Det här protokollet beskriver metoder att muntligen avslöja och infektera bananflugan Drosophila melanogaster med bakteriella patogener, och för att mäta antalet smittsamma bakterier skjul efter tarm infektion. Vidare beskriver vi effekten av immun mutanter på flyga överlevnad efter oral bakteriell infektion.
Bananflugan Drosophila melanogaster är en av de bästa utvecklade modell av infektion och medfödd immunitet. Medan de flesta arbete har fokuserat på systemiska infektioner, har det ökat senaste intresset mekanismerna i gut immunkompetens till patogener, som kräver metoder att muntligen infektera flugor. Här presenterar vi ett protokoll för att muntligen avslöja enskilda flyger till en opportunistisk bakterie patogen (Pseudomonas aeruginosa) och en naturlig bakterie patogen av D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en robust metod för att exponera manliga och kvinnliga flyger till dessa patogener. Vi tillhandahåller representativa resultat visar överlevnad fenotyper, mikrob laster och bakteriell shedding, som är relevanta för studien av heterogenitet i patogener överföring. Slutligen, vi bekräfta att Dianas mutanter (saknar skyddande peritrophic matrisen i tarmepitelet) och njuta av mutanter (saknar en funktionell immunbrist (IMD) väg), Visa ökad mottaglighet för oral bakterieinfektion. Detta protokoll, beskriver därför en robust metod att infektera flugor med oralt intag av infektion, som kan förlängas till studiet av en mängd genetiska och miljömässiga källor till variation i tarmen infektion resultat och bakteriell överföring.
Bananflugan (kallas även vinäger fluga), D. melanogaster, har flitigt använts som modellorganism för infektion och immunitet mot olika patogener1,2. Detta arbete har erbjudit grundläggande insikter i de fysiologiska konsekvenserna av infektion och även var banbrytande i nysta upp de molekylära vägar som underliggande värd immunsvaret mot parasitoid, bakteriell, svamp och virala infektioner. Denna kunskap är inte bara användbart för att förstå medfödda immunsvaret hos insekter och andra ryggradslösa djur, men eftersom många av de immunologiska mekanismerna är evolutionärt bevarade mellan insekter och däggdjur, Drosophila också har sporrat upptäckten av stora immunologiska mekanismer i däggdjur, inklusive människor3.
De flesta arbete på Drosophila infektion och immunitet har fokuserat på systemiska infektioner, med inympning metoder som levererar patogener direkt in i kroppen av insekten genom injektion eller sjukdom4,5,6. Fördelen med dessa metoder att tillåta leveransen av en kontrollerad infektiös dos är tydlig och stöds av en stor mängd arbete på systemiska infektioner. Dock förvärvas många naturligt förekommande bakteriella patogener av D. melanogaster genom utfodring på ruttnande organiskt material där tarmen immunkompetens spelar en betydande roll i värd försvar7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. experiment som sysselsätter systemiska infektioner gå förbi dessa försvar, och, därför, ger en helt annan bild av hur insekter montera försvar mot naturliga patogener. Detta är särskilt relevant om syftet med arbetet är att testa förutsägelser om ekologi och evolution av infektion, där användningen av naturliga patogener och rutter av infektion är viktigt16,17. Senaste arbete har belyst hur vägen patogener ett avsevärt påverkar sjukdomen resultatet18,19, framkallar distinkta immun vägar20,21, kan avgöra den skyddande effekten av ärvde endosymbionts16, och kan även spela en viktig roll i utvecklingen av värd försvar17.
En annan anledning att anställa orala administreringsvägar infektion är att det tillåter utredningen av variationen i patogener överföring genom att mäta bakteriell shedding under fekal utsöndring efter oral infektion22,23, 24. förståelse källorna till värd heterogenitet i sjukdomsspridning utmanande i naturliga populationer25,26, men mäta komponenter av överföring, såsom patogen shedding, under kontrollerade laboratorieförhållanden villkor erbjuder en användbar alternativt tillvägagångssätt27. Genom utfodring flugor bakterier och mäta bakteriell shedding under olika genetiska och miljömässiga sammanhang i kontrollerade experimentella förhållanden, är det möjligt att identifiera källor till variation i överföringen bland värdar.
Här beskriver vi ett protokoll för oralt infekterar D. melanogaster med bakteriella patogener, och för kvantifiering av bakterietillväxt och sprider som följer (figur 1). Vi beskriver detta protokoll på två Pseudomonas bakterier: en virulent stam av opportunistiska patogener P. aeruginosa (PA14), och en mindre virulent stam av naturligt flyga patogen P. entomophila. Pseudomonads är vanliga gramnegativa bakterier med ett brett spektrum, infekterar insekter, nematoder, växter och ryggradsdjur, och finns i de flesta miljöer4,6. Enteriska infektion i Drosophila av P. aeruginosa och P. entomophila resulterar i patologi till intestinal epitel12,13,14,15, 28. Medan vi fokuserar på dessa två bakteriella patogener, kan metoderna som beskrivs här i princip gälla någon bakterie patogen sevärdheter med smärre ändringar. Efter oral exponering, vi mäter efter infektion överlevnad, och mäta den mikrob belastningen inom enskilda flugor och livskraftig mikrober skjul i miljön, uttryckt i kolonibildande enheter (CFUs). Slutligen, eftersom tarmen immunkompetens resultat från en kombination av epiteliala barriären och humorala svar, vi mäter också överlevnaden av fluglinor där dessa försvar störs. Specifikt, Drosocrystallin (Mattias) mutanter har tidigare visat sig vara mer mottagliga för oral bakteriell infektion på grund av ett utarmat peritrophic matris i gut29. Vi mäter också överlevnad i en Relish (Rel) mutant som hindras från att producera antimikrobiella peptider mot gramnegativa bakterier via IMD väg30.
Vi presenterar ett protokoll för tillförlitligt oralt infekterar D. melanogaster med bakteriella patogener. Vi fokuserar på P. aeruginosa och P. entomophila, men detta protokoll kan enkelt anpassas till aktivera infektion av andra bakteriearter, t.ex., Serratia marcescens7. Viktiga aspekter av detta protokoll kommer att variera mellan bakteriearter. Följaktligen bör den effektivaste infektiös dos, motsvarande virulens och värd genotyp känslighet alla vara ansedd och idealiskt testas i pilotstudier. Utsätta flyger till bakteriekulturer av en rad optiska densiteter och mäta deras smittsam dos och överlevnad är en lämplig utgångspunkt vid arbete med nya bakteriearter eller fluglinor.
Protokollstegen flyga såsom svält före utfodring och åter uppskjutande bakteriell pellets i 5% sackaroslösning vardagsmat i oral infektion och öka tillförlitligheten av bakteriell infektion under exponering7,8, 9 , 10. det är dock viktigt att notera att under exponering, flugor i huvudsak lever på en yta av bakterieodling. Håller på att gå på denna kultur, kommer bakterier fastna på flugans yta, särskilt på nagelbanden eller runt den borst24. Dessa epicuticular bakterier, återspeglar inte en framgångsrik enteriska infektion men fortfarande kan upptäckas av flyga homogenisering och plätering. För att minska risken för falsklarm, är det viktigt att ytan sterilisera flugor genom nedsänkning i 70% etanol för upp till 1 min.
När man överväger bakteriell shedding priser, är oral infektion viktigt. Antalet patogener en värd utsläpp i miljön är ofta svårt att mäta och den interna belastningen tas ofta som en proxy för svårighetsgraden av infektion och därför överföring26,27. Mäta bakteriehalten tillsammans med bakteriell shedding tillåter en undersökning av förhållandet mellan dessa två viktiga komponenter i sjukdom svårighetsgrad och spridning38. En begränsning med metoden presenteras är att testmetoder inre bakteriehalten av flugor kräver destruktiva provtagning. Detta gör att det är svårt att undersöka longitudinella trender av patogen tillväxt och platsförmedling inom en och samma individ. Det är dock möjligt att övervinna denna begränsning av destruktivt provtagning kohorter av individer i olika skeden av infektion, under antagandet att den genomsnittliga mikrob belastningen i varje kohort återspeglar längsgående patogen dynamiken inom varje given enskilda. Bakteriella sprider inte lider av samma begränsningar, och vi erbjuder exempel på hur shedding kan kvantifieras i ett tvärsnittsurvalet eller längsled för att utreda hur shedding ändras inom en individ över tid.
Många värd och patogen drag fastställa gemensamt en individs benägenhet att överföra sjukdomen25,26,39. Medan betydelsen av dessa egenskaper sannolikt varierar mellan värd-patogen system, är shedding sannolikt en avgörande betydelse för fekal-oral överföring. Förmågan att mäta bakteriell shedding öppnar möjlighet att testa detta antagande. Att ha kännetecknas värd-patogen dynamik i en önskad panel av fluglinor, kunde praktiker oralt infektera individer, och placera dem tillsammans med icke-infekterade, mottagliga värd under sin smittsamma perioder. Dessa ‘mottagare’ flugor kan sedan analyseras för interna bakteriehalten vid olika tidpunkter som ett sätt att direkt mäta överföringen.
Detta arbete stöds av en strategisk award från Wellcome Trust för centrum för immunitet, infektion och Evolution (http://ciie.bio.ed.ac.uk; grant referens nr 095831). PFV stöddes av ett Branco Weiss stipendium (https://brancoweissfellowship.org/) och en förbundskanslerns gemenskap (School of Biological Sciences, University of Edinburgh); JASJ stöddes av doktorand NERC E3 DTP.
Vials | Sarstedt Ltd. | 58.490 | Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002 | Agar, ash 2.0-4.5% |
Brown sugar | Bidvest | 66032 | Light brown soft sugar |
Maize | Dove's Farm | Organic maize flour | |
Fermipan yeast | Bidvest | 96360 | Dry, instant yeast |
Methyl-4-hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H5501 | >=99.0%, crystalline |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC) |
Petri dishes | Fisher Scientific UK Ltd. | 15788517 | X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent |
Falcon tubes (50ml) | Greiner Bio-one Inc | 210261 | Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile |
Eppendorf tube (0.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.699 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral |
Eppendorf tube (1.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.690.001 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral |
Ethanol | VWR International Ltd. | 20821.33 | ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE – Analytical Grade |
2 L Conical Flask | VWR International Ltd. | 214-0038 | Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask |
Sterile filter paper | Fisher Scientific UK Ltd. | 1001-020 | Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm |
Bijou sample container | Fisher Scientific UK Ltd. | 129A | 7ml polystyrene sample container |
Pseudomonas isolation agar | Sigma-Aldrich | 17208 | Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L |
LB broth, Miller | Fisher Scientific UK Ltd. | BP1426 | Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre |
Large Embryo Collection Cages | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 59-101 | Flystuff- fits 100mm petri dish |
TRI reagent solution | Life Technologies | AM9738 | |
96-well microplate | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 353072 | Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile |
Pestle | Fisher Scientific UK Ltd | 12649595 | Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk |
Glycerol | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | CHE2068 | Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L |
Cotton wool- non absorbent | Cowens Ltd | ABL | Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500 |
Cotton wool- absorbent | Cowens Ltd | ABS | BP small quantity 20 bags x 500 |
Vortex | Fisherbrand | Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V | |
Orbital incubator | Gallenkamp | INR-200-010V | 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0…400 rpm. |
Absorbance Microplate Reader | Biotek Instruments Ltd | ELx808™ Absorbance Microplate Reader | |
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek Instruments Ltd | For Absorbance Microplate Reader | |
Centrifuge | Beckman Coulter | 392304 | Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V |
Step One Plus Real Time qPCR System | Thermofisher Scientific | 4376600 | Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system |
Step One Software 2.3 | Thermofisher Scientific | For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems | |
R Statistical Software | https://cran.r-project.org/ | ||
10 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741015 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
200 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741065 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
1000 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741045 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
20 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 774288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
200 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 739288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
1000 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 740288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs |