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Immunology and Infection

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

doi: 10.3791/57421 Published: June 14, 2018
* These authors contributed equally

Summary

여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

Abstract

이 프로토콜의 주요 목표는 개발 및 유효성 검사는 인터페론 (IFN)의 설명-α 단일 분자 배열 디지털 Enzyme-Linked ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA) 분석 결과. 이 시스템 수 있습니다 인간의 IFN-α 단백질의 정량화를 전례 없이 높은 감도, 그리고 아무 분 IFN의 다른 종족에 대 한.

프로토콜의 첫 번째 주요 단계 다음에 캡처 항 체의 활용 상자성 구슬과 biotinylation 탐지 항 체의 항 체 쌍의 선택입니다. 이 단계에 따라 최적의 감도 얻을 때까지 분석 결과 구성, 검출기 항 체 농도, 버퍼 구성 등의 다른 매개 변수를 수정할 수 있습니다. 마지막으로, 특이성, 재현성 메서드의 결과에 신뢰를 보장 하기 위해 평가 됩니다. 여기, 우리는 0.69 fg/mL 높은 선호도 자가 면역 polyendocrinopathy를 일으키는 면역 레 귤 레이 터 (아이) 단백질 biallelic 돌연변이 가진 환자에서 격리를 사용 하 여의 검출도 IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과 개발 증후군 종류 1/면역 polyendocrinopathy-칸디 다 증-ectodermal 영양 (APS1/APECED). 중요 한 것은, 이러한 항 체는 모든 13 IFN-α의 감지를 사용할 수 있습니다.

이 새로운 방법론 수 있습니다 검출 및 정량화 IFN-α 단백질의 attomolar 농도에서 인간의 생물 학적 샘플에서 처음으로. 이러한 도구는 매우 인간의 건강 및 질병 상태,이 사이토카인의 수준을 모니터링 하는 데 유용 있을 것입니다 대부분 특히 감염, 자가 면역, 그리고 autoinflammation.

Introduction

유형 I IFNs는 항 바이러스 면역 응답을 꾸미고 있는 중앙 역할 cytokines의 가족. 그들은 처음 발견 되었다이 삭과 Lindenmann 60 여 년 전1,2 , 그것은 지금 polypeptides의이 다른 유형의 가족 14 다른 서브 클래스 (13 IFN-α 하위 및 1 IFN-β) 구성 알려져. 유형과 유형 I IFNs는 바이러스 성 감염의 허가에 필수적인 하지만 또한 다양 한 인간의 질병 상태, 자가 면역 질환 반성 루 푸 스 (SLE), 청소년 dermatomyositis (JDM)를 포함 하 여의 병 리에 연루 되어 내가 interferonopathies 구성 유형에서 IFN 유도 신호 나 병 리3,,45,,67에 결과.

공부 유형 I IFN 단백질 수준의 생물 학적 샘플에 도전 하고있다 그것의 초기 식별 이후는 "방해 물질"1,2. 현재, 샌드위치 Enzyme-Linked ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA) IFN-α 단백질의 검출에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법 이다. 불구 하 고 특정, 간단 하 고 빠른, 종류와 같은 중요 한 한계를 제시 나 IFN ELISAs 감도 제한. 또한, 모든 IFN-α의 측정 자신의 감지 능력 및 감도 여러 분석 실험의 사용을 해야합니다. 상업적인 ELISAs IFN-α의 다른 하위를 검색 하는 동안, 그들의 감도 제한 됩니다 (1.95 pg/mL, 12.5 pg/mL, 및 12.5 pg/mL, 각각)는 종종 생물학 견본에서 IFN-α 단백질을 검출 하기 충분 하지 않습니다. 이 제한을 극복 하기 위해 분석 척도 개발 되었습니다 몇 가지 생물 학적 프록시 유형 I IFN 유도 유전자 발현 또는 기능 활동8,,910,11, 를 측정 하 여 12 , 13 , 14. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 분석 IFN-α 단백질의 직접 측정을 제공 하지 않습니다.

본이 연구에서는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 기술은 단일 IFN-α 단백질 분자의 검출에 대 한 분석 결과 개발에 사용 되었다. 그러나 디지털 ELISA 기존의 ELISA로 동일한 기본적인 화학, 반응 50000 개별 46 femtoliter 크기의 웰 스15,16으로 구성 된 배열에서 일어난다. 단일 단백질 분자는 항 체-코팅 된 상자성 구슬에 의해 점령 하 고는 biotinylated 탐지 항 체, 효소 공액, streptavidin-β-galactosidase (SBG)의 바인딩 다음으로 표시. 그 후, 구슬 fluorogenic 효소 기질, resorufin-β-D-galactopyranoside (까지), 단일 분자 배열에 함께 일시 중단 됩니다. 볼륨을 줄여 반응 2 십억 번17, 형광 신호의 높은 현지 농도 달성 하 고 단일 분자 수로 각 분자는 이제 안정적으로 될 수 있는 신호를 생성 가능 하 고, 될 측정18. 본질적으로 단일 분자 배열은 단일 immunocomplexes를 계산 하 고 구슬 (AEB) 당 효소의 평균 수를 결정 할 수 있다. 단백질 농도 immunocomplexed 구슬과 구슬에의 총 수 사이의 비율 사이 직접적인 상관으로 단백질 분자의 정량화/디지털화 허용 신호를 감지 하는 microwells를 계산 femtoliter 크기의 약 실입니다.

. 9 다른 기술 및 4 개의 cytokine immunoassays19다른 플랫폼 걸쳐 분석 결과 정밀도, 감도, 그리고 데이터 상관 관계를 비교 하는 것을 목적으로 사용 하는 광범위 한 크로스-플랫폼 평가 연구를 수행 합니다. 연구의 주요 조사 결과 중 하나는 단일 분자 배열 및 단일 분자 immunoassay 계산 하위-pg/mL 농도 범위 내 인간의 혈 청에서 cytokines의 검출에 대 한 높은 감도 제시 했다. 단일 분자 배열 디지털 ELISA cytokine 분석 실험 Crohn의 질병20, IFN-α interferonopathy 및 자동-면역 환자 7, 일리노이-6와 TNF-α의 역할을 연구 하기 사용 되 고 다른 post-translationally C-X-C의 형태 수정 만성 간염 및 건강 한 기증자 sitagliptin21,22수신 모티브 chemokine 10 (CXCL10) 당뇨병 성 망막 증23; 환자에 rhodopsin의 측정을 포함 하는 다른 응용 프로그램 neurofilament의 혈 청/플라즈마 측정을 통해 뇌 병 리의 연구에 빛 다 발성 경화 증 및 알 츠 하이 머 병의 맥락에서24 및 아 밀 로이드 β 1-42 펩 티 드25, 각각. HIV 바이러스 성 저수지26의 특성 등 향상 된 병원 체 감지 하 고 또한 DNA27 마이크로 RNAs28의 검출에 대 한 단일 분자 배열 분석 실험도 사용할 수 있습니다. 특정 항 체 쌍을 사용할 수 경우 관심의 어떤 분석에 대 한 분석 결과 개발 될 수 있는 단일 분자 배열 기술의 주요 이점은이 다용도입니다. 또한, 사제 시험 장비는 상업적으로 사용할 수 있는 프로토콜 아래의 수정 된 형태로 상세한 새로운 분석의 개발을 허용.

여기, 단 하나 분자 배열 분석 결과 대 한 개발 및 유효성 검사 단계에 대 한 자세한 설명은 IFN-α 단백질 검출에 대 한 향상 된 감도에 그 결과 제공 됩니다. 단일 분자 배열 분석 실험에 대 한 항 체는 매우 구체적인, (와 함께 종 특이성 경우 관련) 관련 단백질 교차 반응성을 피하 해야 합니다. 이상적으로, KD 10-9 M 보다 작은 항 체는 선택 되어야 한다; 높은 선호도 높은 신호 생산 강한 바인딩을 확인합니다. 항 체-항 원 바인딩의 활동 또한 중요 하 고, 빠른 K에 있으며 느린 K에서 항 원-항 체 복잡 한 어셈블리를 부탁 합니다. 항 체 쌍을 1-100 pg/ml, 탐지 (LOD)의 고전 ELISA에 좋은 성능을 시작 매우 민감한 단일 분자 배열 분석 결과 얻기의 가능성이 높아집니다. 장 및 동료 분석 감도18를 예측 하는 방정식의 세트를 제안 하 고 모든 단일 단계에서 발생 하는 바이오 상호 작용의 상세한 운동 연구 수행. 그들은 그 단일 분자 배열 디지털 ELISA 항 체 친 화력의 광범위 한 범위 내에서 효과적인 것 처럼 보였다 (KD ~ 10−11 -10−9 M), 뿐만 아니라 그 신호 발생은 더 많은 같은 항 체의에 속도에 의존.

높은 선호도 활용 하려면 우리 면역 polyendocrinopathy 증후군을 가진 환자에서 항 체 분리의 이용을 했다 항 체 1/면역 polyendocrinopathy-칸디 다 증-ectodermal 영양 (APS1/APECED)29를 입력 합니다. 이유로 아직 이해 되지 않는다, 아이 불충분 한 개인의 대다수는 모든 IFN-α 하위29에 대 한 높은 갈망 항 체의 코어 세트를 개발 하 고 우리는 상호 보완적인 바인딩 선호도의 두 안티-IFN-α 항 체 클론을 선택 다른 IFN-α 하위 유형에 대 한, IC50 값에 의해 추산 되. 단일 분자 배열 기술로 이러한 독특한 높은 친 화력 항 체의 조합 attomolar (fg/mL) 농도에서 IFN-α의 직접 정량화를 사용할 수 있습니다. 이러한 磁 IFN-α 단백질 검출 자연, 규칙 및 다른 질병에서 IFN 유도 응답의 생물 학적 영향의 더 나은 이해에 기여할 것입니다.

Protocol

1입니다. 항 체의 선택

  1. 프로토콜을 시작 하기 전에 모든 주요 단계 (표 1)을 검토 하 고 최적의 항 체를 선택 합니다.
    참고:이 프로토콜에 대 한 높은 선호도 안티-IFN-α 항 체-의 IC50는 표 2 에 설명 되어 선정 되었다. 우선적으로, 기존의 ELISA와 함께 잘 작동 하는 쌍을 선택 합니다.

2. 상자성 구슬과 다른 농도의 테스트를 캡처 항 체의 활용

참고: 항상 항 체 활용 과정에서 비드 활용 버퍼 (BCB) 구슬 워시 버퍼 (BWB) 얼음에 보관 합니다.

  1. 항 체 버퍼 교환 캡처
    1. 안티-IFN-α 항 체 테스트 3 다른 구슬 활용형 비율 (0.038 mg/mL, 0.075 m g/mL, 0.3 mg/mL) A의 초기 수량을 가져가 라.
      참고: 낮은 항 체 코팅 농도 분석 결과 높은 배경 신호를 제공 하는 경우 도움이 될 수 있습니다. 초기 항 체 양 버퍼 교환 과정에서 약된 30% 손실에 대 한 계정 합니다. 제조업체의 지침에 따라, 초기 배경 줄이기 위해 0.05 mg/mL, 0.1 mg/mL와 0.3 mg/mL의 농도 테스트, 정확한 값이 버퍼에서 상기 가변 손실로 인해 가져온 종종 있지만 exchange 프로세스입니다.
    2. BCB, 최대 500 µ L 함께 필터 열에 항 체의 필요한 볼륨을 추가 합니다.
    3. 원심에서 열 > 5 분을 통해 흐름 삭제 10000 x g.
    4. 두 번 BCB 원심 분리에 의해 다음의 450 µ L의 총 볼륨을 추가 하 여 열을 씻어 > 10000 x g 5 분에 대 한를 통해 흐름을 무시 하 고.
    5. 필터 열 깨끗 한 microcentrifuge 관으로 항 체를 포함 하는 것은 거꾸로 새로운 튜브의 내부를 직면 하 고 열의 열린 부분을 배치 하 고 1 분 동안 800 x g에서 원심.
      참고:이 단계는 치료 항 체의 컬렉션을 허용할 것 이다. 아니 버퍼 추가이 단계에 대 한 필요 합니다.
    6. 2.1.5에서 1 분 동안 800 x g에서 50 µ L BCB와 막 및 분리기 세척.
    7. 낮은 볼륨 분 광 광도 계를 사용 하 여 항 체의 농도 측정 합니다.
    8. BCB 원하는 항 체 농도 달성 하 고 최종 볼륨을 추가 합니다.
      참고: 200 µ L의 볼륨 프로토콜, 2 권 (2V)로 언급 되 고이 볼륨의 나머지 부분을 설명 하기 위해 사용 됩니다. 모든 다음 시 볼륨 따라 적응 될 것입니다.
    9. 와 동 그리고 얼음에 계속입니다.
  2. 상자성 비드 준비
    1. 전송 2.8 x 108 구슬 (100 µ L = 1V) microfuge 관으로.
      참고: 구슬의 볼륨 2.1.8에서 얻은 최종 볼륨에 따라 달라 집니다.
    2. 펄스 스핀 하 고 1 분에 대 한 자석 분리기에 넣어, 희석제, 폐기 자석에서 제거.
    3. BWB 5 소용돌이의 2V 추가 s.
    4. 2.2.2, 2.2.3 BWB와 두 번 그리고 BCB와 두 번 더 반복 합니다.
    5. 구슬의 1V에 대 한 190 BCB µ L, 소용돌이 5 s, 펄스 스핀을 추가 하 고 씻어 구슬 얼음에 저장 합니다.
  3. 비드 활성화
    1. 솔루션은 동 질 때까지 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC)와 소용돌이의 10 mg 유리병에 차가운 BCB의 1 mL를 추가 합니다.
    2. 구슬의 1V 씻어 구슬, 소용돌이, 그리고 실 온에서 30 분 1000 rpm에서 통에 차가운 희석된 EDC의 10 µ L를 추가 합니다.
      참고: EDC 준비와 구슬에 추가 할 수 수성 솔루션에 EDC 불안정으로 인해 가능한 한 빨리. 또한, EDC는 반응성이 매우 높은, 다른 유형의 구슬 활성화를 방지 하기 위해 EDC 추가 전에 균질 성 비드 정지는 중요 하다. EDC 추가 후 구슬에에서 유지 되어야 한다.
  4. 항 체의 비드 활용
    1. 소용돌이 펄스 활성화 구슬 회전. 이제 구슬 1 분에 대 한 자석 분리기에, 표면에 뜨는, BCB 삭제 넣고 자석에서 튜브를 제거.
    2. 워시 BCB의 2V와 구슬. 소용돌이, 펄스 스핀, 그리고 1 분에 대 한 자석 분리기에 넣어. 그런 다음 BCB 버퍼를 삭제 하 고 구슬 자석에서 제거.
    3. 신속 하 게 활성화 된 구슬에는 감기, 버퍼 교환 200 µ L (2V)의 항 체를 추가 합니다.
    4. 소용돌이 하 고 실 온에서 셰이 커에 2 h에 대 한 유지.
  5. 비드 차단 및 최종 정리
    1. 펄스 스핀 항 체 코팅 구슬 정지 1 분에 대 한 자석 분리기에 넣어, 새로운 튜브에는 상쾌한 전송 및 낮은 볼륨 분 광 광도와 농도 측정.
      참고:이 단계 구슬 포화 되는 여부에 정보를 제공할 것입니다-모든 값이 0 보다 구슬 채도-나타냅니다 구슬에 바인딩할 수 없습니다 녹는 항 체의 탐지 측정 될 것입니다.
    2. 자석에서 활용된 비즈를 제거, 1 분에 대 한 자석 분리기에 BWB, 5 s, 펄스 스핀 및 넣어 소용돌이의 2V를 추가 합니다.
    3. 새로운 튜브에는 상쾌한 전송 및 낮은 볼륨 분 광 광도 계를 사용 하 여 농도 측정.
      참고:이 단계 여부 항 체는 안정적으로 고정 하는 구슬에 정보를 제공 합니다. 이 상쾌한에 탐지 가능한 항 체 농도 정기적으로 일어나는 구슬에서 항 체의 분리를 표시 됩니다. 이 분석 결과 종종 캡처 항 체의 매우 적은 양을 남아 구슬에 부착 된 때에 작동 합니다.
    4. 자석에서 활용된 비즈를 제거, 1 분에 대 한 자석 분리기에 BWB, 5 s, 펄스 스핀 및 넣어 소용돌이의 2V를 추가 합니다.
    5. 자석에서 활용된 비즈를 제거, 구슬 차단 버퍼, 5 소용돌이의 2V 추가 s, 그리고 실 온에서 30 분 동안 통에서 품 어.
    6. 워시는 항 체-코팅 및 차단 된 비즈 구슬 희석제 버퍼와 한번 BWS와 함께 2V와 3 배 및 2 배 (모든 supernatants 삭제).
    7. 4 ° C에서 코팅 및 차단 구슬 구슬 희석제 버퍼의 2V와 함께 사용 될 때까지 저장 합니다.
      참고: 그냥 사용 하기 전에, 구슬 해야 합니다 세탁 한 번와 검출기/샘플 희석제 x 비드 볼륨/20, 250의 볼륨을 사용 하 여 자기 구분 기호를 사용 하 여.

3. 탐지 항 체 Biotinylation

  1. 탐지 항 체 버퍼 교환
    1. 두 안티-IFN-α Ab 클론의 260 µ g를 가져가 라.
      참고:이 고려 30% 손실 버퍼 교환 중 고 두 개의 다른 biotin/항 체 비율의 테스트 수 있습니다.
    2. BCB 대신 Biotinylation 반응 버퍼 (BRB)를 사용 하 여 2.1로 진행 합니다.
    3. 볼륨 및 항 체 농도 측정 하 고 1 mg/mL의 최종 농도 얻으려면 볼륨을 조정 합니다.
      참고:이 제안된 시작 농도 이지만 분석 결과 필요한 감도 달성 하지 않는 경우에 낙관 될 수 있다.
  2. 탐지 항 체 Biotinylation
    1. 실내 온도 N-hydroxysuccinimide-폴 리 에틸렌-glycol4-비타민 b 복합체 (NHS-PEG4-비타민 b 복합체)를 가져오고 3.4 m m 농도 달성 하기 위해 증류수의 400 µ L의 총 resuspend.
    2. 테스트 하 여 탐지 항 체와 희석된 biotin을 적절 하 게 혼합 비타민 b 복합체: 항 체 비율 결정 (후 60: 1 비율 같습니다 탐지 항 체의 100 µ L 및 biotin의 4.5 µ L).
      참고: 시작, 30: 1와 후 60: 1 비율을 테스트 합니다.
    3. 소용돌이 항 체-비오 틴 혼합, 회전 펄스 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
      참고: 흔들 필요 없음입니다.
  3. Biotinylated 탐지 항 체 정화
    1. 새 필터에 biotinylated 항 체를 전송 하 고 2.1, BRB 세척 단계 3을 수행으로 진행 (400, 450, 450 µ L) 및 최종 컬렉션.
    2. 볼륨 및 사용까지 정화, biotinylated 탐지 항 체 및 상점 4 ° C에서의 농도 측정 합니다.

4. 분석 결과 최적화

참고: 사제 구성30에 단일 분자 배열 분석기 소프트웨어의 사용.
단일 분자 배열 분석기 기계 외부 매개 변수를 수정 하려면 샘플 quantifications를 수행 하기 위해 시험 표준화를 실행 하도록 허용 하는 소프트웨어에 의해 제어 됩니다 (구슬, 검출기, SBG까지 농도; 샘플 희석...) 및 내부 매개 변수 (수 단계, 부 화 번...) 최적의 분석 조건을 달성 하기 결과 (배경, LOD, 수량)을 계산 하는 데 사용 수 있습니다. 최적화의 각에 필요한 시 약 볼륨을 계산 하 고 단일 분자 배열 분석기 설치 제조업체의 지침을 참조 하십시오. 2 단계 구성을 사용 하 여 최적화의 첫 번째 라운드를 수행 합니다.

  1. 두 구성에서 캡처 항 체 활용 된 구슬 및 biotinylated 탐지 항 체의 조합을 테스트 합니다.
    1. 테스트 세 가지 서로 다른 안티-IFN-α A의 조합 탐지 및 캡처 항 체, 그리고 2 개의 다른 안티-IFN-α B biotinylation 비율 항 체 농도 캡처 반대 (그림 1)에서 적절 한 조건을 선택 하 여 분석기 소프트웨어입니다.
    2. 가장 민감한 조합, 최저 LOD를 제공 하는 조건 즉, 선택 하 고 추가 단계에 대 한 그것을 사용 하 여
      참고: 그림 1 보여줍니다 어떻게 0.3 mg/mL 안티-IFN-α 항 체 비드 농도 및 안티-IFN-α B 항 체와 30: 1의 비타민 b 복합체: 항 체 비율 귀착되 었 다 높은 감도 11.6 fg/mL의 LOD에 의해 입증. ( 보충 표 1참조). 이 조합은 모든 이후 단계에 사용 됩니다. 공지 좋은 감도 최적화의 모든 라운드 하기 전에이 특정 분석 결과 함께 달성.

Figure 1
그림 1: 다양 한 항 체 방향, 구슬 및 biotinylation 비율에 항 체 농도 캡처. 서로 다른 두 가능한 구성을 테스트, 탐지 항 체 (A), 그리고로 캡처 항 체 및 안티-IFN-α B 안티-IFN-α A를 사용 하 여 반대 (B). IFNα-2 c 항으로 사용 되었다. 다른 캡처 항 체 농도 뿐만 아니라 비타민 b 복합체: 항 체 (B:A) 비율 구성 모두에 대 한 테스트도 했다. 점선 최고의 조건;에 대 한 LOD를 보여줍니다. 안티-IFN-α 30의 캡처 및 안티-IFN-α B biotin: 검출기 항 체 비로 0.3 mg/mL (LOD = 11.6 mg/mL 0.017265 AEB 값에 해당). 2 단계 구성 사용 되었다. 비타민 b 복합체: 항 체 (B:A). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 3 단계 구성 대 2를 비교 합니다.
    참고: 3 단계 구성에서 있다 3 개의 다른 외피 단계, 하나 캡처 항 체로, 탐지 항 체와 SBG 효소 라벨에 대 한 마지막 세 번째. 그러나, 2-단계 구성에서 캡처하고 탐지 항 체의 실정이와 동시에 알을 품는.
    1. 4.1.2 분석기, 다음 제조 업체의 지침30에 미리 구성 된 2 및 3 단계 구성 선택에서 캡처 및 검출기 항 체 농도와 비율 단일 분자 배열 분석기를 실행 합니다.
    2. 높은 감도 대 한 허용 하는 구성을 선택 하 고 미래 단계
      참고: 그림 2보충 표 2에서 같이 2 단계 구성이 했다 약간 높은 감도 및 신호/배경 비율 테스트 모든 농도 대 한. 따라서, 2-단계 구성에 대 한 미래 단계 유지 되었다.

Figure 2
그림 2: 2 vs 3 단계 구성 비교. 2 및 3 단계 구성 30 biotin: 항 체 비율 항 체 검출으로 캡처 및 안티-IFN-α B로 0.3 mg/mL의 안티-IFN-α는 항 체를 사용 하 여 평가 됐다. IFNα-2 c 항으로 사용 되었다. 3 단계 조건 설정에서 세 가지 다른 외피 단계, 하나 캡처 항 체로, 탐지 항 체와 SBG 효소 라벨에 대 한 마지막 세 번째가 있다. 그러나, 2-단계 구성에서 캡처하고 탐지 항 체의 실정이와 동시에 알을 품는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 검출기 항 체와 SBG 농도 최적화
    1. SBG의 3 개의 다른 농도와 검출기 항 체 (0.1, 0.3, 0.6 µ g/mL)의 3 개의 다른 농도 테스트 (50, 150, 250 분)30위에서 설명한 대로.
    2. 높은 감도 제공 하는 농도 선택 하 고 미래 단계에 대 한 그들을 유지.
      참고: 그림 3 은 그 검출기 0.3 µ g/mL와 SBG 150 오후 최적의 LOD는 조건을 했다. 이러한 조건은 또한 낮은 배경 수준 및 중간 진폭, 좋은 표준 편차 (SD) 값 (보충 표 3)을 생성 하는 동작을 했다. 전형적인 농도 0.1-사이 범위 1 µ g/l로 탐지 항 체 및 50-200 SBG, 오후 비록 높은 농도 (예: 최대 300 오후) 후자의 필요할 수 있습니다. 그것은 배경 0.02 AEB 보다 렌더링 하는 하지 않도록 해야 합니다. SBG 검출기 단일 클론 항 체 (mAb)의 농도 증가 하는 것은 신호 응답 및 배경 강화할 것 이다. 그러나, 신호에서 증가 surmounts 배경에서 변경, LOD 향상 됩니다. 상황 낮은 교정기 사이 더 나은 차별 백그라운드에서 감소 수 있습니다 발생할 수 있습니다.

Figure 3
그림 3: 검출기와 SBG 농도 최적화. SBG의 3 개의 다른 농도 함께 biotinylated 검출기 항 체 (0.1, 0.3, 0.6 µ g/ml)의 3 개의 다른 농도 (50, 150, 및 250 오후) 평가 했다. 점선 최고의 조건;에 대 한 LOD를 보여줍니다. 검출기 항 체 0.3 mg/mL와 SBG 150 오후 (LOD = 0.09 mg/mL 0.017184 AEB 값에 해당). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 추가 최적화 단계
    1. 필요한 감도, 달성 하지 되었습니다 경우 분석기 소프트웨어에서 미리 구성 된 옵션을 사용 하 여 다른 단계에 대 한 다른 보육 시간을 테스트 합니다.
    2. 분석 결과 충분히 감도 없으면, 분석기 소프트웨어에서 미리 구성 된 옵션을 사용 하 여 분석 결과 당 구슬의 수를 최적화 합니다.
      참고: 생물 학적 샘플 테스트 시작 되 면, 샘플 볼륨 추가 매개 변수 최적화에 취약입니다. 보건 및 안전 절차에 따라 샘플 처리 됩니다 있는지 확인 합니다.

5. 시험의 재현성 및 특이성

  1. IFN-α 분석 결과 특이성, 다른 IFN-α 하위와 다른 관련된 단백질 (그림 4a4b) 분석 결과 테스트 하 여 테스트 합니다.

Figure 4
그림 4: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 감도 및 특이성. (A) IFN β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω, 그리고 IFN-γ 재조합 단백질, IFN-α의 (B) 16 하위 함께 테스트 등 3 개의 IFN-α2 형식 (IFN-α2a, IFN-α2b, 및 IFN-α2c). Rodero 에서 적응. 2017 가이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 3 개의 독립적인 복제 실험을 수행 하 고 간 분석 결과 변화 (그림 5)를 평가 하 여 최적화 된 분석 결과의 재현성을 평가 합니다.
  2. 분석 결과의 LOD 계산
    주: LOD 계산 했다 3 개의 공백 + 3 표준 편차 (SD)의 평균을 사용 하 여 따라서 0.23 fg/mL의 값을 가져오는. 표준 샘플 희석 비율 1: 3으로 희석 비율의 포함 0.69 fg/mL의 LOD를 제공 합니다.

Figure 5
그림 5: 최적화 된 팬-IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과의 재현성. 3 개의 독립적인 실행 구슬의 두 개의 서로 다른 많은 사용 하 여 수행 했다. 두 번째 많은 대 한 두 개의 독립적인 실험을 수행 했다. 각 측정은 중복에 인수 되었다. 점선은 구슬 + SD 모든 실행의 의미 빈 평균 효소에 의해 정의 된 LOD를 나타냅니다. IFN-α17 그림 4b에서 같이 파생 된 표준 곡선의 모든 다른 IFN-α, 대표는 계정에 대 한 참조로 사용 되었다. 플롯 평균 값과 SD (오차 막대)를 표시합니다. 점선은 다른 실행;에 대 한 LOD를 보여 1: 0.073 fg/mL AEB 실행 0.006238, 2: 0.113 fg/mL AEB 실행 = 3: 0.043 fg/mL AEB를 실행 하는 0.007119 = 0.05518 =). Rodero 에서 적응. 2017 가이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

6. 단백질 경쟁 분석 결과

  1. 추가 분석 결과의 특이성을 설명 하기 위해 단백질 경쟁 분석 결과 ( 그림 6 전설에서 설명)를 수행 합니다.
    참고: SLE 환자에서 혈장 샘플 (n = 5) 사용 되었다.
    1. 바이러스는 생물 학적 샘플에 존재 하는 의심 되는 때 적극적으로 40 mL 검출기/샘플 희석제, 및 소용돌이를 비 ioinic 계면 활성 제 (0.5% nonidet P40 대체)의 200 µ L을 추가 하 여 비활성화 버퍼를 준비 합니다.
    2. 세포질 파편을 제거 하 4 ° C에서 15 분 동안 10000 g에서 분석을 포함 하는 생물 학적 샘플 원심
    3. 믹스 185 µ L 검출기/샘플 희석제 또는 비활성화 버퍼 100 µ L 생물 학적 샘플 (최종 희석 요인 3) 및 15 µ L 안티-IFN-α 항 체 A (초기 농도 1 mg/mL, 최종 농도 50 ug/mL) 또는 버퍼. 실 온에서 30 분 동안 품 어.
    4. 위에서 설명한 대로 단일 분자 배열 분석기 항 체 안티-IFN-α 없이 샘플을 실행 합니다.
      참고: 신호 채도 경우 샘플 한다 더 희석. 또한, 300 µ L 중복 분석에 필요한 볼륨입니다.

Figure 6
그림 6: 단백질 경쟁 분석 결과. 경쟁 실험 5 다른 SLE 환자에서 샘플을 사용 하 여 수행 했다. 생물 학적 샘플 10.000 g 4 ° c.에서 15 분에 centrifuged 했다 그들은 희석 된 검출기/샘플 희석제 NP40 바이러스 비활성화에 대 한 포함 된 1/3. 안티-IFN-α 항 체 A의 15µl (초기 농도 1 mg/mL, 최종 농도 50 µ g/mL) 또는 버퍼 추가 300 µ L. 총 볼륨에 인큐베이션 수행한 실 온에서 30 분 제어 그룹은 회색으로 표시 하 고 샘플으로 치료에 대 한 안티-IFN-α A 항 체는 검정색으로 표시 됩니다. 그래프는 평균값이 SD (오차 막대)를 보여 줍니다. 점선 LOD를 나타냅니다 (AEB = 0.024774, 0.8037 fg/mL). Rodero 외. 2017에서에서 적응 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Representative Results

요약 하자면, 0.69 fg/mL, 2 단계 구성을 사용 하 여 캡처 구슬의 검출 한계는 팬-IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과와 코팅 0.3 mg/mL의 안티-IFN-α는 항 체 및 안티-IFN-α B 탐지 항 체 biotinylated의 비타민 b 복합체: 항 체 비에 30 개발 되었다. Biotinylated 탐지 항 체 및 SBG 사용 농도 했다 0.3 µ g/mL 및 150 오후, 각각. 이 매우 구체적인 분석 결과 모든 13 IFN-α 하위 감지 수 이며 IFNs의 다른 유형으로 교차 반응 하지 않습니다. 따라서, 그것은 식별 하 고 IFN-α의 각 개별 종 계량 가능, 모두 검출 될 수 있다 고 함께 13 다른 서브 클래스를 구성 하는 IFN-α에 대 한 총 농도 값을 주는 측정.

이 새로 개발된 된 분석 결과의 잠재적인 진단 가치 탐험, 플라즈마와 건강 한 개인에서 혈 청 IFN-α 단백질 측정 하 고 SLE와 JDM 고통 받아 환자에서 샘플과 비교 했다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 건강 한 통제에 비교 하 여 두 질환 동료에 IFN-α 단백질의 높은 수준은 발견 했다. 점선은 어떻게이 이렇게 것 이다 감지 하지 IFN-α 단백질이이 고기가이 cytokine의 알려진된 연결에도 불구 하 고 이러한 환자 그룹을 보여주는 기존의 상용 ELISA의 LOD를 나타냅니다. 또한, IFN-α는 분석 결과, 분석 결과의 매우 민감한 성격을 확인 1-10 fg/mL 사이 감지 레벨의 넓은 동적 범위를 보여주는 5 로그의 크기를 통해 측정할 수 수 있습니다.

Figure 7
그림 7: 플라즈마와 동료 환자에서 혈 청 IFN-α 단백질의 정량화. 이 그림은 Rodero 에서 수정 되었습니다. 2017. 건강 한 컨트롤에서 플라즈마 (n = 20)와 SLE 고통 받는 환자 (n = 72) 및 JDM (n = 43) 팬 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과 함께 테스트 했다. 분석 비교 사용 하 여 단방향 ANOVA 테스트 (Kruskal-월리스)와 던의 여러 그룹 간의 테스트를 수행 했습니다. 중간값은 그려져 있습니다. 점선 참조 인간의 안티-IFN-α ELISA의 LOD를 나타냅니다 (1.95 pg/mL = 1950 fg/mL). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

단계 고려 사항 참조
1. 항 체 쌍 선택 대상 다른 epitopes 표 2
높은 선호도
K에빠른 / 느린 K에서
2. 항 체 쌍 방향 검출의 최저 제한 조건을 선택합니다 그림 1
3. 항 체 농도 캡처
4. biotin: 검출기 항 체 비율
5입니다. 2 대 3 단계 구성 높은 신호: 배경 비율 조건 선택 그림 2
6. 검출기 항 체 농도 검출의 최저 제한 조건을 선택합니다 그림 3
7. SBG 농도
8입니다. 특이성 분을 평가 그림 4
9입니다. 감도 (있는 경우)의 인식 평가
10입니다. 재현성 분석 결과 변화를 평가 그림 5

표 1: 개발 및 단일 분자 배열 분석 결과의 최적화를 위한 단계의 요약. 이 표에서 개발 및 재현성 평가까지 항 체 쌍의 초기 선택에서 단일 분자 배열 분석 결과의 최적화에 필요한 여러 단계를 요약 합니다.

항 원 8 H 1 (A) 12 H 5 (B) Sifalimumab Rontalizumab
IFNΑ1 28.3 51.3 460 22.63
IFNΑ2 2563 10.7 9.02 2.15
IFNΑ4 5.11 2.99 35.35 325.3
IFNΑ5 2.01 19.6 93.29 2.49
IFNΑ6 64.7 3.03 4.97 -
IFNΑ7 0.9 0.63 233.1 -
IFNΑ8 302 0.83 691 10.86
IFNΑ10 2.54 0.71 43.2 -
IFNΑ14 3224 2.1 14.52 0.9
IFNΑ16 1.83 32.99 59.18 28.65
IFNΑ17 2.21 0.77 890.9 23.86
IFNΑ21 2.78 12.87 1769 5.8

표 2: 팬-알파 항 체 선택. IC50 (ng/mL) 인터페론 자극 응답 요소 (ISRE)를 사용 하 여 결정-Luciferase 중화 분석 결과. 테이블의 모든 IFN-α 하위에 대 한 단일 분자 배열 분석 결과에 사용 되는 mAbs IC50 값을 보여 줍니다. 10000 HEK 293 MSR 셀 흰색 반 지역 96 잘 접시에 시드 되었고 50 ng 혼합 ISRE-반딧불 luciferase 기자와 Renilla luciferase 구문을 사용 하 여 transfection 시 약 제조업체의 지침에 따라 리버스 페. Luciferase 표현 구문 내부 정규화 컨트롤로 제공 됩니다. 셀은 불필요 한 아미노산은 0.1 m m, 1mm 나트륨 pyruvate, 37 ° C에서 0.5% 태아 둔감 한 혈 청, 5% CO2 습도 분위기에서 보충 감소 혈 청 매체에 하룻밤 incubated 했다. 하룻밤 배양 한 후 세포 재조합 인간 IFN-α 또는 안티-IFN-α mAbs 또는 제어 1 h 37 ° c.에 대 한 preincubated 했다 IgG 없이 혼합물을 포함 하는 매체와 24 h에 대 한 자극 했다 자극의 24 h 후 듀얼 luciferase 기자 분석 실험은 제조업체의 지침에 따라 수행 했다. «-» 결정 되지. Sifalimumab는 완전히 인간 면역 글로불린 g 1 κ 단일 클론 항 체에 바인딩하고; IFN-α의 대부분을 중화 하는 Rontalizumab은 IFN-α에 대 한 인간 답게 단일 클론 항 체 이다. 메이어 연구진이 2016 및 Rodero 그 외 여러분 에서 적응 2017입니다.

보충 표 1: 다양 한 항 체 방향, 구슬 및 biotinylation 비율에 항 체 농도 캡처. 서로 다른 두 가능한 구성을 테스트, 탐지 항 체 (A), 그리고로 캡처 항 체 및 안티-IFN-α B 안티-IFN-α A를 사용 하 여 반대 (B). IFNα-2 c 항으로 사용 되었다. 다른 캡처 항 체 농도 뿐만 아니라 비타민 b 복합체: 항 체 (B:A) 비율 구성 모두에 대 한 테스트도 했다. 채도 (토). LOD 계산; 사용 된 주황색: 브라질 우주국 값 이 농도 꾸준히 남아 AEB 값으로 빈 간주 됐다. LOD 의미 빈 + 3SD.로 계산 되었다 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 표 2: 2 vs 3 단계 구성의 테스트. 2, 3-단계 구성으로 항 원 c IFNα-2를 사용 하 여 평가 됐다. AEB 값 뿐만 아니라 신호/배경 식량 (S/B) 표시 됩니다 두 조건에 대 한. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 표 3: 검출기와 SBG 농도 최적화. SBG의 3 개의 다른 농도 함께 biotinylated 검출기 항 체 (0.1, 0.3, 0.6 µ g/mL)의 3 개의 다른 농도 (50, 150, 및 250 오후) 평가 했다. AEB 값 9 테스트 조건에 대 한 표시 됩니다. LOD 계산; 사용 된 주황색: 브라질 우주국 값 이 농도 꾸준히 남아 AEB 값으로 빈 간주 됐다. LOD 의미 빈 + 3SD.로 계산 되었다 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 표 4: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 감도 및 특이성. 구슬 값 당 평균 효소 IFN β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω, 그리고 IFN-γ 재조합 단백질은 시험 때 (A)의 IFN-α (B) 16 하위 함께 표시 됩니다. «-» 결정 되지. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 표 5: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 재현성. 모든 3 개의 독립적인 실행에 대 한 평균값 AEB 10.000 fg/mL의 농도를 표시 됩니다. «-» 결정 되지. 채도 (토). 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 표 6: 단백질 경쟁 분석 결과. 구슬 값 당 평균 효소 테스트 하는 모든 조건에 대 한 표시 됩니다. 측정은 중복에서 수행 했다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

여기, 우리 개발 및 인간의 샘플 ( 표 1에 요약 된 단계)에서 IFN-α 단백질의 직접 정량화에 대 한 높은 재현성, 磁 단일 분자 배열 디지털 ELISA의 유효성 검사를 설명 합니다. 분석 결과의 개발에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 쌍16, 속도 론 및 성공적인 분석 결과 핵심 되는 epitope 바인딩 특성의 선택입니다. 대상으로 동일한 epitope 또는 그 입체 장애를 일으킬 짝된 단일 클론 항 체의 사용을 피하기 위해 중요 하다. Polyclonal 항 체는 이러한 한계를 극복 하기 위해 탐지 항 체로 사용 될 수 있습니다. 어떤 주어진된 단계에서 원하는 감도 달성 되지 않은, 경우 추가 최적화 가능성 고려 되어야 한다. 이 대체 항 체 쌍, 매개 단백질 종류에에서 변화를 사용 하 여 포함 될 수 있습니다 (예: BSA < 카 제인), pH (6.0-8.5), 이온 강도, 버퍼링 용량 (예: NaCl 및 인산 염 농도), 캐리어 구슬, 또는 계면의 존재. 다양 한 매개 변수 절약 최적화 된 단일 분자 배열 분석 결과 개발할 때. 그러나, 전반적으로, 높은 신호: 배경 비율 및 최소한의 Lod를 주는 조건이 선호 하는 것 ( 그림 1, 그림 2그림 3참조).

특이성에 관한 IFN-α 분석 결과 다른 IFNs에 대 한 교차 반응 없음 테스트 (β, γ, λ1, λ2, ω) 보였다 (그림 4a)와 모든 13 IFN-α 하위 (그림 4b) 탐지 가능 했다. 그러나, 분석 결과 IFN-α2 하위 형식, (그림 4b보충 표 4)에 대 한 낮은 선호도 보였다. 흥미롭게도, IFN-α2 (a, b의 c)의 다른 클래스에 대 한 서로 다른 감도 또한 관찰 되었다, 고유 제조 절차 또는 다른 아미노산 시퀀스를 수 있는 IFN-α2 하위 했다 다른 상업적으로 공급 업체입니다. 이 유일한 예외와 함께 모든 IFN-α 종 매우 비슷한 응답 했다. 분석 결과의 특이성은 안티-IFN-α (그림 6보충 표 6) 신호를 폐지 한 복제와 샘플의 전처리에 의해 입증 되었습니다.

이 기술의 주요 장점 중 하나입니다 관심의 모든 분석 대상된16수 잠재적으로. 또한, 다른 생물 표본 테스트할 수 있습니다, 혈 청, 플라스마, 중추 신 경계, 세포 lysates, 문화 supernatants31 심지어 숨을32등. 일반적으로, 플라즈마의 1:3 희석 잠재적인 단일 분자 배열 분석기의 막힘을 피하기 위해 수행 됩니다. 그러나, 관심의 분석 관련 생물학 견본에서 매우 낮은 농도에서 존재 될 수 있고 샘플의 높은 농도 (분석 감도)에 따라 필요한33수 있습니다. 좋은 감도34유지 하면서 멀티플렉싱 가능성이 있지만, 그것은 더 많은 도전 과정 6 단백질 같은 실험에서 아직 수35개발 보다 큰 측정 분석 실험.

감지 하 여 cytokines와 같은 낮은 농도에 다른 생물학 관련 단백질 계량 능력 응용 프로그램33,36의 완전히 새로운 범위를 연다. 그것은 잘 알려진 수많은 단백질 인 지금까지 최고의 ELISAs37의 검출 한계 이하로 매우 낮은 농도 에서도 그들의 효과 발휘. 다른 immunoassay 기술을 기존의 ELISA19이점을 제공, 제시 여기 단일 분자 배열 디지털 ELISA는 낮은 농도에서 cytokines의 磁 탐지에 대 한 재현 가능 하 고 강력한 플랫폼 인간의 샘플입니다. 따라서,이 기술은 바이오 마커 발견과 다양 한 질병의 향상 된 환자 관리에 대 한 엄청난 잠재력을 제공합니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

DD와 안산 지원은 ANR에서 인정 (프로젝트 IFNX, 아니. CE17001002)와 단일 클론 항 체를 제공 하기 위한 ImmunoQure AG. 우리 감사 브리 짓 베이더 Meunier, 나탈리 아 Bellon, 크리스틴 Bodemer, 알렉스 Belot, 이자벨 Melki, 그리고 피에르 Quartier 임상 샘플 제공. 유럽 연구 위원회를 인정 하는 안산 (GA 309449: 안산 교제), 베어링 참고 ANR-10-IAHU-01 "미래 위한 투자" 프로그램 국가 연구 기관 (프랑스)에 의해 관리 되는 국가 보조금.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone eBioscience BMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone eBioscience BMS216BK Not an ELISA kit but bulk abs
IFN α2c eBioscience BMS305 OK
IFN αI (17) PBL 11150-1
IFN α2a PBL 11100-1
IFN α2a PeproTech No longer available
IFN α2b PBL 11105-1
IFN α1 PBL 11175-1
IFN α4a (M1) PBL 11177-1
IFN α4b (a4) PBL 11180-1
IFN αB2 (a8) PBL 11115-1
IFN αC (a10) PBL 11120-1
IFN αD (a1) PBL 11125-1
IFN αG (a5) PBL 11135-1
IFN αF (a21) PBL 11130-1
IFN αH2 (a14) PBL 11145-1
IFN αJ1 (a7) PBL 11160-1
IFN αK (a6) PBL 11165-1
IFN αWA (a16) PBL 11190-1
IFN λ1 PeproTech 300-02L
IFN λ2 PeproTech 300-02K
IFN ω PeproTech 300-02J
IFN β PeproTech 300-02BC
IFN γ PeproTech 300-02
Anti-IFN-α ELISA PBL 41115.1
96-well plates Corning 3904
ISRE-Reporter Qiagen CCS-008L
Fu-GENE HD Transfection Reagent Promega E2311
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem ThermoFischer Scientific 31985062
Dual-Luciferase Reporter assay Promega E1910
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000 Thermo Scientific No longer available
Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres Merck Millipore UFC505096
Bead Conjugation Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic Beads Quanterix 101360
Bead Wash Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
EDC Fisher Scientific 11844071
Bead Blocking Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Bead Diluent Buffer Quanterix 101362
Detector and Sample Diluent Quanterix 101359
Biotinylation Reaction Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
NHS-PEG4-Biotin Fisher Scientific 11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) Thermo Scientific 75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) IKA MS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubes Eppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) ThermoFisher Scientific 12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) VWR 521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode Labels Quanterix 101652
15 mL Reagent Bottles Quanterix 102411
Simoa specimen 96-well plates Quanterix 101457
Simoa Discs Quanterix 100001
Simoa 2.0 conductive Tips Quanterix 101726
Simoa Cuvettes Quanterix 100803
Simoa SBG Reagent Quanterix 102295
Simoa RGP Reagent Quanterix 101736
Simoa System Buffer 1 Quanterix 100486
Simoa System Buffer 2 Quanterix 100487
Sealing Oil Quanterix 100206
ddH2O
Simoa HD-1 Analyzer Quanterix 100032
Technologies
Single molecule array (Simoa) Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems Singluex

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References

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개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한
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Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).More

Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).

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