Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

شفوي من العدوى البكتيرية وإلقاء في melanogaster المورفولوجية

doi: 10.3791/57676 Published: May 31, 2018

Summary

ويصف هذا البروتوكول طرائق فضح شفويا وتصيب ذبابة الفاكهة المورفولوجية ميلانوجاستيr مع مسببات الأمراض البكتيرية، وقياس عدد تسليط البكتيريا المعدية عقب الإصابة بالقناة الهضمية. نحن كذلك وصف تأثير طفرات محصنة في بقاء يطير بعد العدوى البكتيرية عن طريق الفم.

Abstract

ذبابة الفاكهة melanogaster المورفولوجية واحدة من أفضل النظم النموذجية المتقدمة من العدوى والحصانة الفطرية. بينما تركز معظم العمل على الأمراض الجهازية، كانت هناك زيادة الأخيرة الاهتمام في آليات السيلينيوم القناة الهضمية لمسببات الأمراض، التي تتطلب أساليب لتصيب شفويا الذباب. نقدم هنا بروتوكولا لفضح شفويا الذباب الفردية لمسببات الأمراض بكتيرية انتهازية (الزائفة الزّنجاريّة) والممرضات بكتيرية طبيعية من ميلانوجاستير دال (Pseudomonas انتوموفيلا). والهدف من هذا البروتوكول توفير وسيلة قوية لفضح الذباب الذكور والإناث لهذه العوامل الممرضة. نحن نقدم نتائج تمثيلية تظهر تعمل البقاء على قيد الحياة والأحمال ميكروب البكتيريا ذرف، التي ذات الصلة للدراسة من عدم التجانس في انتقال العوامل الممرضة. وأخيراً، نؤكد أن طفرات دسي (تفتقر إلى المصفوفة peritrophic الواقية في ظهارة الأمعاء) ونكهة طفرات (تفتقر إلى مسار وظيفي عوز المناعي (IMD))، وتظهر زيادة التعرض للعدوى البكتيرية عن طريق الفم. ولذلك، يصف هذا البروتوكول، وسيلة قوية لتصيب الذباب باستخدام الطريق الفموي للعدوى، التي يمكن أن تمتد إلى دراسة مصادر وراثية وبيئية متنوعة من التباين في نتائج الإصابة في الأمعاء وانتقال العدوى البكتيرية.

Introduction

ذبابة الفاكهة (يعرف أيضا باسم ذبابة الخل)، ميلانوجاستير دال، قد استخدمت على نطاق واسع من ككائن نموذج للعدوى والحصانة ضد مجموعة متنوعة من العوامل الممرضة1،2. وعرضت أفكاراً أساسية في الآثار الفسيولوجية للإصابة بهذا العمل وكذلك كان رائدا في كشف المسارات الجزيئية الكامنة وراء المضيف الاستجابة المناعية ضد الالتهابات البكتيرية والفطرية والفيروسية الناتجة،. هذه المعرفة ليست فقط مفيدة لفهم الاستجابة المناعية الفطرية للحشرات واللافقاريات الأخرى، ولكن نظراً لأن العديد من الآليات المناعية هي تقحم المصانة بين الحشرات والثدييات، المورفولوجية حفزت أيضا اكتشاف الآليات المناعية الرئيسية في الثدييات، بما في ذلك البشر3.

ركزت معظم الأعمال في العدوى المورفولوجية والحصانة على الالتهابات الجهازية، استخدام أساليب التطعيم أن تسليم ممرضات مباشرة في جسم الحشرة بالثقب أو حقن4،،من56. الاستفادة من هذه الأساليب في السماح بإيصال جرعة المعدية التي تسيطر عليها واضحة ومدعومة بمجموعة كبيرة من الأعمال في العدوى الجهازية. ومع ذلك، العديد من مسببات الأمراض البكتيرية التي تحدث بشكل طبيعي من ميلانوجاستير دال- تكتسب عن طريق التغذية في تحليل المواد العضوية فيها السيلينيوم القناة الهضمية تلعب دوراً هاما في الدفاع المضيف7،8، 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15-التجارب التي توظف الانتانات الجهازية تجاوز هذه الدفاعات، وعليه، تقدم صورة مختلفة تماما عن كيفية تحميل الحشرات الدفاعات ضد الجراثيم الطبيعية. وهذا ذات الصلة لا سيما إذا كان الهدف من هذا العمل اختبار التوقعات حول البيئة وتطور الإصابة، حيث استخدام مسببات الأمراض الطبيعية وطرق العدوى هي مهمة16،17. العمل الأخيرة قد سلط الضوء على كيفية تأثير الطريق الذي سلكه بمسببات الأمراض إلى حد كبير على المرض نتيجة18،19، يتسبب مسارات مأمن متميزة20،21، يمكن تحديد تأثير واقية ورثت اندوسيمبيونتس16، وربما حتى تلعب دوراً هاما في تطوير دفاعات المضيف17.

سبب آخر لتوظيف الطرق الشفوية للإصابة أنه يسمح للتحقيق في الاختلاف في انتقال مسببات المرض عن طريق قياس ذرف البكتيرية أثناء إفراز البراز بعد العدوى عن طريق الفم22،23، 24. فهم مصادر المضيف عدم التجانس في انتقال المرض تحديا في السكان الطبيعي25،26، لكن قياس مكونات الإرسال، مثل الممرض ذرف، تحت المختبر التي تسيطر عليها ويوفر شروط نهج بديلة مفيدة27. بتغذية الذباب البكتيريا والبكتيريا قياس ذرف تحت مجموعة متنوعة من السياقات البيئية والوراثية في ظروف تجريبية خاضعة للرقابة، من الممكن تحديد مصادر التباين في انتقال بين المضيفين.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإصابة melanogaster دال شفويا مع مسببات الأمراض البكتيرية، ويتبع للتحديد الكمي للنمو البكتيري وذرف (الشكل 1). يصف لنا هذا البروتوكول على البكتيريا Pseudomonas هما: سلالة خبيثة من مسببات الأمراض الانتهازية الزّنجاريّة P. (PA14)، وسلالة أقل فتكاً الطبيعية يطير الممرض P. انتوموفيلا. بسيودومونادس البكتيريا سلبية الغرام المشترك مع مجموعة مضيف واسعة، إصابة الحشرات والديدان الخيطية والنباتات، والفقاريات، وتوجد في معظم البيئات4،6. نتائج الإصابة المعوية من المورفولوجية P. الزّنجاريّة و انتوموفيلا P. في علم الأمراض إلى ابيثيليا المعوية12،13،،من1415، 28. بينما نركز على هذه الجراثيم البكتيرية اثنين، الأساليب الموصوفة هنا يمكن من حيث المبدأ تطبيق لأي مسببات الأمراض البكتيرية للفائدة مع بعض التعديلات الطفيفة. عقب التعرض عن طريق الفم، ونحن قياس البقاء على قيد الحياة بعد الإصابة، وقياس الحمولة ميكروب داخل الذباب الفردية وتسلط الميكروبات قادرة على البقاء في البيئة، وأعرب في مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس). وأخيراً، لأن السيلينيوم القناة الهضمية نتيجة لمزيج من الحاجز الظهارية واستجابات خلطيه، نقيس أيضا بقاء خطوط الطيران حيث تتعطل هذه الدفاعات. على وجه التحديد، دروسوكريستالين (دسي) طفرات قد ثبت سابقا أن تكون أكثر عرضه للعدوى البكتيرية عن طريق الفم بسبب مصفوفة peritrophic مستنفد في القناة الهضمية29. ونحن أيضا قياس البقاء على قيد الحياة في متحولة المذاق (يختلط) التي تعوق من إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات ضد البكتيريا سلبية الغرام عبر مسار IMD30.

Protocol

1-الحفاظ على الذباب

  1. الحفاظ على الذباب في مل 23 قارورة من البلاستيك يحتوي على 7 مل من تقدم طازجة لويس المتوسطة (تعديل من مرجع31؛ المقطر ثلاثية ل 1 ح2س، ز 6.1 أجار، سكر بني ز 93.6، 68 ز الذرة، ز 18.7 الخميرة الفورية، 15 مل تيجوسيبت وكيل المضادة للفطريات) في الحاضنات في 25 ± 1 درجة مئوية، في h:12 12 دورة ح الضوء: الظلام مع الرطوبة ~ 60%. المكونات في قارورة مع ماصة غير القطن والصوف.
  2. بعد كل 14 يوما، نقل البالغين 20-30 لقنينة أغذية جديدة، مع الخميرة الفورية والجاف إضافة إلى السطح، لمدة 2 – 3 أيام للسماح بوضع البيض إلى حدوث. وبعد هذه الفترة الزمنية، ضمان أن البيض مرئية على سطح الطعام. إزالة الذباب الكبار.
    ملاحظة: هذا يبقى الذباب في القنينات كجيل واحد، يقابل سن السكان.
  3. اترك البيض إلى تطوير.
    ملاحظة: عند 25 درجة مئوية، الذباب الكبار ابدأ إلى اكلس من الخوادر في اليوم 11 ويستمر على مدى أيام 12 – 14.

2-إعداد الذباب التجريبية

  1. جمع بيض جيل الآباء في قفص جمع سكان/جنين على طبق أجار أبل 75 مل (لتر 1 ثلاثية المقطر ح2س، ز 30 أجار، السكروز ز 33، 330 مل عصير التفاح، 7 مل تيجوسيبت وكيل المضادة للفطريات) مع انتشار لصق خميرة (مزيج الخميرة الجافة مع المياه إلى اتساق مثل زبدة الفول السوداني). إضافة غارقة في المياه القطن والصوف إلى القفص توفير الرطوبة.
    ملاحظة: لتجنب الخلط الآثار الناجمة عن الاختلافات في كثافة تربية اليرقات، من المهم أن الذباب التجريبية في قنينات مختلفة وتربى في كثافة مماثلة. يتم تنفيذ الخطوة أعلاه لتجنب الخلط الآثار.
  2. احتضانها ل 24 ساعة عند 25 درجة مئوية في ح 12 h:12 دورة الضوء: الظلام حتى وضع البيض قد حدث. إذا كان هناك عدد قليل جداً من البيض بعد 24 ساعة، توفير أطول فترة تعود. استبدال لوحات أبل-أجار، والسماح بوضع البيض تحدث ح 24 مزيد.
  3. تأخذ لوحات أجار أبل محملة بالبيض من القفص السكان. إزالة أي الذباب الميت ولصق الخميرة المتبقية من أجار سطح الأرض.
  4. تغرق في أجار في 20 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) ولطف طرد البيض من أبل-أجار مع الرسام ما يرام. بينما علقت في برنامج تلفزيوني، نقل البيض إلى أنبوب الطرد مركزي 50 مل وترك لمدة 5 دقائق حتى البيض تنزل إلى القاع.
    ملاحظة: تم العثور على معظم البيض على الحافة الخارجية لاجار.
  5. إزالة بقص الجزء السفلي 4 مم طرف ماصة المصفاة p1000 واستخدام تلميح ماصة لرسم 1 مل من محلول، مأخوذ من الجزء السفلي من الأنبوب الطرد المركزي 50 مل. نقل هذا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل والسماح لها بتسوية.
    ملاحظة: عندما بيبيتينج بيض، الإفراج عن الأداة المكبس أكثر كفاءة من إطلاق سراح لطيف.
  6. إزالة بقص الجزء السفلي 4 مم طرف ماصة المصفاة p20. تعيين الماصة لوحدة تخزين المطلوب ورسم من الجزء السفلي من أنبوب ميكروسينتريفوجي.
    ملاحظة: مع الممارسة، حجم 5 ميليلتر يتضمن قرابة 100 بيض.
  7. الاستغناء عن البيض التي تم جمعها على الطعام وتترك لهم لتطوير للمبلغ المطلوب من الوقت.

3-البكتيرية الثقافة

  1. أن تنمو الثقافات انتوموفيلا P. و P. الزّنجاريّة ، تطعيم 10 مل مرق لوريا بيرتاني (رطل) مع 100 ميليلتر من مخزون البكتيرية المجمدة عند 30 درجة مئوية (P. انتوموفيلا) و 37 درجة مئوية (P. الزّنجاريّة)، على التوالي. اهتز 150 لفة في الدقيقة بين عشية وضحاها. ضمان أن ثقافة البكتيرية يصل إلى مرحلة التشبع.
  2. لضمان أن البكتيريا المستخدمة لتطعيم الذباب في مرحلة الأسى وسرعة النسخ المتماثل، تطعيم الثقافة بين عشية وضحاها إلى ثقافة فرعية جديدة، لوحدة التخزين المطلوب، في صباح اليوم التالي. تأكد من أن العدوى قبل 10% الحجم الإجمالي لثقافة فرعية.
    ملاحظة: يتطلب ارتفاع الإصابة عن طريق الفم. ولذلك من الضروري أن ينمو حجم كبير من الثقافة البكتيرية حيث أنه يمكن أن تنتج ما يكفي من ثقافة التطعيم للجرعة المطلوبة وحجم تجريبية. حساب ثقافة فرعية كم هو مطلوب لإنتاج الجرعات المعدية المطلوبة باستخدامsV المعادلة Ms = Mأناالخامسأنا، حيث M تمثل ثقافة قياس الكثافة الضوئية في 600 قيمة نيوتن متر (OD600) والخامس يمثل به وحدة التخزين. رسائل منخفض تشير إلى ما إذا كان يتم استخدام الثقافة كثقافة فرعية (s) أو جرعة معدية (ط).
  3. تنمو هذه ثقافة فرعية في قارورة مخروطية ل 2 في وحدة تخزين مثل أن يقع السطح لثقافة فرعية فقط (على الأكثر) أعلاه بداية المنحدر قارورة. لا شغل فوق هذه العلامة كما أنه سوف حيلة نمو البكتيريا.
  4. ضمان البكتيريا في هذه ثقافة فرعية في مرحلة النمو الأسى بقياس OD كل 30 دقيقة.
    ملاحظة: وهذا يحدث بعد 3 – 5 ح، حيث يصل ثقافة فرعية التطوير التنظيمي600 بين 0.6 – 0.8.
  5. صب كميات متساوية من هذا ثقافة فرعية عبر 50 مل أنابيب الطرد المركزي وتدور ثقافة فرعية في 2,500 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه البكتيريا. وبمجرد القريبون، إزالة وثم تدور المادة طافية مرة ثانية في الشروط المذكورة أعلاه تأكيد إزالة الغالبية العظمى من البكتيريا.
    ملاحظة: بيليه ضئيلة الحجم (أقل من 1 ملم في الطول) يؤكد ذلك.
  6. الجمع بين الكريات البكتيرية الأنابيب منفصلة بإعادة تعليق لهم في 5 مل من ثقافة فرعية طافية وإعادة ضم هذه الحلول في أنبوب واحد 50 مل. وتدور هذه الثقافة تتركز في 2,500 ز س لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية بيليه البكتيريا.
  7. إزالة المادة طافية وإعادة تعليق بيليه البكتيريا نهائياً في الماء محلول 5%. تحقق في التطوير التنظيمي وضبط الجرعة المعدية المطلوب (OD600 = 100 انتوموفيلا ص8 والتطوير التنظيمي600 = 2516، P. الزّنجاريّة28)، بإعادة تعليق الكريات في 5% محلول الماء إلى الحجم المطلوب.
    ملاحظة: كمية الماء محلول 5% تضاف يمكن حسابها باستخدام المعادلة في الخطوة 3.2.1 (MsVs = Mأناالخامسأنا).

