本议定书描述了用细菌病原体口服和感染果蝇果蝇 melanogaster 的方法, 并测定肠道感染后感染细菌的数量。进一步描述了免疫突变体对口腔细菌感染后蝇存活的影响。
果蝇是一种最发达的感染和先天免疫模型系统. 虽然大多数工作集中在全身感染, 最近有兴趣的机制肠道活性的病原体, 这需要方法, 口服感染苍蝇。在这里, 我们提出一个口头揭露个人苍蝇的机会细菌病原体 (铜绿假单胞菌) 和一个自然细菌病原体D… 本议定书的目的是提供一种可靠的方法, 以揭露男性和女性苍蝇对这些病原体。我们提供了具有代表性的结果, 显示生存表型, 微生物负荷和细菌脱落, 这是有关研究的异质性的病原体传播。最后, 我们确认Dcy突变体 (缺乏肠道上皮中的保护性 peritrophic 基质) 和津津乐道突变体 (缺乏功能性免疫缺陷 (IMD) 通路), 显示了细菌口腔感染的敏感性增加。因此, 本议定书描述了一种通过口服感染途径感染苍蝇的健壮方法, 可扩展到对肠道感染结局和细菌传播的各种遗传和环境来源的研究。
果蝇 (也称为醋蝇), D.黑腹, 已被广泛用作感染和免疫的模型有机体的各种病原体1,2。这项工作提供了对感染的生理后果的基本洞察力, 也开创了解开宿主免疫应答的分子路径寄生蜂, 细菌, 真菌和病毒感染。这种知识不仅有助于了解昆虫和其他无脊椎动物的先天免疫反应, 而且由于许多免疫机制在昆虫和哺乳动物之间进化保存, 因此,果蝇也促使发现哺乳动物的主要免疫机制, 包括人类的3。
大多数关于果蝇感染和免疫的工作都集中在全身感染上, 使用接种方法, 通过刺或注射4,5,6,将病原体直接送到昆虫体内。这些方法在允许分娩受控的传染性剂量方面的优势是明确的, 并得到了大量的全身性感染工作的支持。然而, 许多自然发生的细菌病原体的D.腹腹是通过喂养分解有机物, 在那里肠道活性发挥重要作用的主机防御7,8,9,10,11,12,13,14,15. 使用全身感染的实验绕过这些防御, 因此, 提供了一个完全不同的图片, 如何对昆虫安装防御的自然病原体。如果这项工作的目的是测试对感染的生态学和进化的预测, 那么使用自然病原体和感染途径是重要的16、17, 这一点尤其相关。最近的工作突出了病原体的路线如何对疾病结果产生重大影响18,19, 引出不同的免疫通路20,21, 可以确定的保护效果继承的 endosymbionts16, 甚至可能在主机防御的演化过程中扮演重要角色17。
使用口服感染途径的另一个原因是, 它允许通过测量口腔感染后粪便排泄过程中的细菌脱落来调查病原体传播的变化22,23, 24. 了解疾病传播中宿主异质性的来源在自然种群中具有挑战性25,26, 但在受控实验室中测量传播的成分, 如病原体脱落。条件提供了一种有用的替代方法27。通过在受控实验条件下, 通过喂养苍蝇细菌和测量细菌脱落的各种遗传和环境背景, 可以确定寄主之间传播的变异来源。
在这里, 我们描述了一个口头感染D.腹腹病毒与细菌病原体的协议, 并对细菌的生长和脱落进行量化 (图 1)。我们描述了两个铜绿假单胞菌的这个协议: 一个致命的菌株的机会病原体p. 绿脓杆菌(PA14), 和一个较小的毒株自然蝇病原体P. entomophila。Pseudomonads 是常见的革兰阴性菌, 具有广泛的寄主范围, 感染昆虫, 线虫, 植物和脊椎动物, 并在大多数环境中发现4,6。果蝇的肠道感染由铜绿假单胞菌和P. entomophila导致病理到肠道上皮细胞12,13,14,15, 28。虽然我们关注这两种细菌病原体, 这里所描述的方法原则上可以适用于任何细菌病原体的轻微修改。在口腔暴露后, 我们测量感染后的生存, 并测量的微生物负荷在个别苍蝇和可行的微生物流入环境中, 表示在菌落形成单位 (CFUs)。最后, 由于肠道活性的结果是上皮屏障和体液反应的结合, 我们也测量的生存, 这些防御中断的飞行线。具体地说, Drosocrystallin (Dcy)变种人以前被证明更容易受到口腔细菌感染, 原因是肠道中的 peritrophic 基质已耗尽29。我们还测量在一个津津有味 (相对) 突变体的生存, 这是阻碍了生产抗菌肽抗革兰阴性菌通过 IMD 路径30。
我们提出了一个可靠的口服感染的细菌病原体的D.腹腹病毒的协议。我们专注于铜绿假单胞菌和entomophila, 但该协议可以很容易地被修改, 以使其他细菌种类的感染,例如,沙雷质7.本议定书的关键方面将因细菌种类而异。因此, 最有效的感染剂量, 相应的毒力, 和宿主基因型易感性, 应考虑和理想的试验研究。将苍蝇暴露在各种光学密度的细菌培养中, 并测量其传染性剂量和存活率, 是与新的细菌物种或飞行线合作的适当起点。
在5% 蔗糖溶液喂养和重新悬浮细菌颗粒之前, 诸如苍蝇饥饿等协议步骤在口腔感染中司空见惯, 并提高了暴露期间细菌感染的可靠性7,8,9,10. 然而, 重要的是要注意, 在暴露期间, 苍蝇基本上生活在细菌培养的表面上。在这种文化的行走过程中, 细菌将会被放在苍蝇的表面上, 特别是在角质层或刚毛的24附近。这些表皮细菌, 不反映成功的肠道感染, 但仍将检测到的飞行均匀化和电镀。为了减少误报的可能性, 必须通过浸泡在70% 乙醇中对苍蝇进行表面杀菌, 以达到1分钟。
在考虑细菌脱落率时, 口腔感染是必不可少的。主机发布到环境中的病原体数量通常很难测量, 内部负载通常被视为感染严重性的代理, 因此传输2627。在细菌脱落的同时测量细菌负荷, 可以检查疾病严重性这两个重要组成部分之间的关系, 并进行38的传播。所提出的方法的一个局限性是, 测定苍蝇的内部细菌负荷需要破坏性抽样。这使得在同一个人中调查病原体生长和清除的纵向趋势变得困难。然而, 可以通过破坏性地抽样在不同感染阶段的个体群来克服这一限制, 假定每个队列中的平均微生物负荷反映了任何给定的纵向病原体动力学。个人。细菌脱落并没有受到同样的限制, 我们提供了如何在横断面样本中量化脱落的例子, 或者是纵向研究在一段时间内脱落的变化。
许多宿主和病原体特征共同决定了个人传播疾病的倾向25,26,39。虽然这些性状的意义可能不同于寄主病原体系统, 但脱落可能是粪便-口服传播的主要决定因素。测量细菌脱落的能力打开了测试这个假设的机会。实验者在所需的飞行线组中具有寄主病原体动力学特征, 可以对个体进行口服感染, 并在感染期间将其与未感染的敏感寄主一起放置。然后, 这些 ‘ 受体 ‘ 苍蝇可以检测的内部细菌负荷在不同的时间点作为直接测量传播的方式。
这项工作得到了来自免疫、感染和进化中心的康威信托基金 (http://ciie.bio.ed.ac.uk) 的一项战略奖的支持。PFV 得到了 Branco 维斯奖学金 (https://brancoweissfellowship.org/) 和总理奖学金 (爱丁堡大学生物科学学院) 的支持;JASJ 得到了 NERC E3 DTP 博士奖学金的支持。
Vials | Sarstedt Ltd. | 58.490 | Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002 | Agar, ash 2.0-4.5% |
Brown sugar | Bidvest | 66032 | Light brown soft sugar |
Maize | Dove's Farm | Organic maize flour | |
Fermipan yeast | Bidvest | 96360 | Dry, instant yeast |
Methyl-4-hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H5501 | >=99.0%, crystalline |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC) |
