Her presenterer vi en protokoll for å beskrive utviklingen og validering av en enkelt molekyl matrise digital ELISA-analysen, som gjør det ultra-følsom påvisning av IFN-α undertypene i prøver fra mennesker.
Hovedformålet med denne protokollen er å beskrive utviklingen og validering av en interferon (IFN)-α ett molekyl matrise digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent analysen (ELISA) analysen. Dette systemet muliggjør kvantifiseringen menneskelige IFN-α protein med enestående følsomhet og med ingen kryssreaktivitet for andre arter av IFN.
Første viktige skritt av protokollen er valget av antistoff paret, fulgt av Bøyning av fange antistoffer spinn perler, og biotinylation av gjenkjenning antistoffer. Etter dette trinnet kan ulike parametere som analysen konfigurasjon, detektor antistoff konsentrasjon og buffer komposisjon endres til optimal følsomhet er oppnådd. Til slutt, spesifisitet og reproduserbarhet metoden vurderes for å sikre tillit til resultatene. Her utviklet vi IFN-α ett molekyl array analysen med en grense på deteksjon av 0,69 fg/mL med høy affinitet autoantistoffer isolert fra pasienter med biallelic mutasjoner i autoimmune regulator (AIRE) protein forårsaker autoimmune polyendocrinopathy Syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Viktigere, aktivert disse antistoffene påvisning av alle 13 IFN-α undertyper.
Denne nye metodikken kan oppdage og kvantifisering IFN-α protein i menneskelig biologiske prøver i attomolar konsentrasjoner for første gang. Slikt verktøy vil være svært nyttig overvåke nivåene av denne cytokin i helse og sykdom stater, de fleste spesielt infeksjon autoimmunitet og autoinflammation.
Type jeg IFNs er en familie av cytokiner som spiller en sentral rolle i orkestrering antiviral immunreaksjoner. De ble først oppdaget av Isaacs og Lindenmann 60 år siden1,2 , og det er kjent at denne heterogene familien av polypeptides består av 14 forskjellige underklasser (13 IFN-α subtyper og 1 IFN-β). Jeg IFNs er avgjørende for klarering av virusinfeksjoner, men har også vært innblandet i patologi av en rekke menneskelig sykdom stater, inkludert autoimmune sykdommer systemisk lupus erythematosus (SLE), juvenile dermatomyositis (JDM), og typen Jeg interferonopathies i hvilken konstituerende jeg IFN-indusert signalering resulterer i patologi,3,,4,,5,,6,,7.
Studere type I-IFN protein nivåer i biologiske prøver har vært utfordrende siden den innledende identifisering som en “konflikt stoff”1,2. Foreløpig er sandwich Enzyme-Linked ImmunoSorbent analysen (ELISA) den mest brukte metoden for påvisning av IFN-α protein. Til tross for bestemt, enkel og rask, type jeg IFN ELISAs presenterer viktige begrensninger som begrenset følsomhet. I tillegg krever måling av alle IFN-α undertyper bruk av flere analyser hver med sin egen oppdagelsen kapasitet og følsomhet. Det finnes kommersielle ELISAs oppdage ulike undergrupper av IFN-α, deres følsomhet er begrenset (1.95 pg/mL, 12.5 pg/mL og 12,5 pg/mL, henholdsvis) som er ofte nok til å oppdage IFN-α protein i biologiske prøver. For å overkomme denne begrensningen, flere biologiske proxy analyser er utviklet for å kvantifisere skriver jeg IFN ved å måle indusert genuttrykk eller funksjonelle aktiviteten8,9,10,11, 12 , 13 , 14. likevel disse analyser ikke gir en direkte måling av IFN-α protein.
I denne studien ble ett molekyl matrise digital ELISA teknologi brukt til å utvikle en analysen for påvisning av enkelt IFN-α protein molekyler. Digital ELISA benytter den samme grunnleggende kjemien som konvensjonelle ELISA, men reaksjonen foregår i matriser bestående av 50.000 personlige 46 femtoliter størrelse brønner15,16. Enkelt protein molekyler er fanget av antistoff spinn perler og merket med et biotinylated gjenkjenning antistoff, etterfulgt av binding av et enzym konjugert, streptavidin-β-galactosidase (SBG). Deretter er perlene suspendert med en fluorogenic enzym underlaget, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), til enkelt-molekylet matriser. Ved å redusere volumet reaksjon 2 milliarder ganger17, høy lokal konsentrasjon av fluorescerende signalet er oppnådd og ett molekyl teller bli mulig, som hvert molekyl genererer et signal som kan nå bli pålitelig målt18. I hovedsak er ett molekyl matriser i stand til å telle enkelt immunocomplexes og bestemme en gjennomsnittlig antall enzymer per perle (AEB). Telle microwells der en signalet tillater kvantifisering/digitalisering av protein molekyler som det er en direkte sammenheng mellom protein konsentrasjon og forholdet mellom immunocomplexed-perler og totalt perler i femtoliter-størrelse kamrene.
Yeung et al. utført en omfattende plattformer evalueringsstudie bruker ni ulike teknologier og fire cytokin immunanalyser med sikte på å sammenligne analysen presisjon og følsomhet data sammenheng på tvers av ulike plattformer19. En av de viktigste resultatene av studien var at ett molekyl matriser og ett molekyl teller immunanalyse presentert høyeste følsomhet for gjenkjenning av cytokiner i humant serum innen sub-pg/mL konsentrasjonen. Ett molekyl matrise digital ELISA cytokin analyser har brukt til å studere rollen til TNF-α og IL-6 i Crohns sykdom20, IFN-α interferonopathy og auto-immune pasienter 7, og de forskjellige post-translationally endret former for C-X-C motiv chemokine 10 (CXCL10) i kronisk hepatitt og friske blodgivere mottar sitagliptin21,22. Andre programmer inkluderer måling av rhodopsin hos pasienter med diabetisk retinopati23; studiet av hjernen patologi gjennom serum/plasma målinger av neurofilament lys24 og amyloid-β 1-42 peptid25, i sammenheng med multippel sklerose og Alzheimers sykdom, henholdsvis. Ett molekyl matrise analyser kan også brukes for forbedret patogen gjenkjenning som karakteristikk av HIV viral reservoaret26og oppdagelsen av DNA27 og mikro RNAs28. En stor fordel av ett molekyl matrise teknologien er dette høy allsidighet, som analysen mot noen analytt rundt kan utvikles hvis et spesifikt antistoff par er tilgjengelig. I tillegg er homebrew analysen kits kommersielt tilgjengelig, slik at utviklingen av nye analyser, protokollen som er beskrevet i en modifisert form nedenfor.
Her vises en detaljert beskrivelse av utviklingen og validering trinnene for en enkel molekyl array analysen som resulterer i økt følsomhet for IFN-α proteinet oppdagelsen. Antistoffer for ett molekyl matrise analyser bør være svært spesifikke, unngå kryssreaksjon med relaterte proteiner (med arter spesifisitet hvis relevant). Ideelt sett bør antistoffer med en K-D mindre enn 10-9 M velges; høy affinitet sikrer sterke bindende, med produksjon av en høyere signal. The kinetics av antistoff-antigen bindingen er også viktig, og rask Kpå treg Kav vil favorisere antigen-antistoff komplekse samlingen. Starter med et antistoff par som har en god ytelse i klassisk ELISA, med en grense for påvisning (LOD) av 1-100 pg/mL, øker sjansene for å få en svært følsom ett molekyl array analysen. Chang og kolleger utført detaljert kinetic studier av biomolecular samhandlinger på hvert enkelt trinn, foreslår et sett av likninger å forutsi analytisk følsomhet18. De viste at ett molekyl matrise digital ELISA synes å være effektive i et bredt spekter av antistoff slektskap (KD ~ 10−11 – 10−9 M), samt at signalet generasjon er mer avhengig på frekvensen av slike antistoffer.
For å utnytte høy affinitet skriver antistoffer vi tok fordel av antistoffer isolert fra pasienter med autoimmune polyendocrinopathy syndromet 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED)29. Grunner som ikke er ennå forstått, det store flertallet av AIRE-mangelfull enkeltpersoner utvikle et sett høy-avidity antistoffer mot alle IFN-α subtyper29, og vi merket to anti-IFN-α antistoff kloner av komplementære bindende slektskap for ulike IFN-α subtyper, som anslått ved IC50 verdier. Kombinasjonen av disse unike høy affinitet Antistoffene med ett molekyl matrise-teknologi aktivert direkte kvantifisering av IFN-α ved attomolar (fg/mL) konsentrasjoner. Slike ultrasensitive IFN-α proteinet oppdagelsen vil bidra til en bedre forståelse av natur, regulering og biologiske effekten av IFN-indusert respons i forskjellige sykdommen innstillinger.
Her, beskrev vi utvikling og validering av en svært reproduserbare, ultrasensitive ett molekyl matrise digital ELISA for direkte kvantifisering IFN-α protein i prøver fra mennesker (trinn oppsummert i tabell 1). En av de viktigste trinnene i utviklingen av analysen er valg av antistoff par16, med egenskaper kinetics og epitope bindingen er nøkkelen til en vellykket analysen. Det er viktig å unngå bruk av sammenkoblede monoklonale antistoffer som målrette den samme epitope eller som forårsake steric hinder. Polyklonale antistoffer kan brukes som gjenkjenning antistoffer for å overvinne slike begrensninger. Hvis ønsket følsomheten ikke oppnås i noen bestemt trinn, bør ytterligere optimalisering muligheter vurderes. Dette kan omfatte bruk av alternativ antistoff par, endringer i parametere for eksempel protein (f.eks BSA < kasein), pH (6.0 8.5), ionisk styrke, bufring kapasitet (f.eks NaCl og fosfat konsentrasjoner), bærer perler, og tilstedeværelsen av tensider. En rekke parametere optimaliseres con når du utvikler en enkelt molekyl array analysen. Men samlet forhold som gir høy signal: bakgrunn prosenter og minimal LODs er de foretrukne (se figur 1, figur 2og Figur 3).
Om spesifisitet, IFN-α analysen viste ingen kryssreaksjon for noen andre IFNs testet (β, γ, λ1, λ2, ω) (figur 4a) og var i stand til å oppdage alle 13 IFN-α undertyper (figur 4b). Analysen viste imidlertid en lavere for IFN-α2 undertypen, (figur 4b og supplerende tabell 4). Interessant, ble ulike følsomhet for ulike klasser av IFN-α2 (a, b, c) også observert, som kan skyldes forskjellige produksjonsmetoder eller annen amino acid sekvenser, som IFN-α2 subtyper Hentet fra ulike kommersielle leverandører. Med dette unntaket ga alle IFN-α arter ligner svar. Spesifisiteten av analysen ble ytterligere demonstrert av forbehandling av prøvene med anti-IFN-α en klone, som avskaffet signalet (figur 6 og supplerende tabell 6).
En av de viktigste fordelene med denne teknologien er at noen analytt rundt kan potensielt være målrettet16. Videre kan ulike biologiske prøver bli testet, som serum, plasma, Cerebrospinalvæske, mobil lysates, kultur supernatants31 og med pusten32. Vanligvis utføres en 1:3 fortynning av plasma for å unngå potensielle tilstopping av ett molekyl matrise analysator. Men analytt rundt kan være tilstede på svært lave konsentrasjoner i relevante biologiske utvalget og høyere konsentrasjoner av prøven kan være nødvendig (avhengig av analysen sensitivitet)33. Selv om det er potensial for multiplexing samtidig opprettholde god følsomhet34, er det en mer utfordrende prosess og analyser for å måle større enn 6 proteiner i samme eksperimenter har ennå å bli utviklet35.
Muligheten til å oppdage og kvantifisere cytokiner og andre biologiske relevante proteiner på slike lave konsentrasjoner åpner opp en rekke nye programmer33,36. Det er kjent at mange proteiner utøve deres effekter på svært lave konsentrasjoner som til nå var under grensen for påvisning av de beste ELISAs37. Andre immunanalyse teknologier tilbyr fordeler fremfor konvensjonelle ELISA19, viser vi her at ett molekyl matrise digital ELISA er en reproduserbar og robust plattform for ultrasensitive påvisning av lav konsentrasjon cytokiner i prøver fra mennesker. Som sådan, tilbyr denne teknologien enorme potensialet for biomarkør oppdagelse og forbedret pasient ledelse av en rekke sykdommer.
The authors have nothing to disclose.
DD og YJC anerkjenner støtte fra ANR (Project IFNX, ingen. CE17001002) og ImmunoQure AG for å gi monoklonale antistoffer. Vi takker Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki og Pierre Quartier for å gi kliniske eksempler. YJC erkjenner europeiske forskningsråd (GA 309449: kameratskap til YJC), og et statlig tilskudd administreres av National Research Agency (Frankrike) under programmet “Investeringer for the Future” bærer referansen ANR-10-IAHU-01.
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone | eBioscience | BMS216C | |
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone | eBioscience | BMS216BK | Not an ELISA kit but bulk abs |
IFN α2c | eBioscience | BMS305 | OK |
IFN αI (17) | PBL | 11150-1 | |
IFN α2a | PBL | 11100-1 | |
IFN α2a | PeproTech | No longer available | |
IFN α2b | PBL | 11105-1 | |
IFN α1 | PBL | 11175-1 | |
IFN α4a (M1) | PBL | 11177-1 | |
IFN α4b (a4) | PBL | 11180-1 | |
IFN αB2 (a8) | PBL | 11115-1 | |
IFN αC (a10) | PBL | 11120-1 | |
IFN αD (a1) | PBL | 11125-1 | |
IFN αG (a5) | PBL | 11135-1 | |
IFN αF (a21) | PBL | 11130-1 | |
IFN αH2 (a14) | PBL | 11145-1 | |
IFN αJ1 (a7) | PBL | 11160-1 | |
IFN αK (a6) | PBL | 11165-1 | |
IFN αWA (a16) | PBL | 11190-1 | |
IFN λ1 | PeproTech | 300-02L | |
IFN λ2 | PeproTech | 300-02K | |
IFN ω | PeproTech | 300-02J | |
IFN β | PeproTech | 300-02BC | |
IFN γ | PeproTech | 300-02 | |
Anti-IFN-α ELISA | PBL | 41115.1 | |
96-well plates | Corning | 3904 | |
ISRE-Reporter | Qiagen | CCS-008L | |
Fu-GENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem | ThermoFischer Scientific | 31985062 | |
Dual-Luciferase Reporter assay | Promega | E1910 | |
Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
Spectrophotometer NanoDrop 1000 | Thermo Scientific | No longer available | |
Amicon micocentrifuge tubes – 0.5mL filtres | Merck Millipore | UFC505096 | |
Bead Conjugation Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
Non-Encoded Paramagnetic Beads | Quanterix | 101360 | |
Bead Wash Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
EDC | Fisher Scientific | 11844071 | |
Bead Blocking Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
Bead Diluent Buffer | Quanterix | 101362 | |
Detector and Sample Diluent | Quanterix | 101359 | |
Biotinylation Reaction Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
NHS-PEG4-Biotin | Fisher Scientific | 11891195 | |
diH2O | |||
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) | Thermo Scientific | 75002478 | |
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) | IKA | MS2 | |
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
1.7mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) | VWR | 521-2844 | |
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) | Eppendorf | ||
Single molecule array (Simoa) reagents | |||
SBG, Bead and Detector Barcode Labels | Quanterix | 101652 | |
15 mL Reagent Bottles | Quanterix | 102411 | |
Simoa specimen 96-well plates | Quanterix | 101457 | |
Simoa Discs | Quanterix | 100001 | |
Simoa 2.0 conductive Tips | Quanterix | 101726 | |
Simoa Cuvettes | Quanterix | 100803 | |
Simoa SBG Reagent | Quanterix | 102295 | |
Simoa RGP Reagent | Quanterix | 101736 | |
Simoa System Buffer 1 | Quanterix | 100486 | |
Simoa System Buffer 2 | Quanterix | 100487 | |
Sealing Oil | Quanterix | 100206 | |
ddH2O | |||
Simoa HD-1 Analyzer | Quanterix | 100032 | |
Technologies | |||
Single molecule array (Simoa) | Quanterix | ||
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems | Singluex |