परख के साथ परीक्षण किया गया । विश्लेषण एक तरह से ANOVA परीक्षण (Kruskal-वालिस) और डन समूहों के बीच कई तुलना परीक्षण का उपयोग किया गया था । माध्य दर्शाया गया है । बिंदीदार रेखा एक संदर्भ मानव विरोधी IFN-α एलिसा (१.९५ स्नातकोत्तर/एमएल = १९५० fg/एमएल) के लोद को दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चरण विचार संदर्भ
1. एंटीबॉडी पेयर च्वाइस अलग epitopes लक्ष्य तालिका 2
उच्च अपनत्व
/धीमी कश्मीरपर तेजी से कश्मीर
2. एंटीबॉडी पेयर ओरिएंटेशन पता लगाने की निंनतम सीमा के साथ शर्तें चुनें चित्रा 1
3. कैद एंटीबॉडी एकाग्रता
4. बायोटिन: डिटेक्टर एंटीबॉडी अनुपात
5.2 बनाम 3-चरण विंयास उच्चतम संकेत के साथ शर्त चुनें: पृष्ठभूमि अनुपात चित्रा 2
6. डिटेक्टर एंटीबॉडी एकाग्रता पता लगाने की निंनतम सीमा के साथ शर्तें चुनें चित्रा 3
7. एसबीजी एकाग्रता
8. विशिष्टता क्रॉस-जेट का आकलन करें चित्र 4
9. संवेदनशीलता उपप्रकारों की मांयता का आकलन करें (यदि लागू हो)
10. Reproducibility परख परिवर्तनशीलता का आकलन चित्रा 5

तालिका 1: एक एकल अणु सरणी परख के विकास और अनुकूलन के लिए चरणों का सारांश । इस तालिका के विभिंन विकास और एक अणु सरणी परख के अनुकूलन के लिए आवश्यक कदम संक्षेप, एंटीबॉडी जोड़ी के प्रारंभिक विकल्प से reproducibility के आकलन तक ।

Antigen 8H1 (क) 12H5 (B) Sifalimumab Rontalizumab
IFNα1 २८.३ ५१.३ ४६० २२.६३
IFNα2 २५६३ १०.७ ९.०२ २.१५
IFNα4 ५.११ २.९९ ३५.३५ ३२५.३
IFNα5 २.०१ १९.६ ९३.२९ २.४९
IFNα6 ६४.७ ३.०३ ४.९७ -
IFNα7 ०.९ ०.६३ २३३.१ -
IFNα8 ३०२ ०.८३ ६९१ १०.८६
IFNα10 २.५४ ०.७१ ४३.२ -
IFNα14 ३२२४ २.१ १४.५२ ०.९
IFNα16 १.८३ ३२.९९ ५९.१८ २८.६५
IFNα17 २.२१ ०.७७ ८९०.९ २३.८६
IFNα21 २.७८ १२.८७ १७६९ ५.८

तालिका 2: Pan-अल्फ़ा एंटीबॉडी चयन । IC50 (एनजी/एमएल) इंटरफेरॉन-उत्तेजित प्रतिक्रिया तत्व (इसरे) का उपयोग कर निर्धारित-Luciferase बेअसर परख । टेबल सभी IFN-α उपप्रकार के लिए एक अणु सरणी परख में इस्तेमाल mAbs के IC50 मूल्यों से पता चलता है । १०,००० HEK २९३ MSR कोशिकाओं सफेद आधा क्षेत्र ९६ में वरीयता प्राप्त-अच्छी तरह से प्लेटें और रिवर्स-transfected के साथ ५० एनजी मिश्रित इसरे-जुगनू luciferase रिपोर्टर और Renilla luciferase निर्माता के निर्देशों के अनुसार अभिकर्मक एजेंट का उपयोग कर constructs । luciferase-एक्सप्रेस निर्माण एक आंतरिक सामांय नियंत्रण के रूप में कार्य किया । कोशिकाओं को कम सीरम मध्यम ०.१ mm अनावश्यक अमीनो एसिड, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, ०.५% भ्रूण गोजातीय सीरम पर ३७ ° c, 5% एक humidified वातावरण में2 CO के साथ पूरक में रात भर की मशीन थे । रात भर की गर्मी के बाद, कोशिकाओं रिकॉमबिनेंट मानव IFN के साथ या विरोधी IFN-α mAbs या नियंत्रण आईजीजी है कि ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए तैयार किया गया था के बिना मध्यम युक्त मिश्रण के साथ 24 घंटे के लिए प्रेरित किया गया । उत्तेजना के 24 ज के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार दोहरी luciferase संवाददाता परख प्रदर्शन किया गया । «-» निर्धारित नहीं है । Sifalimumab एक पूरी तरह से मानव है, immunoglobulin G1 κ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कि बांध और IFN-α उपप्रकार के बहुमत बेअसर; Rontalizumab IFN-α के विरुद्ध एक मानवतावादी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है. मेयेर एट अल. २०१६ और Rodero एट अल से अनुकूलित । २०१७.

अनुपूरक तालिका 1: एंटीबॉडी अभिविन्यास का चयन, मोतियों और biotinylation अनुपात पर एंटीबॉडी एकाग्रता पर कब्जा. दो संभावित विभिंन विंयास का परीक्षण किया गया, विरोधी IFN-α एक के रूप में कब्जा एंटीबॉडी और विरोधी IFN-α बी के रूप में पता लगाने एंटीबॉडी (एक), और इसके विपरीत (ख) का उपयोग कर । IFNα-2c प्रतिजन के रूप में इस्तेमाल किया गया था । विभिंन कैप्चर एंटीबॉडी सांद्रता के साथ ही बायोटिन: एंटीबॉडी (B:A) अनुपात भी दोनों विंयास के लिए परीक्षण किया गया । संतृप्ति (Sat) । नारंगी: लोद परिकलन के लिए उपयोग किए गए ाोएब मान; इन सांद्रता को खाली माना जाता था क्योंकि ाोएब मूल्यों में स्थिर रहे । लोद के रूप में परिकलित किया गया था Blank + 3SD. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

अनुपूरक तालिका 2:2 बनाम 3-चरण विंयास का परीक्षण । 2 और 3-चरण कॉन्फ़िगरेशन antigen के रूप में IFNα-2c का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था । ाोएब मान के साथ ही संकेत/पृष्ठभूमि राशन (S/B) दोनों स्थितियों के लिए दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक तालिका 3: डिटेक्टर और एसबीजी एकाग्रता अनुकूलन । तीन अलग सांद्रता के biotinylated डिटेक्टर एंटीबॉडी (०.१, ०.३, और ०.६ µ g/एमएल) के साथ तीन एसबीजी के विभिंन सांद्रता (५०, १५०, और २५० बजे) का मूल्यांकन किया गया । ाोएब मान नौ परीक्षण शर्तों के लिए दिखाए जाते हैं । नारंगी: लोद परिकलन के लिए उपयोग किए गए ाोएब मान; इन सांद्रता को खाली माना जाता था क्योंकि ाोएब मूल्यों में स्थिर रहे । लोद के रूप में परिकलित किया गया था Blank + 3SD. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें

अनुपूरक तालिका 4: विशिष्टता और अनुकूलित IFNα एकल अणु सरणी परख की संवेदनशीलता । मोतियों के प्रति औसत एंजाइम मान दिखाए जाते हैं जब IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω, और IFN-γ रिकॉमबिनेंट प्रोटीन का परीक्षण किया गया (A), एक साथ IFN-α (B) के 16 उपप्रकारों के साथ. «-» निर्धारित नहीं है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक तालिका 5: अनुकूलित IFNα एकल अणु सरणी परख के Reproducibility । सभी तीन स्वतंत्र रन के लिए मतलब ाोएब मूल्यों १०.००० fg/एमएल की एकाग्रता के लिए ऊपर दिखाए जाते हैं । «-» निर्धारित नहीं है । संतृप्ति (Sat) । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

अनुपूरक तालिका 6: प्रोटीन प्रतियोगिता परख । मोतियों के प्रति औसत एंजाइम मूल्यों का परीक्षण सभी स्थितियों के लिए दिखाया गया है. माप डुप्लिकेट में किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Discussion

साथ ही, हम मानव नमूनों में IFN-α प्रोटीन के प्रत्यक्ष ठहराव के लिए एक अत्यधिक reproducible, ultrasensitive एकल अणु सरणी डिजिटल एलिसा के विकास और सत्यापन का वर्णन ( 1 तालिकामें संक्षेप कदम) । परख के विकास में सबसे महत्वपूर्ण कदम में से एक एंटीबॉडी जोड़ी16का विकल्प है, कैनेटीक्स और epitope एक सफल परख के लिए महत्वपूर्ण जा रहा है बाध्यकारी के संदर्भ में विशेषताओं के साथ । यह एक ही epitope या कि कारण steric बाधा लक्ष्य युग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उपयोग से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. Polyclonal एंटीबॉडी पहचान एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ऐसी सीमाओं को दूर । यदि किसी भी कदम पर वांछित संवेदनशीलता प्राप्त नहीं है, आगे अनुकूलन संभावनाओं पर विचार किया जाना चाहिए । यह वैकल्पिक एंटीबॉडी जोड़े, प्रोटीन प्रकार (जैसे BSA < कैसिइन), पीएच (६.०-८.५), ईओण की शक्ति, बफर क्षमता (जैसे NaCl और फॉस्फेट सांद्रता), वाहक मोतियों के रूप में मापदंडों में परिवर्तन के उपयोग में शामिल हो सकते हैं, और/ मापदंडों की एक विस्तृत श्रृंखला जब एक एकल अणु सरणी परख विकसित कर अनुकूलित किया जाना है । हालांकि, कुल मिलाकर, स्थिति है कि उच्च संकेत दे: पृष्ठभूमि अनुपात और ंयूनतम LODs लोगों को पसंद कर रहे है ( चित्रा 1, चित्रा 2, और चित्रा 3देखें) ।

विशिष्टता के बारे में, IFN-α परख किसी भी अंय IFNs परीक्षण के लिए कोई क्रॉस जेट दिखाया (β, γ, λ1, λ2, ω) (चित्रा 4a) और सभी 13 IFN-α उपप्रकार (चित्रा 4b) का पता लगाने में सक्षम था । हालांकि, परख IFN-α2 उपप्रकार, (चित्रा 4b और अनुपूरक तालिका 4) के लिए एक कम अपनत्व दिखाया । दिलचस्प है, IFN-α2 (ए, बी, सी) के विभिंन वर्गों के लिए अलग संवेदनशीलता भी मनाया गया, जो अलग विनिर्माण प्रक्रियाओं या विभिंन एमिनो एसिड दृश्यों के कारण हो सकता है, के रूप में IFN-α2 उपप्रकार विभिंन वाणिज्यिक से प्राप्त किया गया आपूर्तिकर्ताओं. इस एकमात्र अपवाद के साथ, सभी IFN-α प्रजातियों बहुत ही प्रतिक्रिया दी । परख की विशिष्टता आगे विरोधी IFN-α एक क्लोन है, जो संकेत निष्प्रभाव (चित्रा 6 और अनुपूरक तालिका 6) के साथ नमूनों की पूर्व उपचार द्वारा प्रदर्शन किया गया ।

इस प्रौद्योगिकी का मुख्य लाभ में से एक है कि ब्याज की किसी भी analyte संभावित16लक्षित किया जा सकता है । इसके अलावा, विभिंन जैविक नमूनों का परीक्षण किया जा सकता है, जैसे सीरम, प्लाज्मा, मस्तिष्कमेरु द्रव, सेलुलर lysates, संस्कृति supernatants31 और यहां तक कि सांस३२। आमतौर पर, प्लाज्मा के एक 1:3 कमजोर पड़ने के लिए एक अणु सरणी विश्लेषक के संभावित कॉलेस्ट्रॉल से बचने के लिए किया जाता है । हालांकि, ब्याज की analyte प्रासंगिक जैविक नमूना में बहुत कम सांद्रता पर मौजूद हो सकता है और नमूना की उच्च सांद्रता (परख संवेदनशीलता पर निर्भर करता है)३३की आवश्यकता हो सकती है । हालांकि मल्टीप्लेक्स के लिए संभावित है, जबकि अच्छी संवेदनशीलता३४को बनाए रखने, यह एक और अधिक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया और एक ही प्रयोग के भीतर 6 से अधिक प्रोटीन को मापने के लिए परख है अभी तक३५विकसित किया जाना है ।

इस तरह कम सांद्रता पर साइटोकिंस और अंय जैविक प्रासंगिक प्रोटीन का पता लगाने और यों तो लगाता है३३,३६आवेदनों की एक पूरी नई रेंज खुल जाता है की क्षमता । यह सर्वविदित है कि कई प्रोटीन भी बहुत कम सांद्रता, जो अब तक सबसे अच्छा एलिसा३७का पता लगाने की सीमा से नीचे थे पर उनके प्रभाव डालती है । जबकि अंय immunoassay प्रौद्योगिकियों पारंपरिक एलिसा19से अधिक लाभ प्रदान करते हैं, हम यहां है कि एक अणु सरणी डिजिटल एलिसा प्रदर्शन कम एकाग्रता साइटोकिंस के ultrasensitive का पता लगाने के लिए एक reproducible और मजबूत मंच है मानव नमूने । इस तरह के रूप में, इस प्रौद्योगिकी के लिए भारी क्षमता प्रदान करता है की खोज और बेहतर रोगी प्रबंधन के रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

डीडी और YJC ANR (परियोजना IFNX, सं से समर्थन स्वीकार करते हैं । CE17001002) और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए ImmunoQure एजी । हम ब्रिजित बडेर-Meunier, Nathalia Bellon, क्रिस्टीन Bodemer, एलेक्स Belot, इसाबेल Melki, और पियरे Quartier नैदानिक नमूने प्रदान करने के लिए धंयवाद । YJC यूरोपीय अनुसंधान परिषद (GA ३०९४४९: YJC को फैलोशिप), और एक राज्य सब्सिडी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (फ्रांस) द्वारा प्रबंधित "भविष्य के लिए निवेश" कार्यक्रम के संदर्भ ANR-10-िाहु-01 असर के तहत स्वीकार किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone eBioscience BMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone eBioscience BMS216BK Not an ELISA kit but bulk abs
IFN α2c eBioscience BMS305 OK
IFN αI (17) PBL 11150-1
IFN α2a PBL 11100-1
IFN α2a PeproTech No longer available
IFN α2b PBL 11105-1
IFN α1 PBL 11175-1
IFN α4a (M1) PBL 11177-1
IFN α4b (a4) PBL 11180-1
IFN αB2 (a8) PBL 11115-1
IFN αC (a10) PBL 11120-1
IFN αD (a1) PBL 11125-1
IFN αG (a5) PBL 11135-1
IFN αF (a21) PBL 11130-1
IFN αH2 (a14) PBL 11145-1
IFN αJ1 (a7) PBL 11160-1
IFN αK (a6) PBL 11165-1
IFN αWA (a16) PBL 11190-1
IFN λ1 PeproTech 300-02L
IFN λ2 PeproTech 300-02K
IFN ω PeproTech 300-02J
IFN β PeproTech 300-02BC
IFN γ PeproTech 300-02
Anti-IFN-α ELISA PBL 41115.1
96-well plates Corning 3904
ISRE-Reporter Qiagen CCS-008L
Fu-GENE HD Transfection Reagent Promega E2311
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem ThermoFischer Scientific 31985062
Dual-Luciferase Reporter assay Promega E1910
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000 Thermo Scientific No longer available
Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres Merck Millipore UFC505096
Bead Conjugation Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic Beads Quanterix 101360
Bead Wash Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
EDC Fisher Scientific 11844071
Bead Blocking Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Bead Diluent Buffer Quanterix 101362
Detector and Sample Diluent Quanterix 101359
Biotinylation Reaction Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
NHS-PEG4-Biotin Fisher Scientific 11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) Thermo Scientific 75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) IKA MS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubes Eppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) ThermoFisher Scientific 12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) VWR 521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode Labels Quanterix 101652
15 mL Reagent Bottles Quanterix 102411
Simoa specimen 96-well plates Quanterix 101457
Simoa Discs Quanterix 100001
Simoa 2.0 conductive Tips Quanterix 101726
Simoa Cuvettes Quanterix 100803
Simoa SBG Reagent Quanterix 102295
Simoa RGP Reagent Quanterix 101736
Simoa System Buffer 1 Quanterix 100486
Simoa System Buffer 2 Quanterix 100487
Sealing Oil Quanterix 100206
ddH2O
Simoa HD-1 Analyzer Quanterix 100032
Technologies
Single molecule array (Simoa) Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems Singluex

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References

  1. Isaacs, A., Lindenmann, J. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).
  2. Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).
  3. Hunt, D., et al. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).
  4. Hooks, J. J., et al. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).
  5. Greenberg, S. A., et al. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).
  6. Crow, Y. J. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).
  7. Rodero, M. P., Crow, Y. J. Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).
  8. Lewis, J. A. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).
  9. Meager, A. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).
  10. Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).
  11. Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).
  12. Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).
  13. Li, Y., et al. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).
  14. Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858 (2011).
  15. Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  16. Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).
  17. Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. Whitepaper 1.0. Quanterix Corp. 1-2 (2013).
  18. Chang, L., et al. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).
  19. Yeung, D., et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).
  20. Song, L., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).
  21. Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236 (2015).
  22. Decalf, J., et al. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).
  23. Rabing Brix Petersen, E., et al. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).
  24. Disanto, G., et al. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).
  25. Song, L., et al. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).
  26. Passaes, C., et al. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296 (2017).
  27. Song, L., et al. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).
  28. Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).
  29. Meyer, S., et al. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).
  30. Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. Quanterix corporation. (2017).
  31. Rodero, M. P., et al. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).
  32. Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108 (2015).
  33. Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).
  34. Wilson, D. H., et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).
  35. Rivnak, A. J., et al. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).
  36. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).
  37. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).
विकास और एक Ultrasensitive एकल अणु सरणी डिजिटल एंजाइम के सत्यापन-मानव इंटरफेरॉन के लिए Immunosorbent परख से जुड़े-α
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Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).More

Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).

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