Petri dishes | Fisher Scientific UK Ltd. | 15788517 | X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent |
Falcon tubes (50ml) | Greiner Bio-one Inc | 210261 | Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile |
Eppendorf tube (0.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.699 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral |
Eppendorf tube (1.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.690.001 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral |
Ethanol | VWR International Ltd. | 20821.33 | ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE – Analytical Grade |
2 L Conical Flask | VWR International Ltd. | 214-0038 | Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask |
Sterile filter paper | Fisher Scientific UK Ltd. | 1001-020 | Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm |
Bijou sample container | Fisher Scientific UK Ltd. | 129A | 7ml polystyrene sample container |
Pseudomonas isolation agar | Sigma-Aldrich | 17208 | Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L |
LB broth, Miller | Fisher Scientific UK Ltd. | BP1426 | Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre |
Large Embryo Collection Cages | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 59-101 | Flystuff- fits 100mm petri dish |
TRI reagent solution | Life Technologies | AM9738 | |
96-well microplate | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 353072 | Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile |
Pestle | Fisher Scientific UK Ltd | 12649595 | Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk |
Glycerol | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | CHE2068 | Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L |
Cotton wool- non absorbent | Cowens Ltd | ABL | Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500 |
Cotton wool- absorbent | Cowens Ltd | ABS | BP small quantity 20 bags x 500 |
Vortex | Fisherbrand | Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V | |
Orbital incubator | Gallenkamp | INR-200-010V | 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0…400 rpm. |
Absorbance Microplate Reader | Biotek Instruments Ltd | ELx808™ Absorbance Microplate Reader | |
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek Instruments Ltd | For Absorbance Microplate Reader | |
Centrifuge | Beckman Coulter | 392304 | Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V |
Step One Plus Real Time qPCR System | Thermofisher Scientific | 4376600 | Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system |
Step One Software 2.3 | Thermofisher Scientific | For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems | |
R Statistical Software | https://cran.r-project.org/ | ||
10 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741015 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
200 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741065 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
1000 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741045 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
20 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 774288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
200 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 739288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
1000 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 740288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs |