Här ger vi en demonstration av sug blister kutan minns modellen. Modellen ger en enkel tillgång till studera mänskliga i vivo adaptiva immunsvar, exempelvis i samband med utvecklingen av vaccin.
Kutana antigen-recall modeller möjliggör studier av människans minne Svaren i vivo. Kombination med huden sug blister (SB) induktion, erbjuder denna modell tillgänglighet till sällsynta populationer av antigen-specifika T-celler representant av cellulärt minne svaret samt den cytokin närmiljön i situ.
Denna rapport beskriver det praktiska förfarandet en kutan minns, SB induktion och en skörd av antigen-specifika T-celler. För att exemplifiera metoden, tuberkulinprov används för antigena minns i individer som före studien genomgick en Bacillus Calmette-Guérin vaccination mot en infektion med Mycobacterium tuberculosis. Slutligen finns exempel på multiplex och flöde flödescytometrisk analyser av SB exemplar, som illustrerar hög fraktioner av antigen-specifika Polyfunktionella CD4 + T-celler finns tillgängliga genom denna provtagningsmetod jämfört med celler som isolerats från blod.
Den metod som beskrivs här är säker och minimalinvasiv, ger en unik möjlighet att studera både medfödd och adaptiv immunsvar i vivooch kan vara fördelaktigt att en bred gemenskap av forskare som arbetar med cell-medierad immunitet och mänskliga minne svaren, i samband med utvecklingen av vaccin.
En hud SB är ett artificiellt inducerad blister, vilket möjliggör skörden av cellerna och vätska direkt från huden. Tekniken att höja SBs av vakuum är ett välkänt verktyg inom dermatologi används för studier av huden immunologi i hälsa och sjukdom1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. denna rapport visar hur den SB teknik kombinerat med kutan antigena recall (SB kutan recall metod) kan ge direkta insikter adaptiva immunsvaret i vivo.
Principen bakom SB induktion är enkel: ett lätt vakuum används till ett litet område av huden. Det negativa trycket kommer att så småningom tvinga epidermis att separera från dermis, att skapa en lokal blåsa fylld med vätska och celler1,2,9. Blister vätskan kan skördas av en fin nål aspiration och innehållet kan användas för ytterligare undersökning in vitro.
Under de senaste åren har det skett ett ökat intresse i SB-metoden för att studera i vivo immunsvar än sjukdomar begränsade till huden10,11. Studien av adaptiv immunitet hos människa är begränsad av det faktum att cellerna och cytokiner sevärdheter provtas från perifert blod eftersom en invasiv provtagning av lymfkörtel eller gastrointestinala slemhinnor vävnad kan vara oacceptabelt och oetiskt. Ett exempel är studiet av långlivade människans minne T-cell svar efter vaccinering12. I sådana prövningar, provtagning av relevanta T-celler kan vara en stor utmaning, eftersom populationen av celler som medla immunitet är bosatt i den lymfoida vävnaden, och endast ett mycket begränsat antal specifika T-celler som cirkulerar i perifert blod.
Den SB-tekniken erbjuder en unik möjlighet att studera minne T-celler och andra specifika cellpopulationer. Efter kutan inympning av antigen, T-celler specifika för antigenet rekryteras från deras lymfoida gömställen på huden och kan enkelt avnjutas från SB. Metodik och forskning tillämpningar av kutan minns modellen beskrevs av Akbar o.a. i 20132. Ett vanligt förekommande antigen för hud minns är det kommersiellt tillgängliga renade proteinderivatet (PPD) av mykobakterier som används för att utföra ett tuberkulin hudtest (TST)13, där PPD injiceras i det dermala lagret av huden. Hos individer med en befintlig immunologiskt minne mot PPD [e.g., individer med Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infektion eller en tidigare Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccination], antigen nedfall resulterar i en minns svar med migration på huden och en i vivo klonal expansion av PPD-specifika CD4 + T-celler2,11,14,15. Som ett resultat, hög fraktioner av PPD-specifika Polyfunktionella CD4 + T-celler ansamlas i huden redo för SB provtagning. T-celler som samlas in av denna metod har visat sig vara robust och är tillräckligt att präglas av en rad immunanalyser och en långsiktig i vitro kultur15. Således kutana minns modellen och SB induktion kan visa sig vara en värdefull metod att studera i vivo T-cell svar genom ex vivo analyser, och ökad kunskap om denna strategi kan få forskare med intressen i cellulär immunologi och vaccinologi.
Denna rapport innehåller den första stegvisa guiden om hur att inducera human hud sug blåsor i PPD-injiceras hud. Kutana antigen minns modellen demonstreras med hjälp av TST hos BCG-vaccinerade frivilliga. Den relevanta ex vivo analysen av celler och cytokiner som isolerats av SB är slutligen exemplifieras. Fenotypiska och funktionella egenskaper av PPD-specifika T-celler genom metoden SB är noggrant beskrivs på andra ställen2,10,11,16,17, 18 , 19. denna rapport syftar till att diskutera de praktiska och immunologiska aspekterna av metoden för att underlätta tillämpningen av denna teknik av andra forskargrupper.
Detta manuskript beskriver praktiska förfarandet för studiet av mänskliga immunologiskt minne Svaren i vivo, med kutan antigen recall och cellen skörd genom sug blister induktion. TST användes som ett exempel på intradermala antigen nedfall och BCG-vaccin recall. Slutligen var ett exempel på SB preparatet karakterisering av Flödesanalys flödescytometrisk och multiplex cytokin förutsatt, visar att ungefär en tredjedel av SB cellerna var antigen-specifika Polyfunktionella T-celler av effektor minne fenotypen.
De kritiska steg i detta protokoll inkluderar intradermal injektionstekniken, sug blister induktion och blister punkteringen. För det första kräver en rätt intradermala nedfall utbildad personal. En felaktig nedfall kan leda till suboptimala resultat. PPD är i allmänhet en välkända och säkra kutan antigen, men dess sammansättning kan variera mellan tillverkare, begränsa jämförbarhet13,20. Denna rapport innehåller instruktioner för en enda intradermala nedfall av 2 TU och eventuellt två parallella depositioner (2 x 2 TU), vilket kan kräva ytterligare etisk godkännande. Men har andra studier använt 10 TU, vilket ökar sannolikheten för att en stark hud reaktion10,21. Under SB induktion steg, kommer att små stegvis ökning av det negativa trycket minska risken för blödning och blistret bristning. Risken för kontaminering med röda blodkroppar eller leukocyter från blodomloppet är generellt låg2. Den aseptiska punktering-tekniken förhindrar mikrobiell kontamination och att undvika kontakt mellan punktering nålen och dermal blister golvet minskar orenheter av skräp eller bosatta hudceller. Vissa forskare föredrar dock att skörda SB vätska genom att tillämpa en rullande tryck till punkterad blister10. Det kan vara nödvändigt att punktera septa inom blistret. Den SB-tekniken själv är minimalt invasiva; kollapsade SBs läker utan ärrbildning och infektioner är mycket sällsynta. 2 dock viss grad av hypo-pigmentering kan uppstå och SB induktion bör nog undvikas hos personer med en historia av colloid ärrbildning.
Tekniska begränsningar inkluderar låg summacell avkastning och följaktligen begränsade alternativ för långsiktig lagring. Relationer mellan leukocytbefriade avkastningen, kliniska TST svaren, blister storlek och erytrocyt kontaminering har varit grundligt beskrivs på andra ställen2,10. I BCG-recall experiment presenteras här (figur 1) var medianvärdet totala avkastningen från varje blister 50 000, vilket innebär en småskalig experimental set-up med dessa celler, särskilt om SBCs är studerade ensam15. Specifik T-cells befolkningen i en SB prov överstiger dock mestadels vad som finns i PBMC prover i både relativa och absoluta blodkroppar. I exemplet presenteras i figur 2, var antalet triple-positiv PPD-specifika T-celler i ett prov av 100.000 SB celler mer än 2 x större än det nummer i 1 x 106 PBMC från samma givare (inga data anges). En visuell scoring av TST reaktionen är den vanligaste kliniska metoden för utvärdering av M. tuberculosis minne. Notera, underliggande adaptiv immunologiska reaktionen inte topp samtidigt som den kliniska hud reaktion2,21. Inte alla BCG-vaccinerade eller Mtb-exponerade individer kommer att utveckla starka TST reaktioner och strategier för klassificering och en hantering av prover från TST icke-responders, liksom en redan existerande mykobakteriella sensibilisering i studiepopulationen, måste beaktas innan en recall rättegång med denna metod. Också, i både SB provtagning och visuella gjorde, det finns en potential för en teoretisk partiskhet hos individer med nedsatt hudreaktioner på grund av globala eller hud-relaterade nedsatt immunitet som sett, exempelvis i HIV-infektion och vissa åldersgrupper2, 13,18,20. Dessutom är en immunologisk öka TST reaktion med upprepad testning välkänd20,22. De SB cell fenotyperna dock ganska konstant när TSTs är upprepad10. Denna observation stöder rollen av SB minns i longitudinella studier av cellulära immunsvaret.
För T-cell Immunologer möjliggör SB recall skörden av hög fraktioner av antigen-specifika celler. Tidpunkten för SB för en provtagning från ett PPD-nedfall är dock kritisk som både cellulära sammansättningen och den cytokin mikromiljö förändras över tid. I detta protokoll, var blåsor inducerad 7-dagars efter utmaning och isolerade celler var primärt effektor minne CD4 + T-celler inklusive hög fraktioner av celler med en samtidig uttryck av IFN-γ, TNF-α och IL-2. Dessa iakttagelser är i linje med tidigare studier som beskriver hur T-cells aktivering, proliferation och differentiering sker i PPD-primade hud2,15,21. Kinetic SB studier PPD-sensibiliserade individer tyder på att mycket tidigt hud svar är Ospecifikt; dock redan inom de första dagarna efter PPD-utmaningen, svaret blir domineras av CD4 + T-celler (båda centrala minne och effektor minne fenotyper har beskrivits) och, efter 3 dagar, svaret domineras av höga fraktioner av PPD-specifika cytokin produktion av CD4 + T-celler2,8,10,15,21. Detta adaptiva cytokin svar urskilj för mer än 2 veckor2,8,10,23. Dag 7 inlägg-TST verkar vara den mest optimala tidpunkten för insamling av cytokin produktion minne CD4 + T-celler2. Andra tidpunkter kan, naturligtvis, dock relevanta beroende på antigen och svar av intresse. Att notera, i en studie, har den adaptiva PPD-reaktionen rapporterats till topp lite tidigare med en minskning i den pro-inflammatorisk cytokin sekretionen redan på 5 dagar post-TST10.
SB vätska innehåller höga halter av både pro-inflammatoriska cytokiner och andra proteiner som visat sig vara representant för huden mikromiljö15,24. Kinetik studier har visat att TNF-α och IFN-γ nivåer i SB flytande topp efter 3 dagar medan IL-2 maximal efter 7 dagar2,10, förmodligen återspeglar herravälden av adaptiv svaren i detta senare skede. Eftersom SB celler har varit aktiverad i vivo, uppvisar de en hög spontana cytokinfrisättning samt en potential för en specifik utgåva vid restimulering (figur 3 och 4).
Denna rapport fokuserar på CD4 + T-cell immunitet. Vilket visas i figur 2, verkligen var majoriteten av de isolerade T-cellerna CD4 +, medan det fanns nästan inga CD8 + T-celler i sugningen blister vätska. Detta är i linje med andra SB PPD-recall studier rapportering låga proportioner och en sämre flyttande kapacitet av CD8 + T-celler jämfört med CD4 + T celler2,8,10,23. En ytterligare karakterisering av CD8 + bidrag skulle vara att föredra; Detta är dock utanför ramen för denna rapport.
T-celler anses väsentliga för immun kontroll av Mtb; Det har dock varit svårt att identifiera en tillförlitlig korrelat av det skydd som återspeglas i det adaptiva immunsvaret från blod25,26. Denna vägspärr hindrar allvarligt utvecklingen av nya TB vacciner, som det för närvarande finns inget alternativ till stora och mycket kostsamma effekt prövningar27. TB vaccin utvecklare avgöra vaccinet immunogenicitets genom att bedöma små och övergående förändringar i vaccin-specifik T-cells populationer i blod28,29. Det är dock tveksamt om bråkdel av cirkulerande antigen-specifika T-celler i blodet är relevanta (dvs.kan migrera till platsen av en infektion och företrädare för T-cell-rika mikromiljö kontrollera Mtb) 27 , 30 , 31 .
Baserat på tidigare studier och de data som presenteras häri, representerar SB kutan minns modellen outnyttjad potential för studiet av vaccinet-specifika T-celler. Inte bara ger modellen ett återkallande av ett vaccin svar genereras decennier sedan, det låter också utvärderingen av sanna minnet potential i en vävnad-specifika sammanhang15,18,19,21. Roman, specifika hudtester, bland annat antigener som också består av kandidat subenhet TB vacciner, föreslå nya möjligheter för vaccin utvärdering med hjälp av denna modell28,32. Dessutom transcriptomic analyser tyder på att en cell – medlad immunsvar som genereras i PPD-utmanas hud är liknande till svaret i det Mtb-infekterade lung18.
Medan huden punch biopsier också möjliggöra en cell skörd från huden och ge rumslig information, jämfört med SB provtagning, metoden är mer invasiv och kräver enzymatiska eller mekanisk bearbetning att förbereda encelliga suspensioner33. Mätningar av cytokiner och cell markörer är jämförbara mellan de två metoder2,10.
Metoden sug blistret har redan tillämpats i många områden av medicinsk forskning förutom dermatologi, antingen ensamt eller i kombination med en systemisk eller lokal hud utmaning. Exempel är studier av sepsis, Epstein – Barr-virus-associerade lymfoproliferativa sjukdomar, diabetesneuropati, glukokortikoid intag effekter och mänskliga försök testning terapeutiska antikroppar eller modeller för T-cell-riktade terapier10 ,34,35,36,37,38.
Från en terapeutisk synvinkel, metoden SB kutan recall erbjuder unika fördelar för att studera det centrala T-cellen minnet potentiella och -från både en biologisk och teknisk synpunkt-huden verkar ge en relevant provtagning fack2, 15,18,19,21. Särskilt möjliggör jämfört med traditionella, passiv provtagning av cirkulerande PBMC, SB kutan recall metoden studiet av T-celler som har visat förmågan att migrera från lymfkörteln som svar på deras relevanta antigen och slutföra lokalen expansion och differentiering i en vävnadsspecifika i vivo sammanhang15,18,19,21.
Sammanfattningsvis visade modellen här kan vara relevanta för forskare inom området mänsklig adaptiv immunitet och T-cells inriktning ombud (dvs.i infektionssjukdomar vaccinologi eller cancer forskning). TST modellen tillämpas i detta protokoll är, naturligtvis, av särskild betydelse i fältet TB vaccinologi. Grundtanken med denna modell är dock mycket tillämpliga inom andra forskningsområden.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Mads Radmer Jensen för hans praktiska och akademiska råd; Lau Lindqvist och Kaare Svejstrup för att tillhandahålla teknisk expertis; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt och Solveig W. Harpøth för deras tekniskt stöd. Personalen på Gentofte TB öppenvårdsmottagningar för sin utbildning i PPD administration; och alla frivilliga för att delta i studien. Detta projektet finansieras av Europeiska kommissionen H2020-programmet [grant nummer TBVAC2020 643381], och vi vill tacka konsortiepartner för de fruktbara diskussionerna.
Gloves for laboratory use | Imtex, Denmark | 1013 | |
Desinfection spray | Apotek, Denmark | 82% alcohol, with glycerin, for human skin | |
Alcohol swaps | Mediq, Denmark | 1131892 | |
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) | AJ Vaccines | ||
Myjector syringe with fixed needle | Terumo | A236 | 1 ml/29G/12mm |
Ruler | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Ballpoint pen | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Portable Lung Suction Unit | Laerdal Medical, Denmark | 78000011 | NOTE. Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital |
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative Pressure Instrument Seal Kit | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative pressure Chamber Strap | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | 12 inches | |
Micropore Surgical tape | 3M | 1533-1 | 2.5cm x 9.1m |
Cap from 15ml plastic tube | Sarstedt, Germany | 62,547,254 | |
Tubigrip bandage | Mölnlycke Health Care, Sweden | 1443 | |
Cosmopor steril adhesive dressing | Hartmann | 9008337 | 7.2 x 5 cm |
2ml Syringe Concentric Luer Slip | Becton Dickinson | 300185 | |
Microlance 23G/30mm needle | Becton Dickinson | 300700 | |
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) | Eppendorf | 0030120086 | Autoclaved |
Minispin plus centrifuge | Eppendorf | 5453000011 | |
Gibco AIM V Medium | Life Technologies | 12055-091 |