Summary
在这里, 我们提供了一个示范的吸入水泡皮肤召回模型。该模型允许一个简单的访问研究人体自适应免疫反应, 例如在疫苗开发的背景下。
Abstract
皮肤抗原召回模型允许研究人的记忆反应在体内。该模型结合皮肤吸泡 (锑) 诱导, 为罕见的抗原特异性 T 细胞提供可访问性, 代表细胞记忆反应以及细胞因子微环境的原位。
本报告描述了皮肤召回的实际程序, 某人的诱导, 和一个抗原特定的 T 细胞的收获。为举例说明该方法, 结核菌素皮肤试验用于抗原召回的个人谁, 在本研究之前, 接受了 Guérin 芽孢杆菌疫苗接种的结核分枝杆菌感染.最后, 给出了细胞样品的多重性和流性分析的例子, 说明了这种取样方法与血液分离的细胞相比, 抗原特异性多功能 CD4+ T 细胞的高分。
这里描述的方法是安全和微创的, 提供了一个独特的机会, 以研究先天和自适应免疫反应在体内, 并可能有利于一个广泛的社区的研究人员细胞介导免疫和人类记忆反应, 在疫苗开发的背景下。
Introduction
皮肤某人是人为诱发的水泡, 它允许从皮肤直接获得细胞和液体。采用真空法提高 SBs 的技术, 是皮肤病学领域的一个知名工具, 用于研究健康和疾病1、2、3、4、5、6,7,8. 本报告展示了如何将某一技术与皮肤抗原召回 (某人皮肤召回方法) 结合起来, 可以直接洞察体内的适应性免疫反应。
感应器背后的原理很简单: 轻真空被应用到皮肤的一个小区域。负压最终会迫使表皮与真皮分离, 造成局部水泡充满液体和细胞1,2,9。吸塑液可通过细针抽吸得到, 其含量可用于体外进一步研究。
近年来, 在人体免疫应答研究中, 除了受限于皮肤10、11的疾病外, 人们对该方法的兴趣越来越大。由于对淋巴结或胃肠粘膜组织的侵入性取样可能是不可接受和不道德的, 因此对人体自适应免疫的研究受到了来自外周血液取样的细胞和细胞因子的限制。一个例子是研究长寿命的人类记忆 T 细胞反应后接种12。在这种试验中, 相关 t 细胞的取样可能是一个巨大的挑战, 因为相关的细胞的免疫调节免疫力驻留在淋巴组织中, 只有非常有限数量的特定 T 细胞在外周血中循环。
某人的技术为研究记忆 T 细胞和其他特定细胞群体提供了一个独特的机会。在抗原的皮肤接种之后, 抗原特异的 T 细胞从他们的淋巴藏身之处被吸收到皮肤并且可以容易地被取样从某人。本文介绍了这种皮肤召回模型的方法和研究应用. 在 2013年2。一种常用的皮肤召回抗原是用于执行结核菌素皮肤试验 (尖沙咀)13的分枝杆菌的商用纯化蛋白衍生物 (ppd), 其中 PPD 被注入皮肤的真皮层。在对 PPD 有免疫记忆的个体中 (例如,结核分枝杆菌感染的个体或先前的卡介苗 Guérin (BCG) 疫苗), 抗原沉积导致召回反应与迁移到皮肤和体内克隆扩张的 PPD 特定的 CD4+ T 细胞2,11,14,15。因此, 高分数的 PPD 特异多功能 CD4+ T 细胞积累在皮肤准备为某人取样。这种方法收集的 T 细胞已被证明是健壮的, 足够丰富, 以一系列的免疫和长期的体外培养15为特征。因此, 皮肤召回模型和 SB 诱导可以证明是一种有价值的方法来研究在体内T 细胞反应的体外分析, 并增加知识, 这一方法可能有利于研究人员对细胞免疫学的兴趣和疫苗。
本报告提供第一个逐步指南, 如何诱导人皮肤吸入水泡在 PPD 注射皮肤。应用卡介苗接种疫苗的志愿者对皮肤抗原召回模型进行了验证。最后, 对人分离的细胞和细胞因子的相关体外分析进行了实证研究.用表型鉴定方法获得的 PPD 特异性 T 细胞的功能特征和作用特性在别处2、10、11、16、17、18,19. 本报告旨在讨论方法的实际和免疫学方面, 以减轻其他研究小组对这项技术的应用。
Protocol
下文所述的所有方法, 包括使用人类志愿人员, 已得到丹麦卫生研究伦理学委员会 (H-15002988) 和丹麦数据保护局 (jr. nr 2015-57-0102) 的批准。PPD 必须是经认证的产品, 供人使用, 并在制造商提供的正确剂量内进行管理。任何剂量或管理上的偏差可能需要额外的道德认证, 志愿者必须给予知情同意。
1. 结核菌素皮肤试验
- 获得志愿者的口头和书面知情同意。在注射前, 要确保志愿者理解并接受程序, 包括可能产生的不良影响。
注: 本议定书特有的纳入标准为年龄 > 18 年, 并有记录的卡介苗接种。纳入标准可能因研究问题而异 (也就是说, 附加的纳入标准可能是正尖沙咀的证据)。 - 使用可供人类使用的 PPD 的现成解决方案 [20 个结核菌素单位 (TU)/毫升]。使用酒精拭子对瓶子的橡皮帽进行消毒。
- 准备注塑现场
- 找到志愿者前臂腹侧的注射部位。
- 将手臂手掌放在平坦的表面上, 选择前臂上部第三的区域, 从肘关节处大约 5-10 厘米。远离疤痕, 静脉, 或受损的皮肤。
- 使用酒精拭子消毒该区域。
- 准备 PPD 解决方案
- 使用1毫升无菌注射器与 27-30 克/短 (如12 毫米) 固定针。
- 轻轻地混合并渴望0.1 毫升的 PPD 溶液。确保没有可见气泡。
- 皮下 PPD 注射液
注意: 此步骤描述如何执行单个 ppd 沉积, 但可能会在同一臂中对 ppd 进行多次证言。然而, 这可能需要特定的道德认同。- 伸展的皮肤, 并指出针在 5-的角度对皮肤与斜面朝上向上。
- 将针的尖端插入皮肤的真皮层, 并确保通过表皮几乎可见尖端。
- 慢慢注射0.1 毫升的 PPD 溶液。
注: 如果正确管理, 将立即出现 6-10 毫米的苍白丘疹。丘疹在大约10分钟以后消失。 - 当进行两个或更多的证词, 目的是最大的分离 (5-10 厘米) 的注射部位, 同时保持良好的距离, 从肘部和手腕地区。
注意: 这可以防止皮肤测试响应的潜在汇合, 并允许两个吸入腔的不间断定位。
2. 皮肤反应的评估-天3
- 48-72 小时后, 注意皮肤反应的大小。测量硬化 (肿胀) 而不是反应的红斑 (红肿)。
- 用手指触及硬肿胀, 然后用圆珠笔标记硬化的边缘。使用标尺测量硬化直径并且注意结果在毫米。
注: 对硬化尺寸的读数可指导吸入腔孔直径的选择。
3. 吸塑诱导-天7
- 装配吸尘装置单元。
注: 吸入装置单位为抽吸吸塑用附腔的真空泵。此演示中使用的设备是自定义的, 但吸设备单元也可在商业上使用。泵需要在-20 至-40 帕的范围内进行调节, 并提供稳定可靠的负压。在使用该方法进行实验之前, 应先获得区域伦理认同。- 首先, 将底部孔板和窗板与腔室和连接软管装配在一起, 准备吸尘室。将室连接软管与真空泵紧密连接。
注: 分庭应包括一个底板与一个孔的吸塑感应, 这应该是适合与人的皮肤接触, 和一个顶部板与窗口, 允许视觉监测的水泡。
- 首先, 将底部孔板和窗板与腔室和连接软管装配在一起, 准备吸尘室。将室连接软管与真空泵紧密连接。
- 确定孔板的最佳孔直径相对于皮肤反应的大小;孔的尺寸越大, 水泡越大。
- 用酒精拭子对志愿者的孔板和皮肤进行消毒。
- 将吸入室连接到皮肤上。
- 请确保志愿者的手臂舒适地休息。
- 确保吸入室底板的孔位于 PPD 反应之上, 使皮肤反应中心可见。
- 用皮带松散地固定房间: 当施加负压时, 腔室会附着在皮肤上, 保持其位置。
- 打开吸入装置, 并调整压力为-20 帕。
- 30分钟后, 将负压增加至-25 帕。
- 60分钟后, 进一步增加负压至-30 帕。
- 保持-30 帕的压力, 直到水泡完全成型。确保本协议中提供的负面压力特定于定制的仪器。在其他设置中应用协议时, 可能需要稍微调整压力。
注: 吸塑感应相的范围从60到180分钟 (1-3 小时), 实际水泡形成在最近30分钟内发生. 起泡通常与瘙痒感有关。水泡可能发生作为单一或多次合并水泡。如果水泡破裂或出血发生, 建议通过缓慢释放压力来终止水泡诱导。 - 水泡完全成型后, 释放压力, 并小心地从皮肤上取出吸入腔, 而不破裂水泡。
- 在周围的皮肤区域应用一个软敷料, 并放置一个硬帽 (例如, 从50毫升塑料管) 在水泡。
- 用不过敏的手术胶带和柔软的弹力绷带保护瓶盖。
- 指导志愿者在 12-24 小时内避免水泡区过度的身体压力。
4. 吸塑液的收获-天8
- 在8天 , 轻轻地去除保护敷料和消毒水泡与皮肤消毒喷雾。
- 使用一个2毫升无菌注射器与23G 针, 以收获水泡内容。将针头插入吸塑屋顶的顶部/侧面, 慢慢地吸入液体。避免接触洞的地板, 但要确保收获所有的液体。
- 在折叠的水泡上涂抹敷料。
- 将水泡液转移到无菌管上。记下音量。
- 用台式离心机在 600 x g 处旋转吸塑液4分钟。
- 将上清液转移到另一管, 并在细胞培养基的500µL 中并用重悬细胞颗粒。
注意: 细胞现在已经准备好进行计数和进一步分析。上清液可以存储在-20 到-80 °c, 直到使用。
5. 吸塑细胞和液体的分析
注: 为分析皮肤吸入水泡所获得的细胞和液体提供指导不属于本议定书的范围。然而, 为了提供本报告的代表性结果, 进行了细胞内染色流式细胞术和多路分析。下文简述了这一方法。
- 流式细胞仪
- 刺激 1 x 105新鲜细胞从吸入水泡分离的悬浮从1卡介苗接种志愿者与10µg 或毫升 PPD 并且孵化细胞在37°c 和 5% CO2.包括静态细胞进行平行孵化。
- 刺激悬浮液 1 x 106 PBMCs 获得从1卡介苗接种志愿者与10µg/毫升的 PPD 和孵化混合物在37°c 和 5% CO2.包括静态细胞进行平行孵化。
- 2小时后, 用 Brefaldin A 和莫能治疗所有细胞, 并在37°c 孵育6小时。
- 用 Live/Dead-stain-BV510、anti-CD4-AF780、anti-CD3-BV421、反 CD8 PerCP Cy5.5、anti-CCR7-PE、anti-CD45RA-BV786、anti-IFN-γ-AF700、anti-TNF-α-PE-Cy7 和 anti-IL-2-FITC 的面板染色细胞。
- 在 PBMC 面板中包括 FMO 控件。
- 用流式细胞仪进行流细胞分析, 并使用相关软件对结果进行分析。
- 门上的细胞因子产生 CD3+CD4+CD8-亚群使用以下的浇口策略: 汗衫-> 可行的 CD3+ > CD4+CD8-> 干扰素-γ +, TNF α +, 或 IL-2+。
- 利用以下门控策略对效应器记忆细胞进行闸门: 汗衫 > 可行 CD3+ > CD4+CD8 > CCR7-CD45RA。
- 使用布尔浇口计算单个细胞因子剖面。
- 细胞因子释放演示
- 为了演示体内细胞因子释放, 使用多重分析来量化4名志愿者在解冻吸泡液中 IL-2、干扰素、TNF α、IL-10 和 IL-13 的含量。
- 为演示细胞因子释放由吸入水泡前体从体内获得, 使用新鲜吸塑细胞和 PBMCs 获得1卡介苗接种志愿者。
- 感染 PBMC 和吸入水泡细胞与100个集落形成单位 (CFU) 的山地车 H37Rv 和孵化他们4天。
- 使用多重分析来量化 IL-2、干扰素γ、TNF α、IL-10 和 IL-13 在所有文化上清液中的水平。
- 将测定计算范围以上的测量值调整到上限计算极限。
Representative Results
八名健康的成人志愿者 (中位年龄:30 岁, 范围:26-43 岁) 与已记录的前卡介苗接种 (中位时间从卡介苗接种: 5.5 年, 范围: 1-30 年) 包括在内。参加者被挑战 intradermally 与2个 PPD 然后在3天的尖沙咀评估。SBs 在7天被诱导并且在8天收获了, 并且所有水泡由吸入水泡室提出了以10毫米孔直径。七人分别被给予2单独 ppd 接种同时在同一只胳膊跟随2平行某人归纳 (请参见关于在协议的步骤1.4 之下多 PPD 证言的笔记)。用密度梯度离心法对7天的血浆和 PBMCs 隔离进行了外周血的提取。从 SBs 中的等离子和流体上清液存储在摄氏-20 摄氏度。新鲜的某人细胞 (SBCs) 计数使用 nigrosine 染色和显微术。
临床尖沙咀反应和 SBC 产量如图 1所示。尖沙咀硬结的正中大小为10.25 毫米 (范围: 0-20 毫米), 每个水泡的中位细胞数是 5万 (范围: 1.5万-21万个细胞, 水泡的数量:15)。其中两名志愿者在 2 TSTs 中均无临床反应, 相应的低总细胞产量为1.5万细胞/水泡。细胞产量与尖沙咀的平均临床反应有关 (长矛的r = 0.643, p = 0.094)。
图 1: 吸塑细胞产量.(a) 本小组展示了在尖沙咀后7天内从 SBs 中分离出的 nigrosine 染色细胞的代表性显微镜。(b) 本小组显示8名卡介苗接种志愿者 (水泡数量 = 15) 与平均尖沙咀硬化 (mm) 和平均细胞产量 (n/水泡) 之间的关系。点表示单个平均测量。请注意, 2 点是重叠的, 因为2志愿者都有尖沙咀硬化0毫米和细胞产量1.5万。请单击此处查看此图的较大版本.
为了演示细胞的流动情况, SBCs 是从一名43岁的志愿者那里获得的, 他曾在30年前接种过卡介苗, 并且没有接触过结核分枝杆菌. SBCs 在单一水泡的诱导下被隔绝了 (硬化: 1.4 mm/100,000 SBCs)。图 2显示了 SBCs与PBMCs 细胞内细胞因子染色的代表性地块。
在这个志愿者中, CD3+CD4+CD8-SBCs 的分数从静态细胞的67% 增加到 > 90%, 在体外restimulation 的 PPD, 而 CD3+CD4+CD8 PBMCs 的分数保持不变 (51%,图 2)。超过92% 的体外PPD-, 以及静态 CD3+CD4+CD8-SBCs, 是效应记忆类型 (CCR7-CD45RA-, 数据没有显示)。SBCs 与 PBMCs (33.1 对0.2%、静态样品减去) 相比, PPD 刺激诱发的特异性 CD3+CD4+CD8 细胞的总分数较高。在 PBMCs 中, 多功能 PPD 特异 CD3+CD4+CD8 细胞的分数均 < 0.05%。
图 2: SBCs 的代表性流式细胞仪地块与PBMCs.a组和b组显示了 CD8+ 和 CD4+ 种群的代表性密度图 (a) 静态vs。ppd 刺激的 PBMCs 和 (c) SBCs. 小组b和d在 PPD 刺激的 CD3+CD4+CD8 细胞内细胞因子染色的慢块 (b) PBMCs 和 (d) SBCs.请单击此处查看更大的此数字的版本.
正如预期的那样, CD3+CD4+CD8-SBCs 在体内激活, 这说明了上调细胞因子 (12%) 中很大比例的红细胞染色, 主要细胞因子为 TNF α和干扰素γ。然而, 在 PPD 刺激下, 分泌细胞因子向三重或双阳性 IFN-γ+TNF-α+IL-2+ (17%) 和干扰素-γ + TNF α + (15%) 剖面 (图 3b, PBMC 剖面从同一捐赠者被包括用于比较 图 3a)。PPD 刺激效应器记忆 CD4+ T 细胞亚群 (CD3+CD4+CD8-CCR7-CD45RA) 的细胞因子表达谱与图2和3中的 CD3+CD4+CD8 种群 (未显示数据) 相比较。
图 3: CD4+ PPD 刺激和静态 SBCs 与 PBMCs 的细胞因子图谱. 这些面板显示细胞因子产生 (a) CD3+CD4+CD8-PBMCs 细胞和 (b) CD3+CD4+CD8 SBCs 的个人概况。酒吧代表静态细胞 (白条) 抗原特异性细胞因子剖面的分数, 并在体外刺激与 PPD (有色棒)。
为了在皮肤检测的部位, 探索液体作为细胞因子微环境的信息来源, 从 SBs 诱发的7天后尖沙咀诱导的液体中测定细胞因子水平 (图 4a)。干扰素γ、TNF α和 IL-2 的中位数分别为 339 pg/毫升、19 pg/毫升、1 pg/毫升 (n = 6)。血浆的水平一般很低。从 SBs 中分离出来的细胞产生了高水平的促炎性细胞因子 (图 4b)。1名志愿者 SBCs 的滴定是在自体 PBMCs 的毒力结核的存在下培养4天的。干扰素-γ水平 > 30 倍以上的文化中含有 SBCs, 无论是否存在的 PBMCs。
图 4: 细胞因子水平在某人液体, 血浆和山地-受感染的文化上清液.(a) 本小组显示6名卡介苗接种志愿者的上清液和血浆中的细胞因子水平。条形代表细胞因子水平的中位数;误差线表示范围。(b) 这个小组显示了上清液中的细胞因子水平, 从 4 平行600µl 的4天的文化 1 x 106 PBMCs (黑条), 1.75 x 105 SBCs (白条), 1 x 106 PBMCs 尖刺与0.5 或 1.75 x 105 SBCs (灰条) 感染结核分枝杆菌。请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
这篇手稿描述了一个实用程序, 研究人体免疫记忆反应在体内, 利用皮肤抗原召回和细胞收获的吸入水泡诱导。尖沙咀被用作皮抗原沉积和 BCG 疫苗召回的一个例子。最后, 通过流细胞和多重细胞因子分析, 给出了 sb 标本的一个例子, 表明约三个细胞是效应记忆表型的抗原特异多功能 T 细胞。
该协议的关键步骤包括皮下注射技术、吸塑诱导和吸塑穿刺。首先, 正确的皮下沉积需要训练有素的人员。错误的沉积可能导致不理想的结果。PPD 通常是一种众所周知的安全的皮肤抗原, 但其组成可能不同制造商之间, 限制可比性13,20。这份报告提供了一个单一的皮下沉积2涂, 可选的两个平行证言 (2 x 2 涂), 这可能需要额外的道德批准。然而, 其他研究使用了 10 TU, 增加了强烈皮肤反应的可能性10,21。在诱导阶段, 负压小逐步增加会降低出血和水泡破裂的风险。从血液中感染红细胞或白血病的几率一般低2。无菌穿刺技术可防止微生物污染, 避免穿刺针与真皮吸尘地板之间的接触, 减少碎片或居民皮肤细胞的杂质。然而, 一些研究人员更喜欢用轧制压力对穿刺水泡10来收割锑液。可能有必要刺穿水泡内的隔膜。某人的技术本身是微创的;折叠 SBs 愈合没有疤痕和感染是非常罕见的。2然而, 有一定程度的亚色素沉着可能发生, 并应避免诱导某人在具有胶体疤痕史的人。
技术限制包括低总电池产量, 因此长期储存的选择有限。白细胞产量, 临床尖沙咀反应, 水泡大小和红细胞污染之间的关系已被彻底描述在别处2,10。在这里提出的卡介苗召回实验 (图 1) 中, 每个水泡的平均总产量为 5万, 这意味着使用这些细胞进行小规模实验, 特别是如果 SBCs 单独研究15。然而, 在某一样品中, 特定的 T 细胞种群在相对和绝对细胞计数中的 PBMC 样本中的数量大多超过了所发现的。在图 2所示的示例中, 在 10万 SB 细胞样本中, 三阳性 PPD 特定 T 细胞的数量超过了同一个捐献者 1 x 106 PBMCs 中发现的数字的 2x (未显示数据)。尖沙咀反应的视觉评分是评价结核记忆的最常用的临床方法。值得注意的是, 潜在的适应性免疫反应并不与临床皮肤反应2,21的同时峰值。并非所有卡介苗接种或结核分枝杆菌暴露的个人都将制定强有力的尖沙咀反应和分类战略, 并处理来自尖沙咀非应答者的样本, 以及在研究人群中预先存在的结核杆菌敏感度,需要在使用此方法启动召回试验之前考虑。此外, 在某人的抽样和视觉评分, 有一个潜在的理论偏见, 皮肤反应减少, 由于全球或皮肤相关的免疫力受损, 如所见, 例如, 在艾滋病毒感染和某些年龄组2, 13,18,20。此外, 对尖沙咀反应的免疫促进与反复试验是众所周知的20,22。然而, 当 TSTs 重复10时, 某人的细胞表型保持不变。这一观察支持了某人在细胞免疫反应的纵向研究中所起的作用。
对于 T 细胞位免疫学家, 某人召回允许获得高分数的抗原特异细胞。然而, 当细胞成分和细胞因子微环境随着时间的推移而变化时, 某人从 PPD 沉积取样的时间是至关重要的。在本议定书中, 水泡被诱导7天后的挑战和孤立的细胞主要是 CD4+ 效应记忆 T 细胞, 包括高分数的细胞与干扰素-γ, TNF α, 和 IL-2 的共同表达。这些观察与以前的研究是一致的, 描述了 T 细胞的活化、增殖和分化发生在 PPD 引皮皮肤2,15,21。在 PPD 敏感的个体中, 某人的研究表明早期皮肤反应是不特异的;然而, 已经在 PPD 挑战后的第一天, 反应成为主导的 CD4+ T 细胞 (中央记忆和效应记忆表型被描述), 并且, 在3天以后, 反应由高分数控制PPD 特异的细胞因子产生 CD4+ T 细胞2,8,10,15,21。这种自适应细胞因子反应仍可检测2周2,8,10,23。7天后尖沙咀似乎是最理想的时间点收集细胞因子产生的记忆 CD4+ T 细胞2。然而, 其他时间点, 当然, 可能是相关的, 取决于抗原和反应的兴趣。值得注意的是, 在一项研究中, 自适应 PPD 反应已被报告为较早的峰值, 在5天后尖沙咀10的炎症细胞因子分泌减少。
液中含有高浓度的促炎性细胞因子和其他蛋白, 表现为皮肤微环境的15、24。动力学研究表明, 肿瘤坏死因子α和干扰素-γ水平在3天后, IL-2 水平峰值后7天2,10, 可能反映的优势, 自适应反应在这个后期阶段。由于某人细胞在体内被激活, 它们表现出高度自发的细胞因子释放, 以及在 restimulation 上的特定释放的可能性 (图 3和4)。
本报告的重点是 CD4+ T 细胞免疫。如图 2所示, 大多数孤立的 t 细胞确实是 CD4+ 的, 而吸入水泡液中几乎没有 CD8+ t 细胞。这符合其他人的 PPD 召回研究报告低比例和较低的迁徙能力的 CD8+ t 细胞相比, CD4+ t 细胞2,8,10,23。进一步描述 CD8+ 的贡献是可取的;但是, 这超出了本报告的范围。
T 细胞被认为是重要的免疫控制结核分枝杆菌;然而, 很难确定从血液25,26的适应性免疫反应中反映出的保护的可靠关联。这一路障严重阻碍了新的结核病疫苗的开发, 因为目前没有替代大型和非常昂贵的药效试验27。结核病疫苗开发商通过评估血液中28、29的疫苗特定 T 细胞种群的微小和瞬变变化来确定疫苗的免疫原性。然而, 在血液中发现的循环抗原特异性 T 细胞的小部分是否相关 (即能够迁移到感染部位并代表 T 细胞丰富的微环境控制) 是值得怀疑的。山地车)27,30,31.
根据先前的研究和本文所提供的数据, 某人皮肤召回模型代表了研究疫苗特异 T 细胞的未开发的潜力。这一模型不仅能够召回几十年前产生的疫苗反应, 而且还允许对特定于组织的上下文15、18、19、21中的真实记忆潜能进行评估。新的, 具体的皮肤测试, 其中包括抗原也由候选亚单位结核疫苗, 提出了新的机会, 疫苗评估使用这个模型28,32。此外, transcriptomic 分析表明, 在 PPD 挑战皮肤中产生的细胞介导的免疫应答类似于在结核菌感染的肺18中发现的反应。
虽然皮肤穿孔活检也允许从皮肤的细胞收获和提供空间信息, 与 SB 抽样相比, 这种方法更具侵入性, 需要酶或机械加工来制备单细胞悬浮液33。细胞因子和细胞标记的测量在两种方法2,10之间是可比较的。
吸塑法已经被应用于医学研究的许多领域, 除了皮肤病学, 单独或结合全身或局部皮肤挑战。例子包括脓毒症, eb 病毒相关的淋巴疾病, 糖尿病神经病, 糖皮质激素摄入的影响, 和人类试验测试治疗抗体或 T 细胞靶向治疗模型10 ,34,35,36,37,38。
从治疗的角度来看, 某人的皮肤召回方法为研究中心 T 细胞记忆潜能提供了独特的优势, 从生物学和技术的角度来看, 皮肤似乎提供了一个相关的取样室2, 15,18,19,21。特别是, 与传统的, 被动抽样的循环 PBMCs, 人皮肤召回方法, 以研究的 T 细胞已证明有能力从淋巴结迁移, 以响应其相关的抗原, 并完成当地在体内的组织特异的扩张和分化15,18,19,21。
总之, 这里所展示的模型可能与人类自适应免疫和 T 细胞靶向剂 (即传染病疫苗或癌症研究) 领域的研究人员相关。当然, 在本议定书中应用的尖沙咀模型在结核病疫苗领域具有特殊的相关性。但是, 该模型的基本概念在其他研究领域也有很高的应用价值。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Mads Radmer 詹森的实际和学术建议;刘 Lindqvist 和 Kaare Svejstrup 提供技术专长;海琳 Bæk Juel, 乔纳森 Filskov, Signe t. 施密特, Solveig W Harpøth 为他们的技术援助;Gentofte 结核病门诊诊所的工作人员在 PPD 管理方面的培训;和所有参加这项研究的志愿者。该项目由欧洲联盟委员会 H2020 计划 (赠款编号 TBVAC2020 643381) 提供资金, 我们要感谢联盟伙伴进行富有成果的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gloves for laboratory use | Imtex, Denmark | 1013 | |
| Desinfection spray | Apotek, Denmark | 82% alcohol, with glycerin, for human skin | |
| Alcohol swaps | Mediq, Denmark | 1131892 | |
| PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) | AJ Vaccines | ||
| Myjector syringe with fixed needle | Terumo | A236 | 1 ml/29G/12mm |
| Ruler | not relevant | for skin reaction evaluation | |
| Ballpoint pen | not relevant | for skin reaction evaluation | |
| Portable Lung Suction Unit | Laerdal Medical, Denmark | 78000011 | NOTE. Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital |
| Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
| Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
| Negative Pressure Instrument Seal Kit | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
| Negative pressure Chamber Strap | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | 12 inches | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1533-1 | 2.5cm x 9.1m |
| Cap from 15ml plastic tube | Sarstedt, Germany | 62,547,254 | |
| Tubigrip bandage | Mölnlycke Health Care, Sweden | 1443 | |
| Cosmopor steril adhesive dressing | Hartmann | 9008337 | 7.2 x 5 cm |
| 2ml Syringe Concentric Luer Slip | Becton Dickinson | 300185 | |
| Microlance 23G/30mm needle | Becton Dickinson | 300700 | |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) | Eppendorf | 0030120086 | Autoclaved |
| Minispin plus centrifuge | Eppendorf | 5453000011 | |
| Gibco AIM V Medium | Life Technologies | 12055-091 |
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