Summary

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Published: May 03, 2018
doi:

Summary

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

Abstract

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) הוא בקר ראשיים עבור המחזור תאים פרוקריוטים כל ו phosphorylates של % 8-13 המשוערת של פרוטאום; עם זאת, המספר של מטרות מזוהה Cdk1, במיוחד בתאי אדם הוא עדיין נמוך. הזיהוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 חשוב, כפי שהם מספקים תובנות מכניסטית איך Cdk1 שולט מחזור התא. מחזור התא תקנה הוא קריטי עבור נאמן כרומוזום סגרגציה, פגמים בתהליך מורכב זה להוביל סטיות כרומוזומליות וסרטן.

כאן, אנו מתארים של במבחנה קינאז assay המשמש כדי לזהות אתרי זירחון ספציפית Cdk1. זה assay, חלבון מטוהרים שוכן phosphorylated במבחנה על ידי זמינים מסחרית מוצלחת ב’ בני אדם Cdk1/cyclin זרחון אושר על ידי עמודים מרחביות, אתרי זירחון לאחר מכן מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה. נתאר גם פרוטוקולים טיהור המניבים ההכנות חלבון מאוד טהור, הומוגני מתאים וזמינותו קינאז, ואת וזמינותו של איגוד עבור אימות פונקציונלי של האתרים זרחון מזוהה, אשר חוקרת את האינטראקציה בין אות לוקליזציה הגרעינית הקלאסית (cNLS), שלה α karyopherin קולטן של נשק גרעיני. כדי לסייע עם עיצוב ניסיוני, אנו בודקים גישות לחיזוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 מ רצפי חלבונים. יחד פרוטוקולים אלה מציגים גישה רבת עוצמה מניב אתרי זירחון Cdk1 ספציפית ומאפשרת מחקרים מכניסטית לתוך כמה Cdk1 שולט מחזור התא. מאז בשיטה זו מסתמך על חלבונים מטוהרים, יכול להחיל אותה על כל דגם האורגניזם, התשואות תוצאות אמינות, במיוחד בשילוב עם לימודי תפקודי התא.

Introduction

Kinases הם אנזימים להעביר קבוצות פוספט מ- ATP על גבי מצעים ולווסת תהליכים תאיים רבים. זרחון זה הוא הפיך, מהר, מוסיף שני מטענים שליליים, ו מאחסן אנרגיה חופשית, לאחד השינויים posttranslational הנפוצים ביותר בשימוש על ידי התאים. Cdk1, אשר ידוע גם בשם homolog חלבון 2 מחזור חלוקת התא (cdc2) הוא בקר ראשיים עבור מחזור התא כל פרוקריוטים1,2,3,4,5, phosphorylates משוער 8-13% פרוטאום6,7.

בעוד מחקרים פרוטיאומיה מבנית זיהו אתרים רבים זרחון של חלבונים, ברוב המקרים, קינאז האחראי לבצע שינויים אלה אינו ידוע. מספר יעדים Cdk1 הידוע, במיוחד בתאי אדם הוא נמוך7. הזיהוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 חשובה, שכן היא מאפשרת מכניסטית מחקרים הקובעים איך Cdk1 שולט מחזור התא. מחזור התא תקנה חשוב עבור נאמן כרומוזום סגרגציה, חלוקת התא, מספר עצום של תהליכים תאיים צריך להתרחש כדי לתמוך תפקיד פיזיולוגי החשוב הזה. זה כולל עצירת תמלול ותרגום לפני תחילתה של מיטוזה, וכן ארגון מחדש דרמטי בתוך המבנה התאי של הארגון, כגון פירוק של מעטפת הגרעין, כרומוזום עיבוי, פלך mitotic הרכבה. והסחר הבינלאומי שגיאות בתהליכים אלה לגרום סרטן, מומים מולדים או מוות של תאים mitotic. מעכבים ספציפיים של Cdk1 כגון RO-3306 היו מפותחות8, אשר מספקים כלים רבי-עוצמה ללימודי פונקציונלי, חלק מעכבי אלה הם כיום בניסויים קליניים לטיפול בסרטן (ראה9 לבדיקה).

כאן, אנו מתארים של במבחנה קינאז assay המאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפית Cdk1. ב הזה assay, זמינים מסחרית B Cdk1/cyclin האנושי משמש phosphorylate יישום יעד מטוהרים חלבון במבחנה. זירחון של מצע מגבירה את המאסה שלו ומוסיף שני מטענים שליליים; לכן, זרחון מוצלחת אושר על ידי משמרת כלפי מעלה של הלהקה ג’ל חלבון בדף-מרחביות. אתרי זירחון ספציפי Cdk1 לאחר מכן מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה ניתוח של החלבון במבחנה phosphorylated. כדי לסייע עם עיצוב ניסיוני, אנו בודקים גם כלים חישוביים והפניות לחיזוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 מהרצף חלבון. יתר על כן, אנו גם מתארים פרוטוקולים טיהור המניבים ההכנות חלבון מאוד טהור, הומוגני מתאים וזמינותו קינאז. לבסוף, יש צורך לאמת את אתרי זירחון שזוהה על ידי מחקרים פונקציונלי, וזמינותו איגוד פשוט מתואר כאן למטרה זו. משולב, זה בגישה רב עוצמה מניב אתרי זירחון Cdk1 ספציפית ומאפשרת לימודים מכניסטית לתוך כמה Cdk1 שולט מחזור התא7,10,11. מאז בשיטה זו מסתמך על חלבונים מטוהרים, ניתן להחיל אותה על כל דגם האורגניזם, התשואות תוצאות אמינות. עם זאת, אימות פונקציונלי של ה זרחון שהושג אתרי במבחנה מומלץ, כמו תאים יש מנגנונים רגולטוריים נוספים במקום, כמו שינויים posttranslational, אינטראקציה עם שותפים או לוקליזציה הסלולר זה עלול להפוך את אתרי זירחון נגיש או נגיש עבור זיהוי על-ידי Cdk1.

Cdk1 מזהה אתר זרחון הסכמה המורכבת (Ser/חמישי-Pro-X-ליס/Arg), כאשר X הוא שאריות ו סרין או תראונין הוא האתר של זרחון. חשוב במיוחד עבור זיהוי היא הנוכחות של פרולין התנוחה +1. בנוסף, שאריות בסיסי המועדפות בעמדות +2 או +3, עם רוב אתרי זירחון ספציפי Cdk1 המכיל של ליס או Arg ב +3 מקם6,12.

הפעלה של Cdk1, והיא מובילה התחלתה של מיטוזה1,2,3,4,5. הפעילות של kinases תלויי-cyclin באופן כללי תלוי שיוכן cyclins נפרדות (cyclin A, B, C, D ו- E אצל בני אדם), אשר באים לידי ביטוי ב נדנוד רמות לאורך כל מחזור התא13. Cdk1 הביטוי הוא קבוע על פני מחזור התא וכן ברגולציה של פעילותה על השיוך שלו subunits תקינה cyclin A ו- cyclin B5,13,14,15, כמו גם שינויים post-translational. היווצרות הקומפלקס B Cdk1/cyclin נדרש קינאז הפעלה5,14,15,16,17,18. בשלב G2, הוא cyclin B המתורגמת את ציטוזול ולא לייבאו לתוך גרעין איפה זה נקשר Cdk15,14,15,16,17,18; עם זאת, Cdk1/cyclin B מתקיים לא מופעל על ידי זרחון על שאריות Thr14 ו- Tyr15 על ידי kinases Cdk1-מעכבות האנושי Myt1 (ממברנה-הקשורים טירוזין תראונין ספציפיים או cdc2-מעכבות קינאז) ו- Wee1, בהתאמה19, 20,21. בשלב G2 מאוחר, dephosphorylation Thr14, Tyr15 על ידי חלוקת התא מחזור 25 פוספטאז (cdc25) מפעילה את פעילות קינאז של המתחם B Cdk1/cyclin ותפעיל את החניכה של מיטוזה12,14, 18 , 20 , 22 , 23. זרחון של Thr161 גם נדרש עבור הפעלת B Cdk1/cyclin, מתווך על ידי Cdk7, קינאז (CAK) הפעלת Cdk18. השפלה של B cyclin “אנאפאזה” חלבונית Cdk1, המאפשר יציאה מן מיטוזה24,25. הפעלה של Cdk1/cyclin B לכן תהליך מסובך. פרוטוקול המובאת כאן מתבצע באמצעות B Cdk1/cyclin זמינים מסחרית. במהלך ביטוי רקומביננטי של מתחם זה בתאי חרקים, מופעל ויוו kinases אנדוגני14,20 , נותר פעיל במדינה מטוהרים. וכתוצאה מכך פעיל, רקומביננטי האנושי Cdk1/cyclin ב’ מתאים במבחנה מבחני קינאז.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לצורך זיהוי ספציפי Cdk1 אתרי זירחון ב- F (CENP-F) חלבון10צנטרומר אנושי. CENP-F הוא חלבון קינטוכור שוכנת בגרעין במשך רוב לאטמוספרה (G1 ו- S-פאזי), ייצוא של ציטוזול ב- G2 שלב26,27,28 ב באופן תלוי-Cdk110, 11. גרעיני לוקליזציה שהוענקו דו-צדדי cNLS26. cNLSs מזוהים על ידי α karyopherin פקטור נשק גרעיני, אשר מקלה, יחד עם karyopherin β RanGDP, הייבוא של cNLS-מטען לתוך גרעין29. ייצוא גרעיני בשלב G2 הוא הקל דרך מסלול10ייצוא לא ידוע. ברגע CENP-F שוכן ציטוזול, זה הוא גויס על המעטפה גרעיני והוא בתורו מגייס חלבון מוטוריים מורכבים דינאין30,31. מסלול זה חשוב למקם את הגרעין בהתאמה centrosome במהלך בשלבים הראשונים של פלך mitotic הרכבה בצורה דינאין תלויית, וזה חשוב על העיתוי הנכון של הערך mitotic ועל תהליך מהותי במוח פיתוח30,31,32. החל בשלב G2, CENP-F הוא גם לצרפן יחד קינטוכור בהם לו תפקידים חשובים עבור נאמן כרומוזום סגרגציה27,28,33,34,35 . צעד רגולטוריות. מפתח של המסלולים הללו הוא הגרעין הייצוא של CENP-F בשלב G2, אשר תלויה Cdk110,11. נתאר כאן פרוטוקול לצורך זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 cNLS של CENP-F. Phosphomimetic מוטציות של אתרים אלה להאט גרעיניות הייבוא של CENP-F, רומז כי B Cdk1/cyclin ישירות מסדיר הסלולר לוקליזציה של CENP-F על ידי זירחון של שלו cNLS10.

בסך הכל, זה וזמינותו קינאז במבחנה מאפשר הזיהוי של סובסטרטים ספציפי עבור קינאז Cdk1. Purified היעד החלבונים הם phosphorylated במבחנה על-ידי Cdk1/cyclin B המתחם זמינים מסחרית של אתרי זירחון לאחר מכן מזוהים באמצעות ספקטרומטר מסה. הזיהוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 תומך מחקרים מכניסטית לגלות איך Cdk1 שולט מחזור התא.

Protocol

1. חיזוי של אתרי זירחון ספציפי Cdk1 מהרצף חלבון לפני תחילת וזמינותו קינאז, לנתח את רצף החלבון עבור אתרי זירחון ספציפי Cdk1 החזוי, חיפוש הספרות עבור אתרי זירחון השפעול הוקמה עם ירידה לפרטים קינאז לא ידוע. השתמש הבאים כלים, מאגרי מידע, הפניות המסוכמים. השתמש iGPS 3.0 תוכנה36,</s…

Representative Results

השתמשנו לאחרונה במבחנה קינאז assay (איור 1) כדי לזהות אתרי זירחון ספציפי Cdk1 קטע CENP-F שהכיל cNLS10. האות הזה מקנה גרעיני לוקליזציה של CENP-F במשך רוב לאטמוספרה. בשלב G2, CENP-F מיוצא מהגרעין ציטוזול באופן תלוי-Cdk1. כדי לקבל תובנות מכניסטית על איך Cdk1 מווסת …

Discussion

שלנו assay קינאז במבחנה היא שיטה רבת עוצמה כדי לזהות מטרות מולקולריות עבור קינאז Cdk1, אשר הוא בקר מאסטר של מחזור התא, מווסת תהליכים תאיים חשובים רבים. השיטה קובעת אם חלבון מטוהרים מצע עבור Cdk1, מאפשר זיהוי של אתרי זירחון ספציפיים. זה מקל על מכניסטית ללימודי ויסות תהליכים תאיים על ידי זרחון ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ד ר דוד המלך, הווארד יוז במכון הרפואי, האוניברסיטה של קליפורניה בברקלי ספקטרומטר מסה ניתוח והערות מועילות. אנו מודים ז’ו Xuelian ד ר, שנגחאי, מכוני המחקר למדעי הביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, שנחאיי, סין למתן מבנה CENP-F באורך מלא. לבסוף, אנו מודים ד ר סוזאן ביין, ד ר בריאן קאלהן, ד ר Grewer כריסטוף באוניברסיטת Binghamton על גישה לציוד. מחקר זה מומן על ידי קרן מחקר באוניברסיטת מדינת ניו יורק, במחלקה לכימיה, אוניברסיטת המדינה של ניו יורק ב- Binghamton.

Materials

2800 ml baffled Fernbach flask Corning 44232XL
ampicillin Gold Biotechnology A-301-25
ATP Fisher Scientfiic BP413-25
benzamidine hydrochloride Millipore Sigma B6506-25
bottletop filter Corning 431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL New England Biolabs P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source) EMD Millipore 14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source) Invitrogen PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer New England Biolabs P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor Thermo Scientific 10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes EMD Millipore UFC900324
chlorampenicol Gold Biotechnology C-105-100
D/L methionine Agros Organics / Fisher 125650010
desalting pipet tips: Zip tips Millipore Sigma ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm Biorad 7321010
dithiothreitol Gold Biotechnology DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain EMD Millipore 71403
electrospray ionization Fourier transform ion Bruker Amazon Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer Bruker Amazon custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy Thermo Scientific 97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC GE Healthcare 29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
glutathione agarose Pierce 16101
glutathione, reduced Millipore Sigma G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker Infors I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Gold Biotechnology I2481C50
kanamycin Gold Biotechnology K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid Available upon request.
Luria Bertani medium Fisher Scientfiic BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated Eppendorf 5401000013
microtubes (0.5 ml) Eppendorf 30121023
microtubes (1.5 ml) Eppendorf 30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel Millipore Sigma P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid Millipore Sigma GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride Gold Biotechnology P470-10
PS protease: PreScission protease GE Healthcare 27084301
Phos-tag acrylamide Wako Pure Chem. Ind. 304-93521
reduced gluthathione Millipore Sigma G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) Fisher Scientfiic 055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning Agilent 210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier Branson 15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) Spectrum Labs 08 670B
swing out rotor TX-1000 Thermo Scientific 10033-778

References

  1. Nurse, P. Cyclin dependent kinases and cell cycle control (Nobel Lecture). ChemBioChem. 3 (7), 596-603 (2002).
  2. Lee, M. G., Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. Nature. 327, 31 (1987).
  3. Lohka, M. J., Hayes, M. K., Maller, J. L. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad of Sci U S A. 85 (9), 3009-3013 (1988).
  4. Gautier, J., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P., Maller, J. Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene. Cell. 54 (3), 433-439 (1988).
  5. Gautier, J., Minshull, J., Lohka, M., Glotzer, M., Hunt, T., Maller, J. L. Cyclin is a component of maturation-promoting factor from Xenopus. Cell. 60 (3), 487-494 (1990).
  6. Ubersax, J. A., Woodbury, E. L., Quang, P. N., Paraz, M., Blethrow, J. D., Shah, K., Shokat, K. M., Morgan, D. O. Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1. Nature. 425 (6960), 859-864 (2003).
  7. Petrone, A., Adamo, M. E., Cheng, C., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2448-2461 (2016).
  8. Vassilev, L. T., Tovar, C., Chen, S., Knezevic, D., Zhao, X., Sun, H., Heimbrook, D. C., Chen, L. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  9. Balakrishnan, A., Vyas, A., Deshpande, K., Vyas, D. Pharmacological cyclin dependent kinase inhibitors: Implications for colorectal cancer. World J Gastroenterol. 22 (7), 2159-2164 (2016).
  10. Loftus, K. M., Coutavas, E., Cui, H., King, D., Ceravolo, A., Pereiras, D., Solmaz, S. Mechanism for G2 phase-specific nuclear export of the kinetochore protein CENP-F. Cell Cycle. 16 (15), 1414-1429 (2017).
  11. Baffet, A. D., Hu, D. J., Vallee, R. B. Cdk1 activates pre-mitotic nuclear envelope dynein recruitment and apical nuclear migration in neural stem cells. Dev Cell. 33 (6), 703-716 (2015).
  12. Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland, N., Hoekstra, M. F., Piwnica-Worms, H., Cantley, L. C. Use of an oriented peptide library to determine the optimal substrates of protein kinases. Curr Biol. 4 (11), 973-982 (1994).
  13. Malumbres, M. Cyclin-dependent kinases. Genome Biol. 15 (6), 122 (2014).
  14. Peeper, D. S., Parker, L. L., Ewen, M. E., Toebes, M., Hall, F. L., Xu, M., Zantema, A., van der Eb, A. J., Piwnica-Worms, H. A- and B-type cyclins differentially modulate substrate specificity of cyclin-cdk complexes. EMBO J. 12 (5), 1947-1954 (1993).
  15. Trembley, J., Ebbert, J., Kren, B., Steer, C. Differential regulation of cyclin B1 RNA and protein expression during hepatocyte growth in vivo. Cell Growth Differ. 7 (7), 903-916 (1996).
  16. Pines, J., Hunter, T. The differential localization of human cyclins A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. EMBO J. 13 (16), 3772-3781 (1994).
  17. Morgan, D. O. Principles of CDK regulation. Nature. 374, 131 (1995).
  18. Larochelle, S., Merrick, K. A., Terret, M. -. E., Wohlbold, L., Barboza, N. M., Zhang, C., Shokat, K. M., Jallepalli, P. V., Fisher, R. P. Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol cell. 25 (6), 839-850 (2007).
  19. Parker, L. L., Sylvestre, P. J., Byrnes, M. J., Liu, F., Piwnica-Worms, H. Identification of a 95-kDa WEE1-like tyrosine kinase in HeLa cells. Proc Natl Acad of Sci U S A. 92 (21), 9638-9642 (1995).
  20. Atherton-Fessler, S., Parker, L. L., Geahlen, R. L., Piwnica-Worms, H. Mechanisms of p34cdc2 regulation. Mol Cell Biol. 13 (3), 1675-1685 (1993).
  21. Liu, F., Stanton, J. J., Wu, Z., Piwnica-Worms, H. The human Myt1 kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. Mol Cell Biol. 17 (2), 571-583 (1997).
  22. McGowan, C. H., Russell, P. Human Wee1 kinase inhibits cell division by phosphorylating p34cdc2 exclusively on Tyr15. EMBO J. 12 (1), 75-85 (1993).
  23. Strausfeld, U., Labbé, J. C., Fesquet, D., Cavadore, J. C., Picard, A., Sadhu, K., Russell, P., Dorée, M. Dephosphorylation and activation of a p34cdc2/cyclin B complex in vitro by human CDC25 protein. Nature. 351, 242 (1991).
  24. Leuken, R., Clijsters, L., Wolthuis, R. To cell cycle, swing the APC/C. Biochim Biophys Acta. 1786 (1), 49-59 (2008).
  25. Acquaviva, C., Pines, J. The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci. 119 (12), 2401-2404 (2006).
  26. Zhu, X., Chang, K. -. H., He, D., Mancini, M. A., Brinkley, W. R., Lee, W. -. H. The C-terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem. 270 (33), 19545-19550 (1995).
  27. Liao, H., Winkfein, R. J., Mack, G., Rattner, J. B., Yen, T. J. CENP-F is a protein of the nuclear matrix that assembles onto kinetochores at late G2 and is rapidly degraded after mitosis. J Cell Biol. 130 (3), 507-518 (1995).
  28. Rattner, J. B., Rao, A., Fritzler, M. J., Valencia, D. W., Yen, T. J. CENP-F is a ca 400 kDa kinetochore protein that exhibits a cell-cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton. 26 (3), 214-226 (1993).
  29. Christie, M., Chang, C. -. W., Rona, G., Smith, K. M., Stewart, A. G., Takeda, A. A. S., Fontes, M. R. M., Stewart, M., Vertessy, B. G., Forwood, J. K., Kobe, B. Structural biology and regulation of protein import into the nucleus. J Mol Biol. 428 (10A), 2060-2090 (2016).
  30. Zuccolo, M., Alves, A., Galy, V., Bolhy, S., Formstecher, E., Racine, V., Sibarita, J. B., Fukagawa, T., Shiekhattar, R., Yen, T., Doye, V. The human Nup107/160 nuclear pore subcomplex contributes to proper kinetochore functions. EMBO J. 26, 1853-1864 (2007).
  31. Bolhy, S., Bouhlel, I., Dultz, E., Nayak, T., Zuccolo, M., Gatti, X., Vallee, R., Ellenberg, J., Doye, V. A Nup133-dependent NPC-anchored network tethers centrosomes to the nuclear envelope in prophase. J Cell Biol. 192 (5), 855-871 (2011).
  32. Hu, D. J., Baffet, A. D., Nayak, T., Akhmanova, A., Doye, V., Vallee, R. B. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154 (6), 1300-1313 (2013).
  33. Vergnolle, M. S., Taylor, S. S. Cenp-F links kinetochores to Ndel1/Nde1/Lis1/Dynein microtubule motor complexes. Curr Biol. 17 (13), 1173-1179 (2007).
  34. Yang, Z. Y., Guo, J., Li, N., Qian, M., Wang, S. N., Zhu, X. L. Mitosin/CENP-F is a conserved kinetochore protein subjected to cytoplasmic dynein-mediated poleward transport. Cell Res. 13 (4), 275-283 (2003).
  35. Yang, Z., Guo, J., Chen, Q., Ding, C., Du, J., Zhu, X. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25 (10), 4062-4074 (2005).
  36. Xue, Y., Ren, J., Gao, X., Jin, C., Wen, L., Yao, X. GPS 2.0, a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites in hierarchy. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1598-1608 (2008).
  37. Song, C., Ye, M., Liu, Z., Cheng, H., Jiang, X., Han, G., Songyang, Z., Tan, Y., Wang, H., Ren, J., Xue, Y., Zou, H. Systematic analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data. Mol Cell Proteomics. 11 (10), 1070-1083 (2012).
  38. UniProt-Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D158-D169 (2017).
  39. Olsen, J. V., Vermeulen, M., Santamaria, A., Kumar, C., Miller, M. L., Jensen, L. J., Gnad, F., Cox, J., Jensen, T. S., Nigg, E. A., Brunak, S., Mann, M. Quantitative phosphoproteomics reveals widespread full phosphorylation site occupancy during mitosis. Science Signal. 3 (104), ra3 (2010).
  40. Dephoure, N., Zhou, C., Villén, J., Beausoleil, S. A., Bakalarski, C. E., Elledge, S. J., Gygi, S. P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad of Sci U S A. 105 (31), 10762-10767 (2008).
  41. Rona, G., Marfori, M., Borsos, M., Scheer, I., Takacs, E., Toth, J., Babos, F., Magyar, A., Erdei, A., Bozoky, Z., Buday, L., Kobe, B., Vertessy, B. G. Phosphorylation adjacent to the nuclear localization signal of human dUTPase abolishes nuclear import: structural and mechanistic insights. Acta Cryst D. 69 (12), 2495-2505 (2013).
  42. Harreman, M. T., Kline, T. M., Milford, H. G., Harben, M. B., Hodel, A. E., Corbett, A. H. Regulation of nuclear import by phosphorylation adjacent to nuclear localization signals. J Biol Chem. 279 (20), 20613-20621 (2004).
  43. Kosugi, S., Hasebe, M., Tomita, M., Yanagawa, H. Systematic identification of cell cycle-dependent yeast nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10171-10176 (2009).
  44. McLachlin, D. T., Chait, B. T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 591-602 (2001).
  45. Van Berkel, G. J., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Electrospray ionization combined with ion trap mass spectrometry. Anal Chem. 62 (13), 1284-1295 (1990).
  46. Hodel, A. E., Harreman, M. T., Pulliam, K. F., Harben, M. E., Holmes, J. S., Hodel, M. R., Berland, K. M., Corbett, A. H. Nuclear localization signal receptor affinity correlates with in vivo localization in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 281 (33), 23545-23556 (2006).
  47. Hong, K. U., Kim, H. -. J., Kim, H. -. S., Seong, Y. -. S., Hong, K. -. M., Bae, C. -. D., Park, J. Cdk1-Cyclin B1-mediated Phosphorylation of Tumor-associated Microtubule-associated Protein/Cytoskeleton-associated Protein 2 in Mitosis. J Biol Chem. 284 (24), 16501-16512 (2009).
  48. Meraldi, P., Lukas, J., Fry, A. M., Bartek, J., Nigg, E. A. Centrosome duplication in mammalian somatic cells requires E2F and Cdk2–Cyclin A. Nature Cell Biol. 1, 88 (1999).
  49. Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  50. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding Tag, a New Tool to Visualize Phosphorylated Proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  51. Takeda, H., Kawasaki, A., Takahashi, M., Yamada, A., Koike, T. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of phosphorylated compounds using a novel phosphate capture molecule. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (18), 2075-2081 (2003).
  52. Linder, M. I., Köhler, M., Boersema, P., Weberruss, M., Wandke, C., Marino, J., Ashiono, C., Picotti, P., Antonin, W., Kutay, U. Mitotic Disassembly of Nuclear Pore Complexes Involves CDK1- and PLK1-Mediated Phosphorylation of Key Interconnecting Nucleoporins. Dev Cell. 43 (2), (2017).
  53. Arai, T., Haze, K., Iimura-Morita, Y., Machida, T., Iida, M., Tanaka, K., Komatani, H. Identification of β-catenin as a novel substrate of polo-like kinase 1. Cell Cycle. 7 (22), 3556-3563 (2008).
  54. Hansen, D. V., Tung, J. J., Jackson, P. K. CaMKII and Polo-like kinase 1 sequentially phosphorylate the cytostatic factor Emi2/XErp1 to trigger its destruction and meiotic exit. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (3), 608-613 (2006).
  55. Zhang, Y., Dong, Z., Nomura, M., Zhong, S., Chen, N., Bode, A. M., Dong, Z. Signal Transduction Pathways Involved in Phosphorylation and Activation of p70S6K Following Exposure to UVA Irradiation. J Biol Chem. 276 (24), 20913-20923 (2001).
  56. Richard, D. E., Berra, E., Gothié, E., Roux, D., Pouysségur, J. p42/p44 Mitogen-activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) and Enhance the Transcriptional Activity of HIF-1. J Biol Chem. 274 (46), 32631-32637 (1999).

Play Video

Cite This Article
Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay. J. Vis. Exp. (135), e57674, doi:10.3791/57674 (2018).

View Video