4-شفويا إصابة الذباب

  1. للتأكد من الإصابة عن طريق الفم، تجويع الذباب عن ح 2 – 4 قبل التعرض للبكتيريا بنقل الذباب إلى قارورة أجار القياسية (1 لتر ثلاثية المقطر ح2س، ز 20 أجار، سكر بني ز 84، 7 مل تيجوسيبت وكيل المضادة للفطريات).
  2. تحضير القنينات العدوى بينما يتم يتم تجويع الذباب. جعل قنينة عدوى Pseudomonas قبل بيبيتينج ميليلتر 500 من أجار السكر القياسية إلى غطاء أنبوب عينة 7 مل وجففه. ضع قرص ورق الترشيح في الغطاء و "الماصة؛" 100 ميليلتر ثقافة البكتيرية مباشرة على القرص عامل التصفية. لمراقبة الأمراض، تحل محل ثقافة البكتيرية مع نفس الحجم من 5% محلول الماء على ورق الترشيح.
  3. إضافة الذباب واحد إلى أنبوب عينة وترك ح 18 – 24.
  4. تأكيد العدوى عن طريق الفم، أولاً تعقيم سطح الذباب فورا بعد التعرض للبكتيريا، بوضعها في 100 ميليلتر من الإيثانول 70% عن 20 – 30 س. الإيثانول واضافه 100 ميليلتر ثلاثي المقطر المياه ل 20-30 s قبل إزالة الماء. إضافة 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x وتجانسه الطاير.
  5. نقل هوموجيناتي إلى الصف العلوي للوحة 96-جيدا وإضافة 90 ميليلتر من 1 x برنامج تلفزيوني لكل بئر أدناه.
  6. متسلسل تمييع هذه العينة للتمييز قيم تتراوح من زيمبابوي. تأخذ 10 ميليلتر من هوموجيناتي في أعلى البئر، وهذا إضافة إلى البئر أدناه. كرر هذه الخطوة مع الثاني أيضا، نقل 10 ميليلتر الثالثة أيضا، وهلم جرا، لتخفيف المسلسل العديد من كما هو مطلوب.
    ملاحظة: من المهم أن تستخدم ماصة نصائح جديدة لكل مجموعة من تخفيف.
  7. لوحة تخفيف المسلسل على صفيحة أجار مغذيات رطل في 5 ميليلتر قطرات، ضمان إبقاء جميع قطرات منفصلة.
  8. احتضان لوحات أجار رطل بين عشية وضحاها في 30 و 37 درجة مئوية انتوموفيلا P. و P. الزّنجاريّة، على التوالي، والاعتماد كفوس مرئية.
    ملاحظة: حين المورفولوجية القناة الهضمية الميكروبات تتطلب ظروف نمو هوائية متميزة، انتقائية المتوسطة، على سبيل المثال Pseudomonas العزلة المتوسطة (PIM)، يمكن استخدام للتأكد من أن يتم حسابها فقط Pseudomonas كفوس.
  9. حساب عدد كفوس الواحد يطير بإحصاء عدد المستعمرات الحالية في إضعاف المسلسل حيث كفوس 10 – 60 تكون مرئية بوضوح. ثم ضرب عامل إضعاف الحالية لحساب العدد من البكتيريا في الطيران.
  10. إجراء تحليل إحصائي. عند الاقتضاء، تحويل كفوس الواحد يطير لتوزيع الطبيعي. القيام بذلك بسجل التحويل. بمجرد تحويله، استخدام "النماذج الخطية المعمم" (جلمس)30،،من3132 لاختبار كيف تختلف المجموعات المعاملة في كفوس الواحدة ذبابة (باستخدام حزم البرامج الإحصائية المتاحة عموما مثل ص33).
    ملاحظة: يمكن استخدام هوموجيناتي يطير المتبقية لقياس التعبير الجيني من خلال تحليل PCR (RT-qPCR) كمية النسخ العكسي. إصلاح في هوموجيناتي في 50 ميليلتر من كاشف عزل الحمض النووي الريبي واستخراج الحمض النووي الريبي وقياس التتر الجينات المناعية المحددة حسب RT-قبكر (انظر مثلاً، غوبتا و Vale16 لبروتوكول مفصل). التعبير عن وقائع محددة الجينات المناعية ينبغي تطبيع مستويات نسخة الجين التدبير المنزلي (أي، rp49) وأعربت كحظيرة تغيير بالنسبة إلى مراقبة الذباب باستخدام الأسلوب 2−ΔΔCt 31، 32،،من3334.

5-تسجيل حالة البقاء على الحياة بعد الإصابة

  1. إصابة الذباب شفويا كما هو موضح في الخطوة 4، 2.
  2. نقل المصابين أو الذباب التحكم من قنينات العدوى ذات الصلة بهم إلى مستوى لويس زجاجة وإبقاء الضوء الظلام في حاضنة عند 25 درجة مئوية في ح 12 h:12 دورة (أو الشروط المطلوبة). إبقاء الذباب حتى أنهم ماتوا.
  3. حساب عدد الذباب حي أو ميت في كل قنينة كل يوم، أو كلما تطلب الأمر.
  4. نقل الذباب إلى قارورة جديدة كل 5 أيام لتجنب الذباب يعلقوا في الغذاء.
  5. تقديم هذه البيانات منحنيات البقاء على قيد الحياة كابلان-ماير (كم) أو يعني قطع متناسبة مع بقاء ± سراج الدين. لتحليل تأثير عوامل عدة و/أو تفاعلاتها كل منهما مع الآخر استخدام حزمة إحصائية (على سبيل المثال، مجموعة "البقاء" في ص33) لتشغيل تحليل البقاء على قيد الحياة مثل نموذج "المخاطر النسبية كوكس"35.

6-قياس الحمولة البكتيرية

  1. في هذه النقطة الزمنية المطلوبة، نقل ذبابة مصاب واحد إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل.
  2. تعقيم سطح الذباب كما هو موضح في الخطوة 4، 4.
  3. مجانسة الطاير وتحديد مقدار الحمولة البكتيرية باستخدام البروتوكول هو موضح في الخطوات 4، 4، 5 – 10.

7-قياس ذرف البكتيرية

  1. قياس ذرف جنبا إلى جنب مع تحميل الداخلية.
  2. بعد الإصابة، نقل الذباب واحد إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب التي تحتوي على ~ 50 ميليلتر من لويس المتوسطة ح 24.
  3. إزالة الذباب لقياس الحمولة الداخلية (راجع الخطوة 6) وغسل الأنابيب مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x خلال فورتيكسينج بشدة عن 3 s.
  4. قياس كفوس في هذه المياه والصرف الصحي بالطلاء على أجار المغذيات رطل استخدام البروتوكول نفسه كما هو موضح في الخطوات 4.6-4.8.
  5. بعد الإصابة، نقل الذباب واحد إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب التي تحتوي على ~ 50 ميليلتر من لويس المتوسطة ح 24.
  6. نقل الذباب لأنابيب ميكروسينتريفوجي جديدة تتضمن ~ 50 ميليلتر لويس المتوسطة حاء – 24 أخرى يغسل الأنابيب الملوثة مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x من فورتيكسينج بشدة عن 3 s.
  7. قياس كفوس في هذه المياه والصرف الصحي بالطلاء على أجار المغذيات رطل استخدام نفس البروتوكول هو موضح في الخطوات 4.6-4.8.
  8. كرر الخطوات 7.2 و 7.3 وسجلات وفيات يطير في كل عملية نقل.

Representative Results

هنا، نحن نقدم نتائج توضيحية من التجارب حيث كانت مصابة melanogaster دال- شفويا مع P. الزّنجاريّة أو انتوموفيلا ص. يوضح الشكل 2 العدوى الشفوي الناجح من الذباب بعد فترة تعرض ح 12 أو 24 ساعة للثقافات البكتيرية OD600 = 25 و 100 P. الزّنجاريّة (الشكل 2A) و انتوموفيلا P. (الشكل 2 و ، ج)، على التوالي. ويوضح الشكل 2B أهمية استخدام ثقافة أكثر تركيزاً من انتوموفيلا P.، يتضح من الزيادة في الحمولة البكتيرية عند الذباب ويتعرض للثقافات البكتيرية لزيادة الكثافة البصرية. مسح P. الزّنجاريّة العدوى بنفس المعدل (الشكل 3) الذباب أوريغون R (أورير) من الذكور والإناث وتسلط على نفس العدد من كفوس P. الزّنجاريّة (الشكل 4 أ). عند المصابين انتوموفيلا P. ومع ذلك، تختلف الذباب أورير الذكور والإناث في عدد تسلط البكتيريا، بطريقة أن التغييرات على مر الزمن (الشكل 4 باء). يموت الذكور والإناث من P. الزّنجاريّة (الشكل 5A) و انتوموفيلا P. (الشكل 5B) بمعدلات مختلفة. ونرى أيضا أن تظهر طفرات دسي (التي تفتقر إلى المصفوفة peritrophic الواقية في ظهارة الأمعاء) وطفرات المذاق (التي تفتقر إلى مسار IMD حصانة وظيفية)، انخفاض البقاء على قيد الحياة بعد الزّنجاريّة P. P. انتوموفيلا و العدوى عن طريق الفم (الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة التخطيطي لبروتوكولات لقياس البقاء على قيد الحياة، وسفك، والحمولة البكتيرية الداخلية عقب العدوى عن طريق الفم في melanogaster المورفولوجية. مثال على 3 تجارب المحتملة عقب العدوى عن طريق الفم من ميلانوجاستير د. قياس 'بقاء' نقل الذباب واحدة للقنينات وتسجيل حياتها المصابة. قياس 'ذرف' بنقل الذباب واحد إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب مع 50 ميليلتر من المتوسطة لويس في عملية النداء الموحد. بعد 24 ساعة في الأنبوب، إزالة يطير ودوامه الأنبوب مع 100 ميليلتر من 1 x PBS. إزالة ولوحة هذا الحل في أجار المغذيات رطل لحساب سفك البكتيرية. قياس سفك في الطاير نفس طوليا، بنقل الذباب بأنابيب جديدة مع لويس المتوسطة في الحد الأقصى بعد 24 ساعة، والغسيل وطلاء الأنبوب الآن الملوثة. ويمكن قياس 'تحميل يطير الداخلية' باتخاذ المصابين السطحية، ويطير تعقيم أنه، والتجانس قبل أخيرا الطلاء هوموجيناتي في أجار المغذيات رطل. يمكن إجراء ذلك بعد أن تم قياس سفك لحساب كيفية 'تحميل الداخلية' وربط ذرف. ووجه نوهانين ب36أصلاً الرسم التوضيحي يطير المستخدمة في هذا الشكل. بتعديل الكتاب لمرافقة المنحنى المثال كابلان-ماير التي تؤخذ من ويكيميديا كومنز37. جميع الرسوم التوضيحية الأخرى الأصل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الجرعة المعدية للبكتيريا بعد الإصابة عن طريق الفم. (أ) الجرعة المعدية للذكور والإناث (أوريغون)-R الذباب عقب التعرض لثقافة P. الزّنجاريّة (OD600 = 25) على ح 12. وحسبت يعني وسراج الدين من 3 من الذكور و 3 من الإناث. (ب) الجرعة المعدية للإناث البرية من نوع أووتكروسيد عقب التعرض لواحد من أربعة انتوموفيلا P. الثقافات (OD600 = 100, 75 و 50 و 25) أو التحكم في 5% من محلول السكروز ح 24. الفرق الإحصائي (و3,76 = 18.567، ف < 0.001) في الجرعة المعدية بين التعرض العلاجات تتم الإشارة إليها باختلاف الحروف أعلاه أشرطة. الوسائل التي حسبت من الذباب 5 ل التطوير التنظيمي600 = 0 الجرعة، و 18-20 لكل جرعة أخرى. (ج) الجرعة المعدية للذكور والإناث (أوريغون)-R الذباب عقب التعرض لثقافة انتوموفيلا P. (OD600 = 100) ح 24. تم حساب متوسط وسراج الدين من 20 من الذكور والإناث 20. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تحميل الداخلية P. الزّنجاريّة في الذباب بعد العدوى عن طريق الفم. الذباب يعني ± SE الحمولة البكتيرية للذكور والإناث (أوريغون)-R عقب الإصابة الشفهي مع P. الزّنجاريّة (OD600 = 25) يصل إلى 168 ح ما بعد الإصابة. يتم حساب متوسط وسراج الدين لكل نقطة في الوقت من 3 أفراد. تحميل البكتيرية الداخلية ليطير إلى حد كبير يتغير بمرور الزمن (ف < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: البكتيريا ذرف عقب العدوى عن طريق الفم. (أ) P. الزّنجاريّة التخلص من الذباب نفسها المستخدمة في الشكل 3، يصل إلى 120 ساعة بعد الإصابة. وحسبت يعني وسراج الدين من 3 من الذكور و 3 من الإناث. (ب) انتوموفيلا P. تسلط من الذكور والإناث (أوريغون)-R الذباب بعد العدوى عن طريق الفم مع انتوموفيلا P. (OD600 = 100) يصل إلى 120 ساعة بعد الإصابة. تم حساب متوسط وسراج الدين من 34 من الذكور والإناث 38. P. الزّنجاريّة و P. انتوموفيلا، إلى حد كبير عدد كفوس يراق من ذبابة التغييرات على مر الزمن (ف < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: البقاء على قيد الحياة ذباب بعد العدوى البكتيرية الفموية. منحنيات البقاء على قيد الحياة كابلان-ماير (كم) من ولاية أوريغون-R (A) من الذكور والإناث الذباب بعد الإصابة الشفهي مع P. الزّنجاريّة (OD600 = 25) أو التحكم بنسبة 5% من محلول السكروز. تم حساب منحنى البقاء على قيد الحياة بعد كم من قارورة 4 من الذباب 20 كل مجموعة العلاج. (ب) أورير الذكور والإناث الذباب بعد العدوى عن طريق الفم مع انتوموفيلا P. (OD600 = 100). تم حساب منحنى البقاء على قيد الحياة بعد كم من 4 وحدة تحكم واحدة الذباب والذباب المصابة 34 لكل من الذكور والإناث. (ج) محصنة طفرات: دسي (المسخ مصفوفة دروسوكريستالين-بيريتروفيك) و يختلط (IMD المذاق متحولة)، عرضه انتوموفيلا P. (Pe), P. الزّنجاريّة (Pa14)، أو حل سكروز 5% عنصر تحكم. جميع الفئات المصابة يموت كثير أسرع من الذباب عنصر التحكم (p < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

نقدم بروتوكول لإصابة melanogaster دال- موثوق بها شفويا مع مسببات الأمراض البكتيرية. علينا أن نركز على P. الزّنجاريّة و P. انتوموفيلا، ولكن هذا البروتوكول يمكن بسهولة أن تتكيف مع تمكين عدوى أنواع البكتيرية الأخرى، مثلاً، marcescens السراتية7. الجوانب الرئيسية لهذا البروتوكول سوف تختلف بين الأنواع البكتيرية. تبعاً لذلك، الجرعة المعدية الأكثر كفاءة وضراوة المقابلة والاستعداد الوراثي المضيف ينبغي كل نظر واختبارها من الناحية المثالية في الدراسات التجريبية. تعريض الذباب للثقافات البكتيرية طائفة من الكثافة البصرية وقياس الجرعة المعدية، والبقاء على قيد الحياة نقطة انطلاق ملائمة عند العمل مع أنواع بكتيرية جديدة أو خطوط الطيران.

خطوات البروتوكول يطير مثل المجاعة قبل التغذية وإعادة تعليق الكريات البكتيرية في محلول 5% شائعة في العدوى عن طريق الفم، وزيادة موثوقية العدوى البكتيرية أثناء التعرض7،8، 9 , 10-ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن الذباب خلال التعرض، تعيش أساسا على سطح الثقافة البكتيرية. عملية المشي على هذه الثقافة، سوف تصبح قدم البكتيريا على سطح للطيران، خاصة على بشرة أو حول شعيرات24. هذه البكتيريا ابيكوتيكولار، لا تعكس إصابة المعوية ناجحة ولكن سوف لا يزال الكشف عن تجانس يطير والطلاء. لتقليل احتمالات المغلوطة، من الضروري أن سطح تعقيم الذباب من خلال الانغماس في الإيثانول 70% لتصل إلى 1 دقيقة.

وعند النظر في معدلات ذرف البكتيرية، ضروري العدوى عن طريق الفم. العدد من العوامل الممرضة مجموعة إطلاقات إلى البيئة غالباً ما يصعب قياسه والحمولة الداخلية غالباً ما تؤخذ كوكيل لخطورة الإصابة ومن ثم نقل26،27. قياس الحمولة البكتيرية جنبا إلى جنب مع ذرف البكتيرية يسمح النظر في العلاقة بين هذين العنصرين هامة من خطورة وانتشار المرض38. واحد الحد من الأسلوب الذي قدم أن المعايرة الحمولة البكتيرية الداخلية من الذباب يتطلب أخذ العينات المدمرة. وهذا يجعل من الصعب على التحقيق في الاتجاهات الطولية النمو الممرض والتخليص داخل الفرد نفسه. ومع ذلك، من الممكن للتغلب على هذا القيد بشكل مدمر أخذ العينات الأفواج من الأفراد في مراحل مختلفة من الإصابة، على افتراض أن ميكروب متوسط الحمولة في كل فوج تعكس ديناميات الممرض طولية داخل أي معين الفردية. ذرف البكتيرية لا يعانون من نفس القيود، ونقدم أمثلة لكيفية تسليط يمكن قياسها كمياً في عينة مقطعية، أو طوليا للتحقيق في كيفية تسليط التغييرات داخل فرد على مر الزمن.

يشترك العديد من الصفات المضيف والممرض تحديد ميل الفرد لنقل المرض25،،من2639. بينما تتفاوت أهمية هذه الصفات المحتمل بين أنظمة المضيف الممرض، ذرف يرجح أحد المحددات رئيسية لانتقال البراز عن طريق الفم. القدرة على قياس ذرف البكتيرية يفتح الفرصة لاختبار هذا الافتراض. قد تتسم ديناميات المضيف الممرض في فريق المرجوة من خطوط الطيران، المجربون يمكن شفويا تصيب الأفراد، ووضعها جنبا إلى جنب مع المضيفين مصابة، عرضه خلال فترات المعدية. ثم يمكن أن تكون جزيئي هذه الذباب 'المتلقي' لتحميل البكتيرية الداخلية في نقاط زمنية مختلفة كوسيلة لقياس الإرسال مباشرة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل على جائزة استراتيجي من مؤسسة ويلكوم ترست للمركز للحصانة والإصابة وتطورها (http://ciie.bio.ed.ac.uk; منحة مرجع رقم 095831). وأيده فف زمالة برانكو فايس (https://brancoweissfellowship.org/) والزمالة المستشار (كلية العلوم البيولوجية، جامعة أدنبرة)؛ وأيد سنهم "الأدنى E3 النشر المكتبي الدكتوراه" يسي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials Sarstedt Ltd. 58.490 Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml
Agar Sigma-Aldrich A7002 Agar, ash 2.0-4.5%
Brown sugar Bidvest 66032 Light brown soft sugar
Maize Dove's Farm Organic maize flour
Fermipan yeast Bidvest 96360 Dry, instant yeast
Methyl-4-hydroxybenzoate Sigma-Aldrich H5501 >=99.0%, crystalline
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC)
Petri dishes Fisher Scientific UK Ltd. 15788517 X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent
Falcon tubes (50ml) Greiner Bio-one Inc 210261 Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile
Eppendorf tube (0.5ml) Sarstedt Ltd. 72.699 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral
Eppendorf tube (1.5ml) Sarstedt Ltd. 72.690.001 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral
Ethanol VWR International Ltd. 20821.33 ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade
2 L Conical Flask VWR International Ltd. 214-0038 Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask
Sterile filter paper Fisher Scientific UK Ltd. 1001-020 Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm
Bijou sample container Fisher Scientific UK Ltd. 129A 7ml polystyrene sample container
Pseudomonas isolation agar Sigma-Aldrich 17208 Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L
LB broth, Miller Fisher Scientific UK Ltd. BP1426 Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre
Large Embryo Collection Cages Scientific Laboratory Supplies Ltd. 59-101 Flystuff- fits 100mm petri dish
TRI reagent solution Life Technologies AM9738
96-well microplate Scientific Laboratory Supplies Ltd. 353072 Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile
Pestle Fisher Scientific UK Ltd 12649595 Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk
Glycerol Scientific Laboratory Supplies Ltd. CHE2068 Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L
Cotton wool- non absorbent Cowens Ltd ABL Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500
Cotton wool- absorbent Cowens Ltd ABS BP small quantity 20 bags x 500
Vortex Fisherbrand Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V
Orbital incubator Gallenkamp INR-200-010V 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0...400 rpm.
Absorbance Microplate Reader Biotek Instruments Ltd ELx808™ Absorbance Microplate Reader
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software Biotek Instruments Ltd For Absorbance Microplate Reader
Centrifuge Beckman Coulter 392304 Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V
Step One Plus Real Time qPCR System Thermofisher Scientific 4376600 Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system
Step One Software 2.3 Thermofisher Scientific For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems
R Statistical Software https://cran.r-project.org/
10 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741015 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
200 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741065 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
1000 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741045 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
20 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 774288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
200 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 739288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
1000 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 740288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426, (6962), 33-38 (2003).
  2. Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster - from microbial recognition to whole-organism physiology. Nat Rev Immunol. 14, (12), 796-810 (2014).
  3. Bergman, P., Seyedoleslami Esfahani, S., Engström, Y. Drosophila as a Model for Human Diseases-Focus on Innate Immunity in Barrier Epithelia. Curr Top Dev Biol. 121, 29-81 (2017).
  4. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, (9), 1285-1294 (2009).
  5. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster. JoVE J Vis Exp. (99), e52613-e52613 (2015).
  6. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods San Diego Calif. 68, (1), 116-128 (2014).
  7. Nehme, N. T., et al. A Model of Bacterial Intestinal Infections in Drosophila melanogaster. PLOS Pathog. 3, (11), e173 (2007).
  8. Bou Sleiman, M. S., Osman, D., Massouras, A., Hoffmann, A. A., Lemaitre, B., Deplancke, B. Genetic, molecular and physiological basis of variation in Drosophila gut immunocompetence. Nat Commun. 6, 7829 (2015).
  9. Buchon, N., Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut homeostasis in a microbial world: insights from Drosophila melanogaster. Nat Rev Microbiol. 11, (9), 615-626 (2013).
  10. Kuraishi, T., Hori, A., Kurata, S. Host-microbe interactions in the gut of Drosophila melanogaster. Front Physiol. 4, (2013).
  11. Ha, E. -M., Oh, C. -T., Bae, Y. S., Lee, W. -J. A Direct Role for Dual Oxidase in Drosophila Gut Immunity. Science. 310, (5749), 847-850 (2005).
  12. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (42), 17378-17383 (2011).
  13. Apidianakis, Y., Pitsouli, C., Perrimon, N., Rahme, L. Synergy between bacterial infection and genetic predisposition in intestinal dysplasia. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (49), 20883-20888 (2009).
  14. Vodovar, N., et al. Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (32), 11414-11419 (2005).
  15. Chugani, S. A., Whiteley, M., Lee, K. M., D'Argenio, D., Manoil, C., Greenberg, E. P. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci. 98, (5), 2752-2757 (2001).
  16. Gupta, V., Vasanthakrishnan, R. B., Siva-Jothy, J., Monteith, K. M., Brown, S. P., Vale, P. F. The route of infection determines Wolbachia antibacterial protection in Drosophila. Proc R Soc B. 284, (1856), 20170809 (2017).
  17. Martins, N. E., Faria, V. G., Teixeira, L., Magalhães, S., Sucena, É Host Adaptation Is Contingent upon the Infection Route Taken by Pathogens. PLoS Pathog. 9, (9), (2013).
  18. Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. Thorax Injury Lowers Resistance to Infection in Drosophila melanogaster. Infect Immun. 82, (10), 4380-4389 (2014).
  19. Gupta, V., Stewart, C., Rund, S. S., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. (2017).
  20. Ferreira, ÁG., Naylor, H., Esteves, S. S., Pais, I. S., Martins, N. E., Teixeira, L. The Toll-Dorsal Pathway Is Required for Resistance to Viral Oral Infection in Drosophila. PLoS Pathog. 10, (12), (2014).
  21. Buchon, N., Broderick, N. A., Poidevin, M., Pradervand, S., Lemaitre, B. Drosophila Intestinal Response to Bacterial Infection: Activation of Host Defense and Stem Cell Proliferation. Cell Host Microbe. 5, (2), 200-211 (2009).
  22. Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
  23. Hori, A., Kurata, S., Kuraishi, T. Unexpected role of the IMD pathway in Drosophila gut defense against Staphylococcus aureus. Biochem Biophys Res Commun. 495, (1), 395-400 (2018).
  24. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased Internal and External Bacterial Load during Drosophila Aging without Life-Span Trade-Off. Cell Metab. 6, (2), 144-152 (2007).
  25. Ezenwa, V. O., et al. Host behaviour-parasite feedback: an essential link between animal behaviour and disease ecology. Proc R Soc B. 283, (1828), 20153078 (2016).
  26. McCallum, H., et al. Breaking beta: deconstructing the parasite transmission function. Phil Trans R Soc B. 372, (1719), 20160084 (2017).
  27. Vale, P. F., Choisy, M., Little, T. J. Host nutrition alters the variance in parasite transmission potential. Biol Lett. 9, (2), 20121145 (2013).
  28. Mulcahy, H., Sibley, C. D., Surette, M. G., Lewenza, S. Drosophila melanogaster as an Animal Model for the Study of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections In Vivo. PLoS Pathog. 7, (10), e1002299 (2011).
  29. Kuraishi, T., Binggeli, O., Opota, O., Buchon, N., Lemaitre, B. Genetic evidence for a protective role of the peritrophic matrix against intestinal bacterial infection in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci. 108, (38), 15966-15971 (2011).
  30. Myllymäki, H., Valanne, S., Rämet, M. The Drosophila Imd Signaling Pathway. J Immunol. 192, (8), 3455-3462 (2014).
  31. Lewis, E. A new standard food medium. Cold Spring Harb Protoc. 2014, (9), pdb.rec081414 (2014).
  32. Bolker, B. M., et al. Generalized linear mixed models: a practical guide for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 24, (3), 127-135 (2009).
  33. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  34. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nat Protoc. 3, (6), 1101-1108 (2008).
  35. Kalbfleisch, J. D., Prentice, R. L. The Statistical Analysis of Failure Time Data. 2nd Edition, Wiley-Blackwell. Hoboken, N.J. (2002).
  36. Nuhanen, B. Drosophila melanogaster, drawing.SVG. Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Drosophila-drawing.svg (2007).
  37. Accountalive. Example of a survival curve estimated by Kaplan-Meier method including 95% confidence limits. Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Kaplan-Meier-sample-plot.svg (2011).
  38. Susi, H., Vale, P. F., Laine, A. -L. Host Genotype and Coinfection Modify the Relationship of within and between Host Transmission. Am Nat. 186, (2), 252-263 (2015).
  39. Fellous, S., Duncan, A. B., Quillery, E., Vale, P. F., Kaltz, O. Genetic influence on disease spread following arrival of infected carriers. Ecol Lett. 15, (3), 186-192 (2012).
شفوي من العدوى البكتيرية وإلقاء في <em>melanogaster المورفولوجية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).More

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter