Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utvikling og validering av en Ultrasensitive ett molekyl Array Digital enzym knyttet Immunosorbent analysen for menneskelig Interferon-α

doi: 10.3791/57421 Published: June 14, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å beskrive utviklingen og validering av en enkelt molekyl matrise digital ELISA-analysen, som gjør det ultra-følsom påvisning av IFN-α undertypene i prøver fra mennesker.

Abstract

Hovedformålet med denne protokollen er å beskrive utviklingen og validering av en interferon (IFN)-α ett molekyl matrise digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent analysen (ELISA) analysen. Dette systemet muliggjør kvantifiseringen menneskelige IFN-α protein med enestående følsomhet og med ingen kryssreaktivitet for andre arter av IFN.

Første viktige skritt av protokollen er valget av antistoff paret, fulgt av Bøyning av fange antistoffer spinn perler, og biotinylation av gjenkjenning antistoffer. Etter dette trinnet kan ulike parametere som analysen konfigurasjon, detektor antistoff konsentrasjon og buffer komposisjon endres til optimal følsomhet er oppnådd. Til slutt, spesifisitet og reproduserbarhet metoden vurderes for å sikre tillit til resultatene. Her utviklet vi IFN-α ett molekyl array analysen med en grense på deteksjon av 0,69 fg/mL med høy affinitet autoantistoffer isolert fra pasienter med biallelic mutasjoner i autoimmune regulator (AIRE) protein forårsaker autoimmune polyendocrinopathy Syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Viktigere, aktivert disse antistoffene påvisning av alle 13 IFN-α undertyper.

Denne nye metodikken kan oppdage og kvantifisering IFN-α protein i menneskelig biologiske prøver i attomolar konsentrasjoner for første gang. Slikt verktøy vil være svært nyttig overvåke nivåene av denne cytokin i helse og sykdom stater, de fleste spesielt infeksjon autoimmunitet og autoinflammation.

Introduction

Type jeg IFNs er en familie av cytokiner som spiller en sentral rolle i orkestrering antiviral immunreaksjoner. De ble først oppdaget av Isaacs og Lindenmann 60 år siden1,2 , og det er kjent at denne heterogene familien av polypeptides består av 14 forskjellige underklasser (13 IFN-α subtyper og 1 IFN-β). Jeg IFNs er avgjørende for klarering av virusinfeksjoner, men har også vært innblandet i patologi av en rekke menneskelig sykdom stater, inkludert autoimmune sykdommer systemisk lupus erythematosus (SLE), juvenile dermatomyositis (JDM), og typen Jeg interferonopathies i hvilken konstituerende jeg IFN-indusert signalering resulterer i patologi,3,,4,,5,,6,,7.

Studere type I-IFN protein nivåer i biologiske prøver har vært utfordrende siden den innledende identifisering som en "konflikt stoff"1,2. Foreløpig er sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent analysen (ELISA) den mest brukte metoden for påvisning av IFN-α protein. Til tross for bestemt, enkel og rask, type jeg IFN ELISAs presenterer viktige begrensninger som begrenset følsomhet. I tillegg krever måling av alle IFN-α undertyper bruk av flere analyser hver med sin egen oppdagelsen kapasitet og følsomhet. Det finnes kommersielle ELISAs oppdage ulike undergrupper av IFN-α, deres følsomhet er begrenset (1.95 pg/mL, 12.5 pg/mL og 12,5 pg/mL, henholdsvis) som er ofte nok til å oppdage IFN-α protein i biologiske prøver. For å overkomme denne begrensningen, flere biologiske proxy analyser er utviklet for å kvantifisere skriver jeg IFN ved å måle indusert genuttrykk eller funksjonelle aktiviteten8,9,10,11, 12 , 13 , 14. likevel disse analyser ikke gir en direkte måling av IFN-α protein.

I denne studien ble ett molekyl matrise digital ELISA teknologi brukt til å utvikle en analysen for påvisning av enkelt IFN-α protein molekyler. Digital ELISA benytter den samme grunnleggende kjemien som konvensjonelle ELISA, men reaksjonen foregår i matriser bestående av 50.000 personlige 46 femtoliter størrelse brønner15,16. Enkelt protein molekyler er fanget av antistoff spinn perler og merket med et biotinylated gjenkjenning antistoff, etterfulgt av binding av et enzym konjugert, streptavidin-β-galactosidase (SBG). Deretter er perlene suspendert med en fluorogenic enzym underlaget, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), til enkelt-molekylet matriser. Ved å redusere volumet reaksjon 2 milliarder ganger17, høy lokal konsentrasjon av fluorescerende signalet er oppnådd og ett molekyl teller bli mulig, som hvert molekyl genererer et signal som kan nå bli pålitelig målt18. I hovedsak er ett molekyl matriser i stand til å telle enkelt immunocomplexes og bestemme en gjennomsnittlig antall enzymer per perle (AEB). Telle microwells der en signalet tillater kvantifisering/digitalisering av protein molekyler som det er en direkte sammenheng mellom protein konsentrasjon og forholdet mellom immunocomplexed-perler og totalt perler i femtoliter-størrelse kamrene.

Yeung et al. utført en omfattende plattformer evalueringsstudie bruker ni ulike teknologier og fire cytokin immunanalyser med sikte på å sammenligne analysen presisjon og følsomhet data sammenheng på tvers av ulike plattformer19. En av de viktigste resultatene av studien var at ett molekyl matriser og ett molekyl teller immunanalyse presentert høyeste følsomhet for gjenkjenning av cytokiner i humant serum innen sub-pg/mL konsentrasjonen. Ett molekyl matrise digital ELISA cytokin analyser har brukt til å studere rollen til TNF-α og IL-6 i Crohns sykdom20, IFN-α interferonopathy og auto-immune pasienter 7, og de forskjellige post-translationally endret former for C-X-C motiv chemokine 10 (CXCL10) i kronisk hepatitt og friske blodgivere mottar sitagliptin21,22. Andre programmer inkluderer måling av rhodopsin hos pasienter med diabetisk retinopati23; studiet av hjernen patologi gjennom serum/plasma målinger av neurofilament lys24 og amyloid-β 1-42 peptid25, i sammenheng med multippel sklerose og Alzheimers sykdom, henholdsvis. Ett molekyl matrise analyser kan også brukes for forbedret patogen gjenkjenning som karakteristikk av HIV viral reservoaret26og oppdagelsen av DNA27 og mikro RNAs28. En stor fordel av ett molekyl matrise teknologien er dette høy allsidighet, som analysen mot noen analytt rundt kan utvikles hvis et spesifikt antistoff par er tilgjengelig. I tillegg er homebrew analysen kits kommersielt tilgjengelig, slik at utviklingen av nye analyser, protokollen som er beskrevet i en modifisert form nedenfor.

Her vises en detaljert beskrivelse av utviklingen og validering trinnene for en enkel molekyl array analysen som resulterer i økt følsomhet for IFN-α proteinet oppdagelsen. Antistoffer for ett molekyl matrise analyser bør være svært spesifikke, unngå kryssreaksjon med relaterte proteiner (med arter spesifisitet hvis relevant). Ideelt sett bør antistoffer med en K-D mindre enn 10-9 M velges; høy affinitet sikrer sterke bindende, med produksjon av en høyere signal. The kinetics av antistoff-antigen bindingen er også viktig, og rask K treg Kav vil favorisere antigen-antistoff komplekse samlingen. Starter med et antistoff par som har en god ytelse i klassisk ELISA, med en grense for påvisning (LOD) av 1-100 pg/mL, øker sjansene for å få en svært følsom ett molekyl array analysen. Chang og kolleger utført detaljert kinetic studier av biomolecular samhandlinger på hvert enkelt trinn, foreslår et sett av likninger å forutsi analytisk følsomhet18. De viste at ett molekyl matrise digital ELISA synes å være effektive i et bredt spekter av antistoff slektskap (KD ~ 10−11 - 10−9 M), samt at signalet generasjon er mer avhengig på frekvensen av slike antistoffer.

For å utnytte høy affinitet skriver antistoffer vi tok fordel av antistoffer isolert fra pasienter med autoimmune polyendocrinopathy syndromet 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED)29. Grunner som ikke er ennå forstått, det store flertallet av AIRE-mangelfull enkeltpersoner utvikle et sett høy-avidity antistoffer mot alle IFN-α subtyper29, og vi merket to anti-IFN-α antistoff kloner av komplementære bindende slektskap for ulike IFN-α subtyper, som anslått ved IC50 verdier. Kombinasjonen av disse unike høy affinitet Antistoffene med ett molekyl matrise-teknologi aktivert direkte kvantifisering av IFN-α ved attomolar (fg/mL) konsentrasjoner. Slike ultrasensitive IFN-α proteinet oppdagelsen vil bidra til en bedre forståelse av natur, regulering og biologiske effekten av IFN-indusert respons i forskjellige sykdommen innstillinger.

Protocol

1. valg av antistoffer

  1. Før du begynner protokollen gjennom alle hovedtrinnene (tabell 1) og velg optimal antistoffer.
    Merk: For denne protokollen høy affinitet anti-IFN-α antistoffer - IC50 som er beskrevet i tabell 2 ble valgt. Fortrinnsvis, velge et par som fungerer godt med konvensjonelle ELISA.

2. Bøyning av fange antistoff spinn perler og Testing av ulike konsentrasjoner

Merk: Hold alltid perle Bøyning Buffer (BCB) og perle vask Buffer (BWB) på isen under antistoff Bøyning prosessen.

  1. Fange antistoff Buffer Exchange
    1. Ta første anti-IFN-α antistoff A for å teste 3 forskjellige perle conjugations prosenter (0.038 mg/mL, 0.075 mg/mL og 0,3 mg/mL).
      Merk: Lav antistoff belegg konsentrasjoner kan være nyttig hvis analysen presenterer et høye signal. Første antistoff antallet bør utgjør en anslagsvis 30% tap under buffer exchange prosessen. Ifølge produsentens instruksjoner og for å redusere første bakgrunn ble konsentrasjoner av 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL og 0,3 mg/mL testet, men nøyaktig disse verdiene ble ofte ikke oppnådd på grunn av nevnte variabel tap i bufferen prosess for Exchange.
    2. Legge til et bestemt volum av antistoffer i et filter kolonne med BCB, opptil 500 µL.
    3. Sentrifuge kolonnene på > 10 000 x g for 5 min og kast gjennomflytsenhet.
    4. Vask kolonnen to ganger ved å legge til et totalt volum på 450 µL BCB etterfulgt av sentrifugering på > 10 000 x g i 5 min og kast flyten gjennom.
    5. Plasser filteret kolonnen som inneholder antistoffer i et rent microcentrifuge rør opp ned - den åpne delen av kolonnen mot innsiden av det nye røret - og sentrifuge 800 x g for 1 min.
      Merk: Dette trinnet vil tillate samling av renset antistoffer. Ingen buffer tillegg kreves for dette trinnet.
    6. Vask membraner med 50 µL BCB og sentrifuger 800 x g i 1 min i 2.1.5.
    7. Måle konsentrasjonen av antistoff bruker et lavt volum spektrofotometer.
    8. Legge til BCB for å oppnå ønsket antistoff konsentrasjonen og Merk det siste bindet.
      Merk: Et volum på 200 µL brukes til å beskrive resten av protokollen, dette volumet blir referert til som 2 volumer (2V). Alle følgende reagens volumer kan tilpasses tilsvarende.
    9. Vortex og holde på is.
  2. Spinn perle forberedelse
    1. Overføre 2.8 x 108 perler (100 µL = 1V) inn i et microfuge rør.
      Merk: Antall perler er avhengig av det siste bindet innhentet i 2.1.8.
    2. Puls spinn og satt i et magnetisk skilletegn for 1 min, forkaste fortynner og fjerne fra magnet.
    3. Legge til 2V BWB og vortex 5 s.
    4. Gjenta 2.2.2 og 2.2.3 to ganger med BWB og to ganger med BCB.
    5. Legge til 190 µL BCB, vortex 5 s, puls spinn 1V av perler og lagre vasket perler på is.
  3. Perle aktivisering
    1. Legge til 1 mL kaldt BCB 10-mg ampuller med 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydroklorid (EDC) og vortex til løsningen er homogen.
    2. For 1V av perlene legge 10 µL av kaldt utvannet EDC vasket perler, vortex og holder i en shaker på 1000 rpm i 30 min ved romtemperatur.
      Merk: EDC forberedelse og tillegg til perler bør gjøres så raskt som mulig på grunn av EDC ustabilitet i vandige løsninger. Også EDC er svært reaktivt, er det viktig å ha en homogen perle suspensjon før EDC tillegg for å hindre heterogene perle aktivering. Etter EDC tillegg må perler holdes i suspensjon.
  4. Perle Bøyning av antistoffer
    1. Vortex og puls spinne aktivert perler. Nå legge perler i magnetiske skilletegn for 1 min, kaste BCB supernatant og fjerne røret fra magneten.
    2. Vask perler med 2V BCB. Virvelen, puls spinn, og innlegge magnetiske skillet for 1 min. Deretter kaste BCB bufferen og fjerner perler fra magneten.
    3. Raskt legge til de kalde, buffer-byttet 200 µL (2V) av antistoff aktivert perler.
    4. Vortex og holde 2 h i shaker ved romtemperatur.
  5. Perle blokkering og siste finpuss
    1. Puls spinn antistoff perler suspensjon, innlegge magnetiske skillet for 1 min, overføre nedbryting til en ny tube og måle konsentrasjonen med et lavt volum spektrofotometer.
      Merk: Dette trinnet vil gi informasjon om om perlene er mettet - verdier over null indikerer perle metning - påvisning av løselig antistoff kan ikke binde til perlene blir målbare.
    2. Fjerne konjugert perler fra magneten, legge 2V av BWB, vortex for 5 s, puls spinn og sett i magnetiske skillet for 1 min.
    3. Overføre nedbryting til en ny tube og måle konsentrasjonen med et lavt volum spektrofotometer.
      Merk: Dette trinnet vil gi informasjon om om antistoffer er stabilt fast til perler. Synlig antistoff konsentrasjon i denne nedbryting angir avdeling av antistoffer fra perler, som skjer regelmessig. Denne analysen fungerer ofte selv når svært små mengder fange antistoff forbli knyttet til perler.
    4. Fjerne konjugert perler fra magneten, legge 2V av BWB, vortex for 5 s, puls spinn og sett i magnetiske skillet for 1 min.
    5. Fjern konjugert perler fra magneten, Legg 2V perle blokkerer bufferen, vortex 5 s, og Inkuber i shaker i 30 min ved romtemperatur.
    6. Vask antistoff og blokkerte perler 3 x med 2V, en gang med BWS, og 2 x med perle fortynningsmiddel Buffer (kaste alle supernatants).
    7. Lagre belagt og blokkerte perler på 4° C før bruk med 2V perle fortynningsmiddel bufferen.
      Merk: Bare før bruk, perler må vaskes en gang med detektor/Sample fortynningsmiddel med et volum på 250 x perle volum/20, bruker magnetisk skilletegnet.

3. oppdagelsen antistoff Biotinylation

  1. Gjenkjenning antistoff Buffer Exchange
    1. Ta 260 µg to anti-IFN-α Ab kloner.
      Merk: Dette tar hensyn 30% tap under buffer utveksling og tillater testing av to forskjellige biotin/antistoff prosenter.
    2. Fortsette som 2.1 med Biotinylation reaksjon Buffer (BRB) i stedet for BCB.
    3. Måle volumet og antistoff konsentrasjonen og justere volumet for å få en endelig konsentrasjon av 1 mg/mL.
      Merk: Dette er en foreslått Start konsentrasjon, men det kan optimaliseres hvis analysen ikke oppnår ønsket reaksjonstid.
  2. Gjenkjenning antistoff Biotinylation
    1. Bringe den N-hydroxysuccinimide-polyetylen-glycol4-biotin (NHS-PEG4-Biotin) til romtemperatur og resuspend med totalt 400 µL destillert vann å oppnå en 3.4 mM konsentrasjon.
    2. Bestemme biotin: antistoff forholdet mellom test og blande gjenkjenning antistoff og utvannet biotin tilsvarende (60:1 forholdstallet lik 100 µL oppdagelsen antistoff og 4,5 µL av biotin).
      Merk: For å starte, prøv 30: 1 og 60:1 forhold.
    3. Vortex antistoff-biotin mix, puls spinn og ruge i 30 min ved romtemperatur.
      Merk: Du trenger ikke å riste.
  3. Biotinylated Detection antistoff rensing
    1. Overføre biotinylated antistoffer til et nytt filter og fortsett som 2.1, utfører 3 vask trinn med BRB (400, 450 og 450 µL) og en siste samling.
    2. Mål volum og konsentrasjonen av renset, biotinylated oppdagelsen antistoff og butikk på 4 ° C før bruk.

4. analysen optimalisering

Merk: Bruk av ett molekyl analyzer matriseprogramvaren i en Homebrew konfigurasjon30.
Ett molekyl matrise analyzer maskinen er kontrollert av programvare som lar deg kjøre analysen standardizations, for å utføre eksempel quantifications, for å endre eksterne parametere (perle, detektor, SBG, RGP konsentrasjoner; eksempel fortynninger...) og interne parametere (antall trinn, inkubasjon ganger...) å oppnå optimal analysen forhold, og kan også brukes til å beregne resultatene (bakgrunn, LOD, mengder). Oppsettet av ett molekyl matrise analysator og beregne reagens volumer kreves for hver runde av optimalisering, se produsentens instruksjoner. Utføre i første runde av optimalisering benytter en 2-trinns konfigurasjon.

  1. Teste kombinasjoner av fange antistoff-konjugerte perler og biotinylated gjenkjenning antistoff i begge konfigurasjoner.
    1. Teste kombinasjoner av tre forskjellige anti-IFN-α A fange antistoff konsentrasjoner med to forskjellige anti-IFN-α B biotinylation forhold som gjenkjenning og fange antistoffer, og vice versa (figur 1) ved valg av passende analyserer programvaren.
    2. Velg den mest sensitive kombinasjonen, at forholdene som gir den laveste LOD, og bruke den for ytterligere trinn
      Merk: Figur 1 viser hvordan en 0,3 mg/mL anti-IFN-α et antistoff bead konsentrasjon og biotin: antistoff forholdet 30: 1 med anti-IFN-α B antistoffer resulterte i den høyeste følsomheten, noe som gjenspeiles av en LOD 11,6 fg/ml. (Se utfyllende tabell 1). Denne kombinasjonen vil brukes for alle fremtidige skritt. Legg merke til at store følsomheten oppnådd med denne bestemte analysen før noen runder av optimalisering.

Figure 1
Figur 1: utvalg av antistoff orientering, fange antistoff konsentrasjon på perler og biotinylation forholdet. De to mulige ulike konfigurasjonene ble testet, med anti-IFN-α A fange antistoff og anti-IFN-α B som gjenkjenning antistoff (A) og vice versa (B). IFNα - 2c ble brukt som antigen. Forskjellige fange antistoff konsentrasjoner som biotin: antistoff (B:A) prosenter ble også testet for begge konfigurasjoner. Prikket linje viser LOD for den beste tilstanden; anti-IFN-α en 0,3 mg/mL som fangst og anti-IFN-α B biotin: detektor antistoff forhold mellom 30 (LOD = 11,6 mg/mL tilsvarer en AEB verdi på 0.017265). En 2-trinns konfigurasjon ble brukt. Biotin: antistoff (B:A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Sammenligne 2 og 3-trinns konfigurasjon.
    Merk: I en 3-trinns konfigurasjon er det tre forskjellige inkubasjon trinnene, med fangst antistoffer, med oppdagelsen antistoffer og en endelige tredje en for SBG enzym merkingen. Men i en 2-trinns konfigurasjon, fange og gjenkjenning antistoffer er ruges samtidig med analytt rundt.
    1. Kjøres det ett molekyl matrise analyserer med fangst og detektor antistoff konsentrasjon og prosenter 4.1.2 velge 2 og 3-trinns konfigurasjonene forhåndskonfigurert i analyser, følgende produsentens instruksjoner30.
    2. Velg konfigurasjonen som gir høyest følsomheten og beholde den for fremtidig trinn
      Merk: Som vist i figur 2 og supplerende tabell 2, 2-trinns konfigurasjonen ga litt høyere følsomhet og signal/bakgrunn forhold for hver konsentrasjon testet. Derfor ble 2-trinns konfigurasjonen holdt for fremtidige tiltak.

Figure 2
Figur 2:2 vs 3-trinns konfigurasjon sammenligning. 2 og 3-trinns konfigurasjonene ble vurdert med 0,3 mg/mL av anti-IFN-α et antistoff som fange og anti-IFN-α B som gjenkjenning antistoff 30 biotin: antistoff forholdet. IFNα - 2c ble brukt som antigen. I en 3-trinns tilstand finnes det tre forskjellige inkubasjon trinnene, med fangst antistoffer, med oppdagelsen antistoffer og en endelige tredje en for SBG enzym merking. Men i en 2-trinns konfigurasjon, fange og gjenkjenning antistoffer er ruges samtidig med analytt rundt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Detektor antistoff og SBG konsentrasjon optimalisering
    1. Teste tre ulike konsentrasjoner detektor antistoff (0,1 0,3 og 0,6 µg/mL) sammen med tre ulike konsentrasjoner av SBG (50 og 150 250 pM) idet beskrevet over30.
    2. Velg konsentrasjonene som gir høyest følsomheten og holde dem for fremtidige tiltak.
      Merk: Figur 3 viser at detektor 0,3 µg/mL og SBG 150 pM var forholdene som viste den optimale LOD. Disse forholdene også ga lav bakgrunn nivåer og middels amplitude, en virkemåte som produserer god standardavviket (SD) verdier (supplerende tabell 3). Typisk konsentrasjonene varierer mellom 0,1 - 1 µg/mL for gjenkjenning antistoff og 50-200 pM for SBG, selv om høyere konsentrasjoner (f.eks opp til 300 pM) av sistnevnte kan være nødvendig. Det er viktig å unngå forhold som vil gjengi bakgrunner høyere enn 0.02 AEB. Øker konsentrasjonen av detektor monoklonalt antistoff (mAb) eller SBG vil forbedre både signalet respons og bakgrunn. Men hvis økningen i signal surmounts endringen i bakgrunnen, vil LOD forbedre. En situasjon kan oppstå der en nedgang i bakgrunnen gjør bedre diskriminering mellom lav kalibratorer.

Figure 3
Figur 3: detektor og SBG konsentrasjon optimalisering. Tre ulike konsentrasjoner biotinylated detektor antistoff (0,1 0,3 og 0,6 µg/ml) sammen med tre ulike konsentrasjoner av SBG (50 og 150 250 pM) ble vurdert. Prikket linje viser LOD for den beste tilstanden; detektor antistoff 0,3 mg/mL og SBG 150 pM (LOD = 0.09 mg/mL tilsvarer en AEB verdi på 0.017184). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Ekstra optimering skritt
    1. Hvis ønsket reaksjonstid ikke er oppnådd, teste ulike inkubasjon tider for de ulike trinnene med forhåndskonfigurerte alternativene i analyserer programvaren.
    2. Hvis analysen ikke er følsomhet nok, optimalisere antall baller per analysen med forhåndskonfigurerte alternativene i analyserer programvaren.
      Merk: Når testingen av biologiske prøver begynner eksempel volumet er en ekstra parameter som er utsatt for optimalisering. Kontroller at prøver behandles i henhold til helse og sikkerhet prosedyrene.

5. analysen spesifisitet og reproduserbarhet

  1. Teste IFN-α analysen spesifisitet, ved å teste analysen med forskjellige IFN-α subtyper og andre relaterte proteiner (figur 4a og 4b).

Figure 4
Figur 4: spesifisitet og følsomhet for optimalisert IFNα ett molekyl array analysen. (A) IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω og IFN-γ rekombinante proteinene ble testet, sammen med (B) 16 undergrupper av IFN-α, inkludert IFN-α2 typer (IFN-α2a, IFN-α2b og IFN-α2c). Tilpasset fra Rodero et al. 2017. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Vurdere reproduserbarhet for optimalisert analysen ved å utføre tre uavhengige Repliker eksperimenter og vurdere mellom analysen variasjon (figur 5).
  2. Beregne LOD til analysen
    Merk: LOD ble beregnet med gjennomsnittet av tre rubrikkene + 3 standardavvik (SD), få verdien 0,23 fg/mL. Fortynningsfaktoren for standard utvalg er 1:3, gir inkludering av fortynningsfaktoren en LOD 0,69 fg/ml.

Figure 5
Figur 5: reproduserbarhet for optimalisert pan-IFN-α ett molekyl array analysen. Tre uavhengige kjører ble utført med to forskjellige partier av perler. For den andre tomten, ble to uavhengige eksperimenter utført. Hver måling ble kjøpt i duplikater. Den stiplede linjen representerer LOD, definert av mener tom gjennomsnittlig enzym per perle + SD over alle utførelser. IFN-α17 ble brukt som referanse, tatt i betraktning at avledede standardkurve er representant for alle andre IFN-α undertyper, som vist i figur 4b. Plottet viser middelverdien og SD (feilfelt). Stiplede linjer viser LOD i forskjellige går; Kjøre 1: 0.073 fg/mL AEB = 0.006238, kjøre 2: 0.113 fg/mL AEB = 0.007119, kjøre 3: 0.043 fg/mL AEB = 0.05518). Tilpasset fra Rodero et al. 2017. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

6. protein konkurranse analysen

  1. Utføre en protein konkurranse analyse (beskrevet i figur 6 legende) for å vise ytterligere spesifisiteten av analysen.
    Merk: Plasmaprøver fra pasienter med SLE (n = 5) ble brukt.
    1. Når virus er mistenkt for å være til stede i biologiske utvalget, forberede inaktivering bufferen ved å legge 200 µL av en ikke-ioinic surfactant (0,5% nonidet P40 erstatning) til 40 mL detektor/Sample fortynningsmiddel, og vortex kraftig.
    2. Sentrifuge biologiske prøver som inneholder analytt rundt 10.000 g i 15 min på 4 ° C fjerne mobilnettet rusk.
    3. Mix 185 µL detektor/Sample fortynner eller inaktivering buffer med 100 µL biologiske utvalg (siste fortynningsfaktoren 3) og 15 µL anti-IFN-α antistoff A (innledende konsentrasjon 1 mg/mL, siste konsentrasjon 50 ug/mL) eller bufferen. Inkuber i 30 min ved romtemperatur.
    4. Kjør eksempler med og uten anti-IFN-α antistoff ett molekyl matrise analyser som beskrevet ovenfor.
      Merk: Hvis signalet metning, prøver bør videre fortynnes. 300 µL er også volumet kreves for dupliserte analyse.

Figure 6
Figur 6: Protein konkurranse analysen. Konkurranse eksperimenter ble utført med eksempler fra fem forskjellige SLE pasienter. Biologiske prøver ble sentrifugeres 10.000 g i 15 min på 4 ° C. De ble utvannet 1/3 med detektor/Sample fortynner som inneholder NP40 for viral inaktivering. 15µl anti-IFN-α antistoff A (innledende konsentrasjon 1 mg/mL, siste konsentrasjon 50 µg/mL) eller bufferen ble lagt til et totalt volum på 300 µL. inkubasjon ble utført ved romtemperatur for 30 min. kontrollgruppe vises i grått og prøver behandlet med anti-IFN-α A antistoff vises i svart. Grafen viser middelverdien og SD (feilfelt). Stiplede linjen representerer LOD (AEB = 0.024774, 0.8037 fg/mL). Tilpasset fra Rodero et al. 2017 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Representative Results

Oppsummert belagt en pan-IFN-α ett molekyl array analysen med en grense på deteksjon av 0,69 fg/mL, med en 2-trinns konfigurasjon fange perler med 0,3 mg/mL av anti-IFN-α et antistoff og anti-IFN-α B oppdagelsen antistoff biotinylated i biotin: antistoff forholdet 30 ble utviklet. Konsentrasjonen biotinylated gjenkjenning antistoff og SBG var 0,3 µg/mL og 150 pM, henholdsvis. Denne svært spesifikke analysen er stand til å oppdage alle 13 IFN-α undertyper og reagerer ikke krysse med andre typer IFNs. Således, mens det ikke er mulig å identifisere og telle hver individuelle arter av IFN-α, alle kan oppdages og målt sammen gir en total konsentrasjon verdi for IFN-α, som består av de 13 forskjellige underklassene.

For å utforske den potensielle diagnostiske verdien av denne nyutviklet analysen, IFN-α protein i plasma og serum fra friske individer ble målt og sammenlignet med prøver fra pasienter som lider av SLE og JDM. Som illustrert i figur 7, ble høye nivåer av IFN-α protein oppdaget i både sykdom kohorter i forhold til sunn kontroller. Den stiplede linjen angir LOD av en konvensjonell kommersielt tilgjengelig ELISA, illustrerer hvordan denne tilnærmingen vil ikke oppdage IFN-α protein i gruppene pasienten tross kjent sammenslutninger av denne cytokin med disse fenotyper. Videre kan IFN-α kvantifiseres over 5 logger av omfanget, illustrerer det bredt dynamisk området av analysen, med Detektbart nivåer mellom 1-10 fg/mL bekrefter analysen svært følsomme natur.

Figure 7
Figur 7: kvantifisering av IFN-α protein i plasma og serum fra pasienten kohorter. Dette tallet er endret fra Rodero et al. 2017. plasma fra sunn kontroller (n = 20) og pasienter som lider av SLE (n = 72) og JDM (n = 43) ble testet med pan-IFNα ett molekyl array analysen. Analyse ble gjennomført med enveis ANOVA test (Kruskal-Wallis) og Dunns flere sammenligning tester mellom grupper. Median er avbildet. Prikket linje angir LOD av en referanse menneskelige anti-IFN-α ELISA (1.95 pg/mL = 1950 fg/mL). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Trinn Betraktninger Referanse
1. antistoff par valg Målet forskjellige epitopes Tabell 2
Høy affinitet
Raskt K/ treg Kav
2. antistoff par orientering Velg betingelser med laveste grense for påvisning Figur 1
3. fange antistoff konsentrasjon
4. biotin: detektor antistoff forholdet
5. 2 mot 3-trinns konfigurasjon Velg betingelse med høyeste Signal: bakgrunn forholdet Figur 2
6. detektor antistoff konsentrasjon Velg betingelser med laveste grense for påvisning Figur 3
7. SBG konsentrasjon
8. spesifisitet Vurdere kryssreaktivitet Figur 4
9. følsomhet Vurdere anerkjennelse av undertyper (hvis aktuelt)
10. reproduserbarhet Vurdere analysen variasjon Figur 5

Tabell 1: Sammendrag av trinnene for utvikling og optimalisering av en enkelt molekyl array analysen. Denne tabellen oppsummerer de ulike trinnene som kreves for utvikling og optimalisering av en enkelt molekyl array analysen, fra det første valget av antistoff par til vurdering av reproduserbarhet.

Antigen 8H 1 (A) 12H 5 (B) Sifalimumab Rontalizumab
IFNΑ1 28,3 51,3 460 22.63
IFNΑ2 2563 10.7 9.02 2.15
IFNΑ4 5.11 2.99 35.35 325.3
IFNΑ5 2.01 19.6 93.29 2.49
IFNΑ6 64.7 3.03 4.97 -
IFNΑ7 0,9 0,63 233.1 -
IFNΑ8 302 0,83 691 10.86
IFNΑ10 2,54 0.71 43.2 -
IFNΑ14 3224 2.1 14.52 0,9
IFNΑ16 1.83 32.99 59.18 28.65
IFNΑ17 2,21 0.77 890.9 23.86
IFNΑ21 2,78 12.87 1769 5.8

Tabell 2: Pan-alfa antistoff utvalg. IC50 (ng/mL) bestemmes ved hjelp av interferon-stimulert svar elementet (ISRE)-Luciferase nøytralisering analysen. Tabellen viser IC50 verdier av mAbs brukt i ett molekyl array analysen for alle IFN-α undertyper. 10.000 HEK 293 MSR celler ble sådd i hvite halv-området 96-brønns plater og omvendt-transfekterte med 50 ng Forhåndsblandet ISRE-Firefly luciferase reporter og Renilla luciferase konstruksjoner bruker transfection reagenser i henhold til produsentens instruksjoner. Den luciferase-uttrykke konstruere servert som en intern normalisering kontroll. Cellene ble inkubert overnatting i redusert Serum Medium med 0,1 mM unødvendige aminosyrer, 1 mM natrium pyruvate, 0,5% fosterets bovin serum på 37 ° C, 5% CO2 i en fuktet atmosfære. Etter natten inkubasjon ble celler stimulert 24 h med medium som inneholder blandinger av rekombinant menneskelige IFN-α med eller uten anti-IFN-α mAbs eller kontroll IgG som hadde vært preincubated 1t på 37 ° C. Etter 24 timer av stimulering, ble dobbelt luciferase reporter analyser utført i henhold til produsentens instruksjoner. «-» Ikke bestemt. Sifalimumab er et fullstendig menneske, immunglobulin G1 κ monoklonalt antistoff binder til og nøytraliserer flertallet av IFN-α subtyper; Rontalizumab er et humanized monoklonalt antistoff mot IFN-α. Tilpasset fra Meyer et al. 2016 og Rodero et al. 2017.

Supplerende tabell 1: utvalg av antistoff orientering, fange antistoff konsentrasjon på perler og biotinylation forholdet. De to mulige ulike konfigurasjonene ble testet, med anti-IFN-α A fange antistoff og anti-IFN-α B som gjenkjenning antistoff (A) og vice versa (B). IFNα - 2c ble brukt som antigen. Forskjellige fange antistoff konsentrasjoner som biotin: antistoff (B:A) prosenter ble også testet for begge konfigurasjoner. Metning (Sat). Orange: AEB verdier som ble brukt til LOD beregning; disse konsentrasjonene ble ansett tomt som AEB holdt seg jevnt. LOD ble beregnet som betyr tom + 3SD. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 2: Test av 2 vs 3-trinns konfigurasjonen. 2 og 3 - trinn konfigurasjonene ble vurdert ved hjelp IFNα - 2c som antigen. AEB vises også som signal/bakgrunn rasjoner (S/B) for begge betingelsene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 3: detektor og SBG konsentrasjon optimalisering. Tre ulike konsentrasjoner biotinylated detektor antistoff (0,1 0,3 og 0,6 µg/mL) sammen med tre ulike konsentrasjoner av SBG (50 og 150 250 pM) ble vurdert. AEB vises for ni testet forhold. Orange: AEB verdier som ble brukt til LOD beregning; disse konsentrasjonene ble ansett tomt som AEB holdt seg jevnt. LOD ble beregnet som betyr tom + 3SD. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 4: spesifisitet og følsomhet for optimalisert IFNα ett molekyl array analysen. Gjennomsnittlig enzym per perler verdier vises når IFN-β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω og IFN-γ rekombinante proteinene ble testet (A), sammen med 16 subtyper av IFN-α (B). «-» Ikke bestemt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 5: reproduserbarhet for optimalisert IFNα ett molekyl array analysen. Mener AEB verdiene for alle tre uavhengige kjører vises til en konsentrasjon av 10.000 fg/mL. «-» Ikke bestemt. Metning (Sat). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 6: Protein konkurranse analysen. Gjennomsnittlig enzym per perler vises for alle forhold testet. Målinger ble gjort i duplikat. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Her, beskrev vi utvikling og validering av en svært reproduserbare, ultrasensitive ett molekyl matrise digital ELISA for direkte kvantifisering IFN-α protein i prøver fra mennesker (trinn oppsummert i tabell 1). En av de viktigste trinnene i utviklingen av analysen er valg av antistoff par16, med egenskaper kinetics og epitope bindingen er nøkkelen til en vellykket analysen. Det er viktig å unngå bruk av sammenkoblede monoklonale antistoffer som målrette den samme epitope eller som forårsake steric hinder. Polyklonale antistoffer kan brukes som gjenkjenning antistoffer for å overvinne slike begrensninger. Hvis ønsket følsomheten ikke oppnås i noen bestemt trinn, bør ytterligere optimalisering muligheter vurderes. Dette kan omfatte bruk av alternativ antistoff par, endringer i parametere for eksempel protein (f.eks BSA < kasein), pH (6.0 8.5), ionisk styrke, bufring kapasitet (f.eks NaCl og fosfat konsentrasjoner), bærer perler, og tilstedeværelsen av tensider. En rekke parametere optimaliseres con når du utvikler en enkelt molekyl array analysen. Men samlet forhold som gir høy signal: bakgrunn prosenter og minimal LODs er de foretrukne (se figur 1, figur 2og Figur 3).

Om spesifisitet, IFN-α analysen viste ingen kryssreaksjon for noen andre IFNs testet (β, γ, λ1, λ2, ω) (figur 4a) og var i stand til å oppdage alle 13 IFN-α undertyper (figur 4b). Analysen viste imidlertid en lavere for IFN-α2 undertypen, (figur 4b og supplerende tabell 4). Interessant, ble ulike følsomhet for ulike klasser av IFN-α2 (a, b, c) også observert, som kan skyldes forskjellige produksjonsmetoder eller annen amino acid sekvenser, som IFN-α2 subtyper Hentet fra ulike kommersielle leverandører. Med dette unntaket ga alle IFN-α arter ligner svar. Spesifisiteten av analysen ble ytterligere demonstrert av forbehandling av prøvene med anti-IFN-α en klone, som avskaffet signalet (figur 6 og supplerende tabell 6).

En av de viktigste fordelene med denne teknologien er at noen analytt rundt kan potensielt være målrettet16. Videre kan ulike biologiske prøver bli testet, som serum, plasma, Cerebrospinalvæske, mobil lysates, kultur supernatants31 og med pusten32. Vanligvis utføres en 1:3 fortynning av plasma for å unngå potensielle tilstopping av ett molekyl matrise analysator. Men analytt rundt kan være tilstede på svært lave konsentrasjoner i relevante biologiske utvalget og høyere konsentrasjoner av prøven kan være nødvendig (avhengig av analysen sensitivitet)33. Selv om det er potensial for multiplexing samtidig opprettholde god følsomhet34, er det en mer utfordrende prosess og analyser for å måle større enn 6 proteiner i samme eksperimenter har ennå å bli utviklet35.

Muligheten til å oppdage og kvantifisere cytokiner og andre biologiske relevante proteiner på slike lave konsentrasjoner åpner opp en rekke nye programmer33,36. Det er kjent at mange proteiner utøve deres effekter på svært lave konsentrasjoner som til nå var under grensen for påvisning av de beste ELISAs37. Andre immunanalyse teknologier tilbyr fordeler fremfor konvensjonelle ELISA19, viser vi her at ett molekyl matrise digital ELISA er en reproduserbar og robust plattform for ultrasensitive påvisning av lav konsentrasjon cytokiner i prøver fra mennesker. Som sådan, tilbyr denne teknologien enorme potensialet for biomarkør oppdagelse og forbedret pasient ledelse av en rekke sykdommer.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

DD og YJC anerkjenner støtte fra ANR (Project IFNX, ingen. CE17001002) og ImmunoQure AG for å gi monoklonale antistoffer. Vi takker Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki og Pierre Quartier for å gi kliniske eksempler. YJC erkjenner europeiske forskningsråd (GA 309449: kameratskap til YJC), og et statlig tilskudd administreres av National Research Agency (Frankrike) under programmet "Investeringer for the Future" bærer referansen ANR-10-IAHU-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone eBioscience BMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone eBioscience BMS216BK Not an ELISA kit but bulk abs
IFN α2c eBioscience BMS305 OK
IFN αI (17) PBL 11150-1
IFN α2a PBL 11100-1
IFN α2a PeproTech No longer available
IFN α2b PBL 11105-1
IFN α1 PBL 11175-1
IFN α4a (M1) PBL 11177-1
IFN α4b (a4) PBL 11180-1
IFN αB2 (a8) PBL 11115-1
IFN αC (a10) PBL 11120-1
IFN αD (a1) PBL 11125-1
IFN αG (a5) PBL 11135-1
IFN αF (a21) PBL 11130-1
IFN αH2 (a14) PBL 11145-1
IFN αJ1 (a7) PBL 11160-1
IFN αK (a6) PBL 11165-1
IFN αWA (a16) PBL 11190-1
IFN λ1 PeproTech 300-02L
IFN λ2 PeproTech 300-02K
IFN ω PeproTech 300-02J
IFN β PeproTech 300-02BC
IFN γ PeproTech 300-02
Anti-IFN-α ELISA PBL 41115.1
96-well plates Corning 3904
ISRE-Reporter Qiagen CCS-008L
Fu-GENE HD Transfection Reagent Promega E2311
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem ThermoFischer Scientific 31985062
Dual-Luciferase Reporter assay Promega E1910
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000 Thermo Scientific No longer available
Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres Merck Millipore UFC505096
Bead Conjugation Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic Beads Quanterix 101360
Bead Wash Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
EDC Fisher Scientific 11844071
Bead Blocking Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Bead Diluent Buffer Quanterix 101362
Detector and Sample Diluent Quanterix 101359
Biotinylation Reaction Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
NHS-PEG4-Biotin Fisher Scientific 11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) Thermo Scientific 75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) IKA MS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubes Eppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) ThermoFisher Scientific 12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) VWR 521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode Labels Quanterix 101652
15 mL Reagent Bottles Quanterix 102411
Simoa specimen 96-well plates Quanterix 101457
Simoa Discs Quanterix 100001
Simoa 2.0 conductive Tips Quanterix 101726
Simoa Cuvettes Quanterix 100803
Simoa SBG Reagent Quanterix 102295
Simoa RGP Reagent Quanterix 101736
Simoa System Buffer 1 Quanterix 100486
Simoa System Buffer 2 Quanterix 100487
Sealing Oil Quanterix 100206
ddH2O
Simoa HD-1 Analyzer Quanterix 100032
Technologies
Single molecule array (Simoa) Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems Singluex

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Isaacs, A., Lindenmann, J. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).
  2. Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).
  3. Hunt, D., et al. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).
  4. Hooks, J. J., et al. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).
  5. Greenberg, S. A., et al. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).
  6. Crow, Y. J. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).
  7. Rodero, M. P., Crow, Y. J. Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).
  8. Lewis, J. A. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).
  9. Meager, A. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).
  10. Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).
  11. Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).
  12. Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).
  13. Li, Y., et al. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).
  14. Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858 (2011).
  15. Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  16. Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).
  17. Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. Whitepaper 1.0. Quanterix Corp. 1-2 (2013).
  18. Chang, L., et al. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).
  19. Yeung, D., et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).
  20. Song, L., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).
  21. Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236 (2015).
  22. Decalf, J., et al. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).
  23. Rabing Brix Petersen, E., et al. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).
  24. Disanto, G., et al. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).
  25. Song, L., et al. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).
  26. Passaes, C., et al. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296 (2017).
  27. Song, L., et al. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).
  28. Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).
  29. Meyer, S., et al. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).
  30. Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. Quanterix corporation. (2017).
  31. Rodero, M. P., et al. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).
  32. Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108 (2015).
  33. Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).
  34. Wilson, D. H., et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).
  35. Rivnak, A. J., et al. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).
  36. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).
  37. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).
Utvikling og validering av en Ultrasensitive ett molekyl Array Digital enzym knyttet Immunosorbent analysen for menneskelig Interferon-α
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).More

Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter