ويصف هذا البروتوكول طرائق فضح شفويا وتصيب ذبابة الفاكهة المورفولوجية ميلانوجاستيr مع مسببات الأمراض البكتيرية، وقياس عدد تسليط البكتيريا المعدية عقب الإصابة بالقناة الهضمية. نحن كذلك وصف تأثير طفرات محصنة في بقاء يطير بعد العدوى البكتيرية عن طريق الفم.
ذبابة الفاكهة melanogaster المورفولوجية واحدة من أفضل النظم النموذجية المتقدمة من العدوى والحصانة الفطرية. بينما تركز معظم العمل على الأمراض الجهازية، كانت هناك زيادة الأخيرة الاهتمام في آليات السيلينيوم القناة الهضمية لمسببات الأمراض، التي تتطلب أساليب لتصيب شفويا الذباب. نقدم هنا بروتوكولا لفضح شفويا الذباب الفردية لمسببات الأمراض بكتيرية انتهازية (الزائفة الزّنجاريّة) والممرضات بكتيرية طبيعية من ميلانوجاستير دال (Pseudomonas انتوموفيلا). والهدف من هذا البروتوكول توفير وسيلة قوية لفضح الذباب الذكور والإناث لهذه العوامل الممرضة. نحن نقدم نتائج تمثيلية تظهر تعمل البقاء على قيد الحياة والأحمال ميكروب البكتيريا ذرف، التي ذات الصلة للدراسة من عدم التجانس في انتقال العوامل الممرضة. وأخيراً، نؤكد أن طفرات دسي (تفتقر إلى المصفوفة peritrophic الواقية في ظهارة الأمعاء) ونكهة طفرات (تفتقر إلى مسار وظيفي عوز المناعي (IMD))، وتظهر زيادة التعرض للعدوى البكتيرية عن طريق الفم. ولذلك، يصف هذا البروتوكول، وسيلة قوية لتصيب الذباب باستخدام الطريق الفموي للعدوى، التي يمكن أن تمتد إلى دراسة مصادر وراثية وبيئية متنوعة من التباين في نتائج الإصابة في الأمعاء وانتقال العدوى البكتيرية.
ذبابة الفاكهة (يعرف أيضا باسم ذبابة الخل)، ميلانوجاستير دال، قد استخدمت على نطاق واسع من ككائن نموذج للعدوى والحصانة ضد مجموعة متنوعة من العوامل الممرضة1،2. وعرضت أفكاراً أساسية في الآثار الفسيولوجية للإصابة بهذا العمل وكذلك كان رائدا في كشف المسارات الجزيئية الكامنة وراء المضيف الاستجابة المناعية ضد الالتهابات البكتيرية والفطرية والفيروسية الناتجة،. هذه المعرفة ليست فقط مفيدة لفهم الاستجابة المناعية الفطرية للحشرات واللافقاريات الأخرى، ولكن نظراً لأن العديد من الآليات المناعية هي تقحم المصانة بين الحشرات والثدييات، المورفولوجية حفزت أيضا اكتشاف الآليات المناعية الرئيسية في الثدييات، بما في ذلك البشر3.
ركزت معظم الأعمال في العدوى المورفولوجية والحصانة على الالتهابات الجهازية، استخدام أساليب التطعيم أن تسليم ممرضات مباشرة في جسم الحشرة بالثقب أو حقن4،،من56. الاستفادة من هذه الأساليب في السماح بإيصال جرعة المعدية التي تسيطر عليها واضحة ومدعومة بمجموعة كبيرة من الأعمال في العدوى الجهازية. ومع ذلك، العديد من مسببات الأمراض البكتيرية التي تحدث بشكل طبيعي من ميلانوجاستير دال- تكتسب عن طريق التغذية في تحليل المواد العضوية فيها السيلينيوم القناة الهضمية تلعب دوراً هاما في الدفاع المضيف7،8، 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15-التجارب التي توظف الانتانات الجهازية تجاوز هذه الدفاعات، وعليه، تقدم صورة مختلفة تماما عن كيفية تحميل الحشرات الدفاعات ضد الجراثيم الطبيعية. وهذا ذات الصلة لا سيما إذا كان الهدف من هذا العمل اختبار التوقعات حول البيئة وتطور الإصابة، حيث استخدام مسببات الأمراض الطبيعية وطرق العدوى هي مهمة16،17. العمل الأخيرة قد سلط الضوء على كيفية تأثير الطريق الذي سلكه بمسببات الأمراض إلى حد كبير على المرض نتيجة18،19، يتسبب مسارات مأمن متميزة20،21، يمكن تحديد تأثير واقية ورثت اندوسيمبيونتس16، وربما حتى تلعب دوراً هاما في تطوير دفاعات المضيف17.
سبب آخر لتوظيف الطرق الشفوية للإصابة أنه يسمح للتحقيق في الاختلاف في انتقال مسببات المرض عن طريق قياس ذرف البكتيرية أثناء إفراز البراز بعد العدوى عن طريق الفم22،23، 24. فهم مصادر المضيف عدم التجانس في انتقال المرض تحديا في السكان الطبيعي25،26، لكن قياس مكونات الإرسال، مثل الممرض ذرف، تحت المختبر التي تسيطر عليها ويوفر شروط نهج بديلة مفيدة27. بتغذية الذباب البكتيريا والبكتيريا قياس ذرف تحت مجموعة متنوعة من السياقات البيئية والوراثية في ظروف تجريبية خاضعة للرقابة، من الممكن تحديد مصادر التباين في انتقال بين المضيفين.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإصابة melanogaster دال شفويا مع مسببات الأمراض البكتيرية، ويتبع للتحديد الكمي للنمو البكتيري وذرف (الشكل 1). يصف لنا هذا البروتوكول على البكتيريا Pseudomonas هما: سلالة خبيثة من مسببات الأمراض الانتهازية الزّنجاريّة P. (PA14)، وسلالة أقل فتكاً الطبيعية يطير الممرض P. انتوموفيلا. بسيودومونادس البكتيريا سلبية الغرام المشترك مع مجموعة مضيف واسعة، إصابة الحشرات والديدان الخيطية والنباتات، والفقاريات، وتوجد في معظم البيئات4،6. نتائج الإصابة المعوية من المورفولوجية P. الزّنجاريّة و انتوموفيلا P. في علم الأمراض إلى ابيثيليا المعوية12،13،،من1415، 28. بينما نركز على هذه الجراثيم البكتيرية اثنين، الأساليب الموصوفة هنا يمكن من حيث المبدأ تطبيق لأي مسببات الأمراض البكتيرية للفائدة مع بعض التعديلات الطفيفة. عقب التعرض عن طريق الفم، ونحن قياس البقاء على قيد الحياة بعد الإصابة، وقياس الحمولة ميكروب داخل الذباب الفردية وتسلط الميكروبات قادرة على البقاء في البيئة، وأعرب في مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس). وأخيراً، لأن السيلينيوم القناة الهضمية نتيجة لمزيج من الحاجز الظهارية واستجابات خلطيه، نقيس أيضا بقاء خطوط الطيران حيث تتعطل هذه الدفاعات. على وجه التحديد، دروسوكريستالين (دسي) طفرات قد ثبت سابقا أن تكون أكثر عرضه للعدوى البكتيرية عن طريق الفم بسبب مصفوفة peritrophic مستنفد في القناة الهضمية29. ونحن أيضا قياس البقاء على قيد الحياة في متحولة المذاق (يختلط) التي تعوق من إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات ضد البكتيريا سلبية الغرام عبر مسار IMD30.
نقدم بروتوكول لإصابة melanogaster دال- موثوق بها شفويا مع مسببات الأمراض البكتيرية. علينا أن نركز على P. الزّنجاريّة و P. انتوموفيلا، ولكن هذا البروتوكول يمكن بسهولة أن تتكيف مع تمكين عدوى أنواع البكتيرية الأخرى، مثلاً، marcescens السراتية7. الجوانب الرئيسية لهذا البروتوكول سوف تختلف بين الأنواع البكتيرية. تبعاً لذلك، الجرعة المعدية الأكثر كفاءة وضراوة المقابلة والاستعداد الوراثي المضيف ينبغي كل نظر واختبارها من الناحية المثالية في الدراسات التجريبية. تعريض الذباب للثقافات البكتيرية طائفة من الكثافة البصرية وقياس الجرعة المعدية، والبقاء على قيد الحياة نقطة انطلاق ملائمة عند العمل مع أنواع بكتيرية جديدة أو خطوط الطيران.
خطوات البروتوكول يطير مثل المجاعة قبل التغذية وإعادة تعليق الكريات البكتيرية في محلول 5% شائعة في العدوى عن طريق الفم، وزيادة موثوقية العدوى البكتيرية أثناء التعرض7،8، 9 , 10-ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن الذباب خلال التعرض، تعيش أساسا على سطح الثقافة البكتيرية. عملية المشي على هذه الثقافة، سوف تصبح قدم البكتيريا على سطح للطيران، خاصة على بشرة أو حول شعيرات24. هذه البكتيريا ابيكوتيكولار، لا تعكس إصابة المعوية ناجحة ولكن سوف لا يزال الكشف عن تجانس يطير والطلاء. لتقليل احتمالات المغلوطة، من الضروري أن سطح تعقيم الذباب من خلال الانغماس في الإيثانول 70% لتصل إلى 1 دقيقة.
وعند النظر في معدلات ذرف البكتيرية، ضروري العدوى عن طريق الفم. العدد من العوامل الممرضة مجموعة إطلاقات إلى البيئة غالباً ما يصعب قياسه والحمولة الداخلية غالباً ما تؤخذ كوكيل لخطورة الإصابة ومن ثم نقل26،27. قياس الحمولة البكتيرية جنبا إلى جنب مع ذرف البكتيرية يسمح النظر في العلاقة بين هذين العنصرين هامة من خطورة وانتشار المرض38. واحد الحد من الأسلوب الذي قدم أن المعايرة الحمولة البكتيرية الداخلية من الذباب يتطلب أخذ العينات المدمرة. وهذا يجعل من الصعب على التحقيق في الاتجاهات الطولية النمو الممرض والتخليص داخل الفرد نفسه. ومع ذلك، من الممكن للتغلب على هذا القيد بشكل مدمر أخذ العينات الأفواج من الأفراد في مراحل مختلفة من الإصابة، على افتراض أن ميكروب متوسط الحمولة في كل فوج تعكس ديناميات الممرض طولية داخل أي معين الفردية. ذرف البكتيرية لا يعانون من نفس القيود، ونقدم أمثلة لكيفية تسليط يمكن قياسها كمياً في عينة مقطعية، أو طوليا للتحقيق في كيفية تسليط التغييرات داخل فرد على مر الزمن.
يشترك العديد من الصفات المضيف والممرض تحديد ميل الفرد لنقل المرض25،،من2639. بينما تتفاوت أهمية هذه الصفات المحتمل بين أنظمة المضيف الممرض، ذرف يرجح أحد المحددات رئيسية لانتقال البراز عن طريق الفم. القدرة على قياس ذرف البكتيرية يفتح الفرصة لاختبار هذا الافتراض. قد تتسم ديناميات المضيف الممرض في فريق المرجوة من خطوط الطيران، المجربون يمكن شفويا تصيب الأفراد، ووضعها جنبا إلى جنب مع المضيفين مصابة، عرضه خلال فترات المعدية. ثم يمكن أن تكون جزيئي هذه الذباب ‘المتلقي’ لتحميل البكتيرية الداخلية في نقاط زمنية مختلفة كوسيلة لقياس الإرسال مباشرة.
وأيد هذا العمل على جائزة استراتيجي من مؤسسة ويلكوم ترست للمركز للحصانة والإصابة وتطورها (http://ciie.bio.ed.ac.uk; منحة مرجع رقم 095831). وأيده فف زمالة برانكو فايس (https://brancoweissfellowship.org/) والزمالة المستشار (كلية العلوم البيولوجية، جامعة أدنبرة)؛ وأيد سنهم “الأدنى E3 النشر المكتبي الدكتوراه” يسي.
Vials | Sarstedt Ltd. | 58.490 | Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002 | Agar, ash 2.0-4.5% |
Brown sugar | Bidvest | 66032 | Light brown soft sugar |
Maize | Dove's Farm | Organic maize flour | |
Fermipan yeast | Bidvest | 96360 | Dry, instant yeast |
Methyl-4-hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H5501 | >=99.0%, crystalline |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC) |
Petri dishes | Fisher Scientific UK Ltd. | 15788517 | X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent |
Falcon tubes (50ml) | Greiner Bio-one Inc | 210261 | Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile |
Eppendorf tube (0.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.699 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral |
Eppendorf tube (1.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.690.001 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral |
Ethanol | VWR International Ltd. | 20821.33 | ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE – Analytical Grade |
2 L Conical Flask | VWR International Ltd. | 214-0038 | Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask |
Sterile filter paper | Fisher Scientific UK Ltd. | 1001-020 | Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm |
Bijou sample container | Fisher Scientific UK Ltd. | 129A | 7ml polystyrene sample container |
Pseudomonas isolation agar | Sigma-Aldrich | 17208 | Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L |
LB broth, Miller | Fisher Scientific UK Ltd. | BP1426 | Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre |
Large Embryo Collection Cages | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 59-101 | Flystuff- fits 100mm petri dish |
TRI reagent solution | Life Technologies | AM9738 | |
96-well microplate | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 353072 | Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile |
Pestle | Fisher Scientific UK Ltd | 12649595 | Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk |
Glycerol | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | CHE2068 | Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L |
Cotton wool- non absorbent | Cowens Ltd | ABL | Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500 |
Cotton wool- absorbent | Cowens Ltd | ABS | BP small quantity 20 bags x 500 |
Vortex | Fisherbrand | Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V | |
Orbital incubator | Gallenkamp | INR-200-010V | 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0…400 rpm. |
Absorbance Microplate Reader | Biotek Instruments Ltd | ELx808™ Absorbance Microplate Reader | |
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek Instruments Ltd | For Absorbance Microplate Reader | |
Centrifuge | Beckman Coulter | 392304 | Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V |
Step One Plus Real Time qPCR System | Thermofisher Scientific | 4376600 | Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system |
Step One Software 2.3 | Thermofisher Scientific | For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems | |
R Statistical Software | https://cran.r-project.org/ | ||
10 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741015 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
200 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741065 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
1000 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741045 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
20 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 774288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
200 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 739288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
1000 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 740288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs |