Her gir vi en demonstrasjon av inntaks blemme kutan tilbakekalling modellen. Modellen gir en enkel tilgang til studere human i vivo adaptive immunreaksjoner, for eksempel i forbindelse med vaksineutvikling.
Kutan antigen huske modeller tillate studier av menneskelige minnet svar i vivo. Kombinert med huden sugekraft blemme (SB) induksjon, tilbyr denne modellen tilgjengelighet til sjeldne bestander av antigen-spesifikke T-celler representant for cellulær hukommelse svaret så vel som de cytokin microenvironment i situ.
Denne rapporten beskriver praktiske fremgangsmåten en cutaneous tilbakekalling, en SB induksjon og en høster av antigen-spesifikke T-celler. Du eksemplifiserer metoden, tuberkulin huden testen brukes for antigen tilbakekalling i individer som, før denne studien gjennomgikk en Bacillus Calmette-Guérin vaksinasjon mot en infeksjon med Mycobacterium tuberculosis. Til slutt, eksempler på multipleks og flyt cytometric analyser av SB er gitt, illustrerer høy fraksjoner av antigen-spesifikke polyfunctional CD4 + T-celler tilgjengelig ved denne sampling metoden sammenlignet med celler isolert fra blodet.
Metoden beskrevet her er safe og minimalt invasive, gir en unik mulighet til å studere både medfødte og adaptive immunreaksjoner i vivoog kan være nyttig for et bredt fellesskap av forskere arbeider med celle-mediert immunitet og menneskelige minne svar, i sammenheng med vaksineutvikling.
En hud SB er en kunstig indusert blemme, som tillater høsting av celler og fluid direkte fra huden. Teknikken av heve SBs av vakuum er et velkjent verktøy innen Dermatologi brukes for studiet av huden immunologi i helse og sykdom1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. denne rapporten viser hvordan SB teknikken kombinert med kutan antigen tilbakekalling (SB kutan tilbakekalling metode) kan gi direkte innsikt i adaptive immunreaksjoner i vivo.
Prinsippet bak SB induksjon er enkel: en lett vakuum brukes på et lite område av huden. Den negative trykket vil til slutt tvinge overhuden å skille fra dermis, opprette en lokal blemme fylt med væske og celler1,2,9. Blemme væsken kan høstes av en tynn nål aspirasjon, og innholdet kan brukes for videre studier i vitro.
I de senere årene har det vært en økende interesse i SB-metoden for å studere i vivo immunreaksjoner enn sykdommer begrenset til huden10,11. Studiet av adaptiv immunitet hos mennesker er begrenset av det faktum at cellene og cytokiner av interesse er utvalgt fra perifert blod fordi en invasiv prøvetaking lymfeknute eller mage mucosal vev kan være uakseptabelt og uetisk. Et eksempel er studiet av varige menneskelige minnet T-celle svar etter vaksinasjon12. Prøvetaking av relevante T-celler kan være en stor utfordring, fordi den relevante populasjonen av celler som megle immunitet ligger i lymfoidvev i slike prøvelser, og bare et svært begrenset antall bestemte T-celler sirkulere i perifert blod.
SB teknikken tilbyr en unik mulighet til å studere minne T-celler og andre spesifikke celle populasjoner. Etter kutan inoculation av antigen, T-celler spesifikke for antigen er rekruttert fra deres lymfoide hideaways huden og lett kan bli samplet fra SB. Den metodologi og forskning anvendelser av denne kutan tilbakekalling modellen ble beskrevet av Akbar et al. i 20132. En brukte antigen for huden tilbakekalling er kommersielt tilgjengelige renset protein derivat (PPD) av mykobakterier brukes til å utføre en tuberkulin huden test (TST)13, hvor PPD injiseres i den dermal lag av huden. I personer med en eksisterende immunologisk minne mot PPD [f.eks, personer med en Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infeksjon eller en tidligere Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaksine], antigen avsetning resulterer i en husker svar med overføring på huden og en i vivo klonal ekspansjon PPD-spesifikke CD4 + T-celler2,11,14,15. Som et resultat, høy fraksjoner av PPD-spesifikke polyfunctional CD4 + T-celler akkumuleres i huden klar for SB prøvetaking. T-celler samlet av denne metoden har vist seg for å være robust og er tilstrekkelig rikelig å være preget av en rekke immunanalyser og en langsiktig i vitro kultur15. Dermed kutan tilbakekalling modellen og SB induksjon kan være en verdifull metode for å studere i vivo T-celle svar av ex vivo analyser, og økt kunnskap om denne tilnærmingen kan dra forskere med interesser i cellulær immunologi og vaccinology.
Denne rapporten gir den første trinnvis guiden om hvordan å indusere menneskehud sugekraft blemmer i PPD-injisert huden. Kutan antigen tilbakekalling modellen er demonstrert ved hjelp av TST i BCG-vaksinert frivillige. Til slutt, relevante ex vivo analyse av celler og cytokiner isolert av SB er eksemplifisert. Phenotypical og funksjonelle kjennetegner PPD-spesifikke T-celler ved metoden SB er grundig beskrevet andre steder2,10,11,16,17, 18 , 19. denne rapporten skal diskutere de praktiske og immunologiske aspektene av metodikken å lette anvendelsen av denne teknikken av andre forskningsgrupper.
Dette manuskriptet beskriver en praktisk fremgangsmåte for studiet av menneskelig immun minne svar i vivo, ved hjelp av kutan antigen tilbakekalling og cellen høsting ved inntaks blemme induksjon. TST ble brukt som et eksempel på intradermal antigen avsettelse og BCG-vaksine tilbakekalling. Til slutt, et eksempel på SB prøven karakterisering av flyt cytometric og multipleks cytokin analyse ble gitt, viser at om lag en tredjedel av SB cellene var antigen-spesifikke polyfunctional T-celler av effektor minne fenotypen.
De avgjørende skritt i denne protokollen inkludere intradermal injeksjon teknikken, suge blemme induksjon, og blister punktering. Først krever en riktig intradermal avsettelse opplært personale. En feil deponering kan føre til suboptimal resultater. PPD er vanligvis en velkjent og sikker kutan antigen, men komposisjonen kan variere mellom produsenter, begrense sammenlignbarheten13,20. Denne rapporten inneholder instruksjoner for en enkelt intradermal avsettelse av 2 TU, og eventuelt to parallelle avsetninger (2 x 2 TU), som kan kreve ekstra etiske godkjenning. Men har andre studier brukt 10 TU, som øker sannsynligheten for en sterk hud reaksjonen10,21. Under SB induksjon trinn reduseres liten gradvis økning i negative trykket risikoen for blødning, og blister ruptur. Sjansene for forurensning med røde blodceller eller leukocytter fra blodet er generelt lavt2. Unngå kontakt mellom nålen punktering og dermal blemme gulvet reduserer urenheter rusk eller bosatt hudceller aseptiske punktering teknikken hindrer mikrobiell forurensning. Men foretrekker noen forskere å høste SB fluid ved å bruke et rullende trykk punktert blemme10. Det kan være nødvendig å punktere septa innen blemme. SB teknikken selv er minimal invasiv; skjulte SBs leges uten arrdannelse og infeksjoner er svært sjeldne. 2 men noen grad av hypo-pigmentering oppstå og SB induksjon bør antagelig unngås folk med en historie med kolloid arrdannelse.
Tekniske begrensninger omfatter lav total-celle avkastning og derfor begrensede muligheter for langtidslagring. Relasjoner mellom leucocyte avkastningen, klinisk TST svar, blemme størrelse og røde blodlegemer forurensning er grundig beskrevet andre steder2,10. BCG-tilbakekalling eksperimentene presenteres her (figur 1) var den median totale avkastningen fra hver blister 50.000, antyder en småskala eksperimentelle set-up bruker disse cellene, spesielt hvis SBCs studerte alene15. Imidlertid overskrider bestemte T-celle befolkningen i en SB prøve det meste det som er funnet i PBMC prøver i både relative og absolutte celletall. I eksemplet i figur 2, var antall trippel-positive PPD-spesifikke T-celler i 100.000 SB celler mer enn 2 x større enn antallet i 1 x 106 PBMCs fra samme donor (data ikke vist). En visuell scoring av TST reaksjonen er den vanligste kliniske metoden for vurdering av M. tuberkulose minne. Av notatet, underliggende adaptive immunologiske reaksjonen ikke topp samtidig som klinisk hud reaksjonen2,21. Ikke alle BCG-vaksinert eller Mtb-utsatt enkeltpersoner vil utvikle sterke TST reaksjoner og strategier for klassifisering og en håndtering av prøver fra TST ikke-respondere, samt en forhåndsdefinert mycobacterial sensibilisering i studien befolkningen, må vurderes før du starter en tilbakekalling prøveversjon benytter denne metoden. Også i både SB prøvetaking og visuelle scoring, det er et potensial for en teoretisk skjevhet i personer med redusert huden svar på grunn av global eller hud-relaterte nedsatt immunitet sett, for eksempel i HIV-infeksjon og bestemte aldersgrupper2, 13,18,20. I tillegg er en immunologiske styrking av TST reaksjon med gjentatte testing kjente20,22. SB celle fenotyper beholdes imidlertid ganske konstant når TSTs gjentatte10. Denne observasjonen støtter rollen SB tilbakekalling longitudinelle studier av mobilnettet immunreaksjoner.
T-celle immunologists lar SB tilbakekalling for innhøsting av høy fraksjoner av antigen-spesifikke celler. Men er timingen av SB for et utvalg fra en PPD-deponering kritisk som både mobilnettet sammensetningen og cytokin microenvironment endres over tid. I denne protokollen, blemmer ble indusert 7-dagers post utfordring og isolert cellene var hovedsakelig CD4 + effektor minne T-celler inkludert høy fraksjoner av celler med en co uttrykk IFN-γ, TNF-α og IL-2. Disse observasjonene er i tråd med tidligere studier som beskriver hvordan T-celle aktivering, spredning og differensiering forekommer i PPD-primet huden2,15,21. Kinetisk SB studier i PPD-sensitivisert individer tyder på at tidlig huden svaret er uspesifikke; imidlertid allerede i de første dagene etter PPD-utfordringen, svaret blir dominert av CD4 + T-celler (både sentrale minne og effektor minne fenotyper har vært beskrevet), og etter 3 dager, svaret er dominert av høye fraksjoner PPD-spesifikke cytokin produsere CD4 + T-celler,2,,8,,10,,15,,21. Dette tilpasningsdyktige cytokin svaret forblir synlig i mer enn 2 uker2,8,10,23. Dag 7 innlegg-TST synes å være det mest optimale tidspunktet for innsamling av cytokin produsere minne CD4 + T-celler2. Men kan andre tidspunkt selvfølgelig være relevante avhengig av antigen og svar av interesse. Av notatet, i en studie, har tilpasset PPD svaret blitt rapportert til topp litt tidligere med en nedgang i pro-inflammatoriske cytokin utskillelsen allerede på 5 dager innlegg-TST10.
SB fluid inneholder høye nivåer av både pro-inflammatoriske cytokiner og andre proteiner vist å være representativt for huden microenvironment15,24. Kinetics studier har vist at TNF-α og IFN-γ nivåer i SB fluid topp etter 3 dager mens IL-2 nivåer topp etter 7 dager2,10, sannsynligvis gjenspeiler dominans av adaptive svar på dette senere tidspunktet. Fordi SB celler har vært aktivert i vivo, viser de en høy spontan cytokin utgivelse som et potensial for en spesifikk løslate på restimulation (Figur 3 og 4).
Denne rapporten fokuserer på CD4 + T celler immunitet. Som vist i figur 2, fleste av de isolerte T-cellene var faktisk CD4 +, mens det var nesten ingen CD8 + T-celler i inntaks blemme væske. Dette er i tråd med andre SB PPD-tilbakekalling studier lav proporsjoner og en mindreverdig vandrende kapasitet på CD8 + T-celler sammenlignet med CD4 + T celler2,8,10,23. Ytterligere karakteristikk av CD8 + bidrag ville være å foretrekke; men er dette utenfor omfanget av denne rapporten.
T-celler blir ansett som viktig for immun kontroll av Mtb; imidlertid har det vært vanskelig å identifisere en pålitelig relateres til beskyttelse i adaptive immunrespons blod25,26. Dette veisperring hinder alvorlig for utviklingen av nye TB vaksiner, som det er for øyeblikket ikke noe alternativ til stor og kostbar effekt studier27. TB vaksine utviklere bestemme vaksinen immunogenisitet ved å vurdere små og forbigående endringer i vaksine-spesifikke T-celle populasjoner i blod28,29. Imidlertid er det tvilsomt om brøkdel av sirkulerende antigen-spesifikke T-celler finnes i blodet er relevante (dvs.i stand til å migrere til området av en infeksjon og representant for T-celle-rike microenvironment kontrollere Mtb) 27 , 30 , 31 .
Basert på tidligere studier og dataene som presenteres her, representerer SB kutan tilbakekalling modellen en uutnyttet potensial for studiet av vaksine-spesifikke T-celler. Ikke bare aktiveres modellen en tilbakekalling av en vaksine svar som genereres tiår siden, den likeledes innrømmer evalueringen av ekte minnet i vev-spesifikke sammenheng15,18,19,21. Roman, bestemt huden tester, som inkluderer antigener også består av kandidaten delenhet TB vaksiner, foreslår nye muligheter for vaksine evaluering bruker modell28,32. Videre transcriptomic analyser foreslår at en celle – mediated-immunrespons generert i PPD-utfordret huden ligner på svaret i Mtb-infisert lunge18.
Mens hud punch biopsies også tillate en celle høst fra huden og gi romlig informasjon, sammenlignet med SB prøvetaking, metoden er mer invasiv og krever enzymatisk eller mekanisk behandling å forberede encellede suspensjoner33. Målinger av cytokiner og celle markører er sammenlignbar mellom de to metoder2,10.
Metoden sugekraft blemme er allerede brukt i mange områder av medisinsk forskning foruten Dermatologi, enten alene eller i kombinasjon med en systemisk eller lokale hud utfordring. Eksempler omfatter studier av sepsis, Epstein – Barr virus-assosiert lymphoproliferative sykdom, diabetisk nevropati, glukokortikoid inntak effekter og menneskelige studier testing terapeutiske antistoffer eller modeller for T-celle-målrettet terapi10 ,34,35,36,37,38.
Fra et terapeutisk synspunkt, metoden SB kutan tilbakekalling tilbyr unike fordeler for å studere sentrale T-celle minnet potensielle og -fra både en biologisk og teknisk synspunkt-hud synes å gi relevante prøvetaking seksjon2, 15,18,19,21. Spesielt sammenlignet med tradisjonelle, passive prøvetaking av sirkulerende PBMCs, SB kutan tilbakekalling metoden gjør studiet av T-celler som har vist evnen til å migrere fra lymfeknute svar til deres aktuelle antigen, og fullføre lokalt ekspansjon og differensiering i vev-spesifikke i vivo sammenheng15,18,19,21.
I konklusjonen, vist modellen her kan være relevant for forskere innen human adaptiv immunitet og T-celle målretting agenter (dvs.i infeksjonssykdommer vaccinology eller kreft forskning). TST modellen brukes i denne protokollen er, selvfølgelig, spesielt relevant innen TB vaccinology. Det grunnleggende konseptet av denne modellen er imidlertid svært aktuelt i andre felt av forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Mads Radmer Jensen for sin praktiske og akademiske råd; Lau Lindqvist og Kaare Svejstrup for å gi teknisk ekspertise; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt og Solveig W. Harpøth for deres kundestøtte; personalet på Gentofte TB poliklinikk for trening i PPD administrasjon; og alle frivillige for å delta i studien. Dette prosjektet er finansiert av European Commission H2020 programmet [bevilgning nummer TBVAC2020 643381], og vi vil gjerne takke consortium partnere for de fruktbare diskusjonene.
Gloves for laboratory use | Imtex, Denmark | 1013 | |
Desinfection spray | Apotek, Denmark | 82% alcohol, with glycerin, for human skin | |
Alcohol swaps | Mediq, Denmark | 1131892 | |
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) | AJ Vaccines | ||
Myjector syringe with fixed needle | Terumo | A236 | 1 ml/29G/12mm |
Ruler | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Ballpoint pen | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Portable Lung Suction Unit | Laerdal Medical, Denmark | 78000011 | NOTE. Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital |
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative Pressure Instrument Seal Kit | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative pressure Chamber Strap | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | 12 inches | |
Micropore Surgical tape | 3M | 1533-1 | 2.5cm x 9.1m |
Cap from 15ml plastic tube | Sarstedt, Germany | 62,547,254 | |
Tubigrip bandage | Mölnlycke Health Care, Sweden | 1443 | |
Cosmopor steril adhesive dressing | Hartmann | 9008337 | 7.2 x 5 cm |
2ml Syringe Concentric Luer Slip | Becton Dickinson | 300185 | |
Microlance 23G/30mm needle | Becton Dickinson | 300700 | |
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) | Eppendorf | 0030120086 | Autoclaved |
Minispin plus centrifuge | Eppendorf | 5453000011 | |
Gibco AIM V Medium | Life Technologies | 12055-091 |