פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי לחשוף ולהדביק את זבוב הפירות הים דרוזופילה melanogaster עם פתוגנים חיידקיים אורלית, וכדי למדוד את מספר חיידקים זיהומיות המחסן בעקבות זיהום במעיים. בהמשך נתאר את ההשפעה של החיסון מוטציות על הישרדות לעוף בעקבות זיהום חיידקי הפה.
אחת המערכות המפותחות דגם הטוב ביותר של זיהום, מולדת חסינות זבוב הפירות melanogaster דרוזופילה . בעוד רוב העבודה התמקדה זיהומים מערכתית, חלה עלייה לאחרונה עניין בהמנגנון של immunocompetence בטן פתוגנים, אשר דורשים שיטות להדביק אורלית זבובים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לחשוף אורלית זבובים בודדים של פתוגן חיידקי הזדמנותית (Pseudomonas aeruginosa), פתוגן חיידקי הטבעי של ד melanogaster (Pseudomonas entomophila). המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לספק שיטה חזקה לחשוף זבובים זכרים ונקבות למחלות אלה. אנו מספקים תוצאות נציג מציג פנוטיפים הישרדות, חיידק המון ובקטריאלי ששפך, אשר רלוונטי לצורך המחקר של הטרוגניות הפתוגן בשידור. לבסוף, אנו מאשרים מוטציות Dcy (שחסר המטריקס peritrophic מגן בתוך האפיתל הבטן), התענגת על מוטציות (שחסר שביל פונקציונלי חיסוני (IMD)), להראות רגישות מוגברת לזיהומים אוראלי חיידקי. פרוטוקול זה, לכן, מתאר שיטה חזקה כדי להדביק זבובים באמצעות תוואי אוראלי של זיהום, אשר ניתן להרחיב את המחקר של מקורות גנטיים וסביבתיים מגוון של וריאציה של תוצאות זיהום מעיים ושידור חיידקי.
זבוב הפירות (המכונה גם חומץ הזבוב), melanogaster ד, כבר בשימוש נרחב עבור זיהום, חסינות מפני מגוון רחב של פתוגנים1,2כאורגניזם מודל. עבודה זו הציעה תובנות יסוד ההשלכות הפיזיולוגיות של זיהום וחלוציות היה גם ב להתיר מסלולים מולקולריים שבבסיס התגובה החיסונית מארח נגד זיהומים חיידקים, פטריות, נגיפי צירעת האפידיוס. הידע הזה הוא לא רק שימושי להבין את התגובה החיסונית מולדת של חרקים, פרוקי רגליים אחרים, אבל מכיוון רבים של מנגנוני החיסון אבולוציונית נשמרים בין חרקים, יונקים, דרוזופילה יש גם התיישר גילוי מנגנוני החיסון הגדולות אצל יונקים, כולל בני אדם3.
רוב העבודה על זיהום דרוזופילה וחסינות התמקדה זיהומים מערכתית, תוך שימוש בשיטות חיסון לספק פתוגנים ישירות לתוך גופו של החרק על-ידי לדקור או הזרקה4,5,6. היתרון בשיטות אלה לאפשר המסירה של מנה זיהומיות מבוקר הוא נתמך על ידי גוף גדול של עבודה על זיהומים מערכתית וברורה. עם זאת, רבים פתוגנים חיידקיים טבעי של melanogaster ד נרכשים באמצעות האכלה על מפרקים את החומר האורגני שבו הבטן immunocompetence ממלאת תפקיד משמעותי מארח ההגנה7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. ניסויים שמעסיקים זיהומים מערכתית לעקוף את ההגנות האלה, לכן, מספקים תמונה שונה לגמרי של מה חרקים לטעון כנגד פתוגנים טבעי. זה רלוונטי במיוחד אם מטרת העבודה היא לבחון את תחזיות לגבי האקולוגיה והאבולוציה של זיהום, השימוש של פתוגנים טבעי ומסלולי לזיהום איפה חשוב16,17. העבודה האחרונה הדגישה איך המסלול נלקחה על ידי פתוגנים באופן משמעותי משפיע על המחלה התוצאה18,19, מעורר המסלולים החיסונית ברורים20,21, ניתן לקבוע את ההשפעה המגנה של בירושה endosymbionts16, עשוי גם לשחק תפקיד חשוב באבולוציה של המארח ההגנה17.
עוד סיבה להעסיק. את נתיבי דרך הפה של זיהום הוא שזה מאפשר החקירה של וריאציה הפתוגן בשידור על ידי מדידת ששפך חיידקי במהלך הפרשה בצואה בעקבות זיהום אוראלי22,23, 24. הבנת המקורות של המארח הטרוגניות תוך העברת המחלה מאתגר אוכלוסיות טבעי25,26, אך מדידת רכיבים של שידור, כגון הפתוגן ששפך, תחת מעבדתית מבוקרת תנאים מציע גישה חלופית שימושי27. על ידי חיידקים זבובים האכלה, מדידה בקטריאלי ששפך תחת מגוון רחב של הקשרי גנטיים וסביבתיים בתנאים מבוקרים ניסיוני, זה ניתן לזהות מקורות של וריאציה של העברה בין מחשבים מארחים.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אורלית שמאחורי הדבקת melanogaster ד עם פתוגנים חיידקיים, עבור לכימות את התפתחות חיידקים ושפך שעוקבת אחר (איור 1). אנו מתארים את פרוטוקול זה על שני החיידקים Pseudomonas : זן מדבק של המחלה הזדמנותית aeruginosa פ (PA14), זן פחות ארסית של הטבעי לטוס הפתוגן entomophila פ. Pseudomonads חיידקים גראם שליליים משותף עם מגוון המארחת רחב, להדביק חרקים, נמטודות, הצומח, בעלי חוליות, מצויים במרבית סביבות4,6. זיהום המעית של דרוזופילה aeruginosa פ ו entomophila פ תוצאות בפתולוגיה מעיים epithelia12,13,14,15, 28. בעוד אנו מתמקדים פתוגנים חיידקיים שני אלה, בשיטות המתוארות כאן באופן עקרוני ניתן להחיל על כל פתוגן חיידקי עניין עם שינויים מזעריים. בעקבות החשיפה אוראלי, אנו למדוד הישרדות לאחר הפגיעה, ולמדוד את העומס חיידק בתוך זבובים בודדים ושפך החיידקים קיימא לסביבה, הביע במושבה ויוצרים יחידות (CFUs). בסופו של דבר, כי הבטן immunocompetence היא תוצאה של שילוב של מחסום האפיתל ותגובות ההורמונאלית, אנו מודדים גם את ההישרדות של קווים לטוס לאן את ההגנות האלה הם שיבשו. באופן ספציפי, Drosocrystallin (Dcy) מוטציות בעבר הוכחו להיות רגישים יותר לזיהום חיידקי הפה עקב מטריצה peritrophic מדולדל הבטן29. אנחנו גם למדוד הישרדות מוטציה תבלינים (Rel) אשר מופרעת מיצירת פפטידים מיקרוביאלית כנגד חיידקים גראם שליליים באמצעות מסלול30IMD.
אנו מציגים פרוטוקול אמין אורלית שמאחורי הדבקת melanogaster ד עם פתוגנים חיידקיים. אנו מתמקדים aeruginosa פ ו פ entomophila, אבל פרוטוקול זה בקלות ניתן להתאים כדי לאפשר לזיהום חיידקי מינים אחרים, למשל, בסרישיה marcescens7. היבטים מרכזיים של פרוטוקול זה משתנה בין המינים חיידקי. בהתאם לכך, המינון זיהומיות היעילה ביותר המתאימים התקפה אלימה, המארח גנוטיפ הרגישות צריך כל להיות נחשב, אידיאלי נבדק במחקרים טייס. חשיפת זבובים לתרבויות חיידקי של מגוון של צפיפות אופטית ומדידת במינון זיהומיות והישרדות שלהם מהווה נקודת המתאימה בעת עבודה עם חיידקי של זנים חדשים או קווים לעוף.
פרוטוקול צעדים כגון לטוס רעב לפני האכלה, השעיית מחדש את חיידקי כדורי בפתרון 5% סוכרוז הם דבר שבשגרה, זיהום אוראלי, להגביר את המהימנות של זיהום חיידקי במהלך החשיפה7,8, 9 , 10. עם זאת, חשוב לציין כי במהלך החשיפה, זבובים בעצם חיים על משטח של התרבות חיידקי. בתהליך של הליכה על תרבות זו, חיידקים להיות נעוץ על פני השטח של הזבוב, במיוחד את הקוטיקולה או סביבו את הזיפים24. חיידקים epicuticular אלו, אינן משקפות את זיהום המעית מוצלח אבל עדיין יתגלה על ידי זבוב המגון ציפוי. כדי להפחית את האפשרות לקבלת תוצאות חיוביות שגויות, זה חיוני כדי משטח לחטא זבובים באמצעות טבילה אתנול 70% בעד 1דקות.
כאשר בוחנים את המחירים שפיכת חיידקי, זיהום אוראלי הוא חיוני. המספר של פתוגנים שלפונדקאי משחרר לתוך הסביבה הוא לרוב קשה למדוד, המטען הפנימי הוא נלקח לעיתים קרובות כמדד עבור חומרת הזיהום ולכן השידור26,27. מדידת עומס חיידקי לצד חיידקי ששפך מאפשר בחינת היחסים בין שני המרכיבים החשובים של חומרת והתפשטות מחלות38. מגבלה אחת של השיטה המובאת היא כי assaying עומס חיידקי פנימי של זבובים דורש דגימה הרסני. זה מקשה לחקור מגמות האורך של פתוגן צמיחה סיווג באותו בן אדם. עם זאת, זה אפשרי על מנת להתגבר על מגבלה זו על-ידי פגיעה דגימה גדודים של אנשים בשלבים שונים של זיהום, תחת ההנחה כי המטען חיידק הממוצע במדגם כל משקף הדינמיקה האורך פתוגן בתוך כל נתון בודדים. שפיכת חיידקי לא סובל אותן מגבלות, אנו מציעים דוגמאות איך שפיכת ניתן לכמת במדגם חתך הרוחב, או longitudinally כדי לחקור כיצד ששפך משתנה בתוך הפרט לאורך זמן.
תכונות המחשב המארח ופתוגן רבים במשותף לקבוע הנטייה של הפרט להעברת המחלה25,26,39. ואילו המשמעות של תכונות אלה סביר משתנה בין מערכות פתוגן-פונדקאי, ששפך הוא כנראה דטרמיננטה העיקריים של שידור בצואה אורלי. היכולת למדוד ששפך חיידקי פותח את ההזדמנות כדי לבדוק הנחה זו. שיש מאופיין פתוגן-פונדקאי dynamics בלוח הרצוי של קווי לעוף, ניסויים יכול בעל פה להדביק אנשים, והציבו אותם לצד המארחים נגוע, רגישים בתקופות זיהומיות שלהם. זבוב “נמענים” ואז יכול להיות לבדיקה פנימית לטעון חיידקי בנקודות זמן שונות כדרך ישירות מדידה שידור.
עבודה זו נתמכה על ידי פרס אסטרטגי מטרסט למרכז חסינות, זיהום של אבולוציה (הפניה גרנט http://ciie.bio.ed.ac.uk; מס 095831). PFV נתמך על ידי מלגת ברנקו וייס (https://brancoweissfellowship.org/) ואחווה של הקנצלר (בית הספר למדעי הביולוגיה, אוניברסיטת אדינבורו); JASJ נתמכה על ידי studentship NERC E3 DTP PhD.
Vials | Sarstedt Ltd. | 58.490 | Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002 | Agar, ash 2.0-4.5% |
Brown sugar | Bidvest | 66032 | Light brown soft sugar |
Maize | Dove's Farm | Organic maize flour | |
Fermipan yeast | Bidvest | 96360 | Dry, instant yeast |
Methyl-4-hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H5501 | >=99.0%, crystalline |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC) |
Petri dishes | Fisher Scientific UK Ltd. | 15788517 | X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent |
Falcon tubes (50ml) | Greiner Bio-one Inc | 210261 | Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile |
Eppendorf tube (0.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.699 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral |
Eppendorf tube (1.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.690.001 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral |
Ethanol | VWR International Ltd. | 20821.33 | ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE – Analytical Grade |
2 L Conical Flask | VWR International Ltd. | 214-0038 | Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask |
Sterile filter paper | Fisher Scientific UK Ltd. | 1001-020 | Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm |
Bijou sample container | Fisher Scientific UK Ltd. | 129A | 7ml polystyrene sample container |
Pseudomonas isolation agar | Sigma-Aldrich | 17208 | Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L |
LB broth, Miller | Fisher Scientific UK Ltd. | BP1426 | Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre |
Large Embryo Collection Cages | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 59-101 | Flystuff- fits 100mm petri dish |
TRI reagent solution | Life Technologies | AM9738 | |
96-well microplate | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 353072 | Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile |
Pestle | Fisher Scientific UK Ltd | 12649595 | Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk |
Glycerol | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | CHE2068 | Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L |
Cotton wool- non absorbent | Cowens Ltd | ABL | Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500 |
Cotton wool- absorbent | Cowens Ltd | ABS | BP small quantity 20 bags x 500 |
Vortex | Fisherbrand | Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V | |
Orbital incubator | Gallenkamp | INR-200-010V | 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0…400 rpm. |
Absorbance Microplate Reader | Biotek Instruments Ltd | ELx808™ Absorbance Microplate Reader | |
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek Instruments Ltd | For Absorbance Microplate Reader | |
Centrifuge | Beckman Coulter | 392304 | Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V |
Step One Plus Real Time qPCR System | Thermofisher Scientific | 4376600 | Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system |
Step One Software 2.3 | Thermofisher Scientific | For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems | |
R Statistical Software | https://cran.r-project.org/ | ||
10 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741015 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
200 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741065 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
1000 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741045 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
20 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 774288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
200 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 739288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
1000 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 740288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs |