Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van de aanbevolen procedures voor het evalueren van de ademhalingsfunctie in bewuste muizen door dubbele-kamer plethysmography.
Lucht volumeveranderingen gemaakt door een bewuste ademhaling spontaan binnen een vak hoofdtekst die onderworpen zijn aan de basis van plethysmography, een techniek gebruikt ter beoordeling van niet-gebeurt voor sommige functies van de ademhalingsfunctie bij de mens zo goed zoals in proefdieren. Dit artikel richt zich op de toepassing van de dubbele-kamer plethysmography (DCP) in kleine dieren. Het geeft achtergrondinformatie over de methodologie, alsmede een gedetailleerde stapsgewijze procedure te beoordelen met succes ademhalingsfunctie in bewuste, ademhaling spontaan dieren in een niet-invasieve wijze. De DCP kan worden gebruikt om te controleren de ademhalingsfunctie van meerdere dieren in parallel, alsmede over de veranderingen bij aërosol stoffen over een gekozen periode te identificeren en op een herhaalde wijze. Experimenten op controle en allergische muizen worden hierin gebruikt om te tonen het nut van de techniek, verklaren het bijbehorende uitkomst parameters, evenals over het bespreken van de bijbehorende voordelen en tekortkomingen. Over het algemeen biedt de DCP geldig en theoretisch geluid uitlezingen die kunnen worden vertrouwd om te evalueren van de ademhalingsfunctie bewuste Kleindieren na uitdagingen met aërosol stoffen zowel op de basislijn.
Het toenemende gebruik van kleine dieren naar menselijke aandoeningen van de luchtwegen met model heeft aangespoord de ontwikkeling van technieken voor het kwantitatief beoordelen de functies van de luchtwegen in deze dieren. Op dit moment wordt de gedwongen trilling techniek (FOT) erkend als de meest nauwkeurige aanpak om te beoordelen van respiratoire mechanica in kleine dieren1,2. Echter, zoals aangegeven door de onzekerheidsrelatie fenotypering, wat is opgedaan in de precisie van de meting met de FOT wordt verhandeld af tegen een verlies in noninvasiveness3. Inderdaad, FOT metingen zijn verworven onder zeer gecontroleerde experimentele omstandigheden die noodzakelijk maken van anesthesie, tracheotomie of mondelinge intubatie, evenals mechanische ventilatie; een scenario verre van levensechte.
In situaties waar de experimentele eisen absolutistisch van het gebruik van verdovende middelen of bel voor weinig of geen afwijking van de natuurlijke fysiologische toestand van het dier, kan dubbele-kamer plethysmography (DCP) worden beschouwd. Zoals de naam al aangeeft, bestaat een DCP-setup uit twee verbonden rigide kamers gebouwd om het hoofd van het dier (of neus), in de voorste kamer, van haar borst, zo hermetisch mogelijk te isoleren in de achterste zaal. Binnen de instelling, het dier is bewust en spontaan ademt terwijl wordt ingehouden. Omdat de muren van de kamers niet kunnen uitbreiden of intrekken, genereert de beweging van lucht en van het dier een overeenkomstige maar tegenovergestelde golfvorm binnen de achterste zaal, als gevolg van de compressie/decompressie van de omringende lucht. De golfvorm als gevolg van de nasale stroming in de voorste kamer en degene aan de thoracale beweging in de achterste zaal gerelateerde kan dus worden gescheiden en tegelijkertijd gevangen. Afhankelijk van het ontwerp van de DCP-instellingen, kunnen deze golfvormen worden verkregen met behulp van een set van druk transducers of pneumotachographs respectievelijk de wijzigingen opnemen in kamer druk of luchtstroom en van de kamers als een functie van de tijd. De laatste benadering komt tegenwoordig vaker voor.
Terwijl het dier ademhaling frequentie nauwkeurig kan worden bepaald door allerlei plethysmography technieken, is de situatie niet hetzelfde voor de bepaling van ademhalingsvolume en bijbehorende parameters van de verwante ventilatie (bijvoorbeeld, minuut ventilatie, expiratoire volume, enz.). In tegenstelling tot de gehele lichaam plethysmograph (WBP) techniek, waar het dier ademhalingsvolume wordt geschat uit de doos signaal4,5, biedt de DCP-techniek nauwkeurige beoordeling van ademhalingsvolume. Dit is gerelateerd aan de rechtstreekse aankoop van de thoracale beweging van het dier in de achterste zaal, die in verhouding staan tot de veranderingen in het volume van de longen tijdens de ademhaling.
Naast deze nauwkeurige ventilatoire parameters (bijvoorbeeld, ademhalingsvolume ademhaling frequentie en minuut ventilatie), sommige verstoringen in de vorm van de respiratoire cyclus kunnen ook worden gebruikt om te onderzoeken van neuronale aspecten waaraan de respiratoire station of respiratoire reflexen. Een concreet voorbeeld van die toepassing zou de evaluatie van het potentieel van de irritatie van geïnhaleerde stoffen op de bovenste luchtweg sensorische neuronen6. Hier, wordt de duur van een pauze bij de aanvang van de verlooptijd bepaald met behulp van een parameter met de naam van einde-inspiratory pauze (EIP), ook wel aangeduid als de duur van6remmen. De verlenging van deze pauze door een irriterende stof wordt geassocieerd met de sluiting van het dier glottis, veroorzaakt een meetbare periode van remmen in het eerste deel van de vervaldatum6,7.
Een ander belangrijk voordeel van de DCP is dat het voorziet twee gevalideerde en onbetwiste parameters die gevoelig voor luchtstroom obstructie zijn. Een heet de stroom bij midden-getijde expiratoire volume en is afgekort EF508,–9,10. Het is de luchtstroom bij midway volume van elke getijde ademhaling tijdens de vervaldatum. EF50 wordt gewonnen uit de trace thoracale stroom en kan dus worden gemeten zonder de voorste kamer (dat wil zeggen, in een configuratie met hoofd-out). De andere heet specifieke luchtwegen-weerstand en is afgekort sRaw11,12,13. De vaststelling van sRaw vereist de gelijktijdige opname van de nasale en thoracale stromen van het dier zoals het is berekend op basis van de tijdvertraging tussen deze afzonderlijke respiratoire sporen op het punt van nul stroom aan het einde van inspiratie. De grondgedachte die beschrijft de basis waaraan deze vertraging heeft betrekking op sRaw was expatiated eerder11. Simpel gezegd, de veranderingen in het volume van de Long voorafgaan aan de luchtbeweging aangezien een drukverschil moet ontwikkelen om station luchtstroom. In een gezond dier rustig ademen, is deze vertraging doorgaans zeer klein. Het drukverschil dat vereist is voor een bepaalde stroom (b.v., een voldoende voor voldoende ventilatie stroom) wordt echter beïnvloed door de mate van weerstand van de luchtwegen. Tijdens de bronchoconstrictie, bijvoorbeeld, is het verloop van de druk die nodig is voor een bepaalde stroom groter, wat impliceert dat het dier moet harder werken om te ademen. Een groter verloop van druk in de borstkas van het dier houdt ook in dat een groter deel van de stroom en van de achterste kamer is te wijten aan decompressie/compressie van lucht in de thorax, dat is het gedeelte van de totale thoracale expansie/retractie thats uit fase waarbij de nasale luchtstroom. De verhoogde weerstand als gevolg van bronchoconstrictie zal dus toenemen de vertraging tussen de achterkant en de voorkant kamers en daardoor verhoogt sRaw. Het verloop van de druk die luchtstroom en van de longen drijft wordt ook beïnvloed door het volume van de eerste thoracale gas (TGV). Bij een grotere TGV bijvoorbeeld de uitbreiding/intrekking van de thorax nodig om te genereren een bepaalde gradatie van druk groter is (gewoon omdat de verschuiving van de omvang die nodig is voor het genereren van een bepaald verloop van druk groter is), wat ook inhoudt dat de dier heeft om harder te werken om te ademen. Nogmaals, deze extra thoracale verplaatsingen zijn degenen die nodig zijn om het te decomprimeren/compress lucht in de thorax en zijn dus uit fase waarbij de nasale luchtstroom. Dus, een verhoogde TGV de vertraging tussen de kamers ook zal toenemen en daarmee verhoogt sRaw. Zoals gezien kan worden, resulteren zowel bronchoconstrictie en verhoogde TGV in een meer belangrijke inspanning te trekken van de lucht en van de longen. Dit is in wezen de fysiologische betekenis van sRaw. Het vertegenwoordigt de werkzaamheden die nodig zijn voor de ademhaling van5,14.
Het is dus belangrijk om te begrijpen dat twee afzonderlijke factoren sRaw beïnvloeden: luchtwegen-weerstand en TGV. In feite, kan sRaw worden uitgedrukt als het product van de weerstand van de luchtwegen en TGV11. Bewuste dieren kunnen wijzigen hun TGV bij zal, wat betreft hun ventilatie aan een bepaalde omgeving passen. Onder dergelijke omstandigheden, waar de natuurlijke fysiologische toestand van het dier ongewijzigd is, is het dus onmogelijk om te onderscheiden of een verandering in sRaw vloeit uit een verandering in de luchtwegen-weerstand, een verandering in de TGV of uit een mix van de twee voort. Vandaar, is het aanbevolen als aanvulling op de evaluatie van de DCP met meer invasieve metingen van respiratoire mechanica en/of Long volumen, zoals die welke door de FOT1,15.
Tot op heden, is de DCP gebruikt in verschillende toepassingen van het onderzoek. De techniek kan worden gebruikt met of zonder de hoofd vergaderzaal kwantitatief en nauwkeurig evalueren van het effect van verschillende stoffen, zoals farmaceutische agenten, allergenen, irriterende stoffen of andere bemiddelaars, op ademhalingsfunctie in bewuste kleine dieren 16,17,18. De voorste kamer kan ook worden gebruikt als een bloot kamer aërosol stoffen of verschillende gas concentraties (hypoxie, hypercapnie, enz.)19. Handig, het maakt het mogelijk om gelijktijdig de acute effecten van deze stoffen te meten. In feite, is een van de gemeenschappelijke toepassingen van de DCP ter beoordeling van de mate van alertheid op aërosol methacholine in verschillende modellen van respiratoire aandoeningen20,21,22,23, 24 , 25.
Hoewel de DCP-techniek schijnbaar eenvoudig is, kon enkele praktische uitdagingen potentieel onervaren gebruikers ontmoedigen of afbreuk doen aan de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de resultaten. De huidige paper geeft een gedetailleerde beschrijving van de aanbevolen procedures voor het met succes opnemen ademhalingsfunctie door DCP in bewuste, ingetogen, spontaan ademhaling muizen. De beschrijving is specifiek voor de vermelde uitrusting (Zie de Tabel van de materialen). Het nut en de waarde van de DCP wordt ook aangetoond in een gemeenschappelijk model van pulmonaire allergische ontsteking in twee muizenstammen getest op basislijn en in reactie op aërosol methacholine.
De mogelijkheid voor het meten van de longfunctie bij bewuste dieren is duidelijk gerechtvaardigd in het respiratoir onderzoek. In het algemeen, is de DCP een interessante benadering om te evalueren van de functie van de ventilatie van de luchtwegen in de bewuste en spontaan ademhaling dieren26. Meer in het bijzonder, balans de DCP, of de variant van de hoofd-out, vaak een juiste tussen de kwaliteit van de verstrekte informatie en het gewenste niveau van invasiviteit3 (tabel 2). De techniek kan worden aangepast aan verschillende soorten (bijvoorbeeld, muis, rat, cavia) of dierlijke maten en kan worden gebruikt in vele toepassingen van het onderzoek. Het is vooral handig om te beoordelen van talloze dieren tegelijk in een parallelle studie ontwerp met de ademhalingsfunctie op herhaalde wijze controleren, en het opnemen van de kinetiek van een antwoord na verloop van tijd. Bovendien, de techniek is eenvoudig en relatief tijdig kan worden geleerd. In het huidige document, een protocol met DCP-metingen bij muizen werd gebruikt als een voorbeeld om te beschrijven de praktische aspecten van dit plethysmography techniek alsmede ingetogen over de kritische stappen bespreken en gerelateerde resultaten.
Wanneer u werkt met bewuste dieren, is het essentieel om te bepalen van de voorwaarden van de omgeving (bijvoorbeeld, rustige kamer met een beperkt aantal mensen of activiteit) om reproduceerbare resultaten genereren. Aangezien de fixeren in diverse afmetingen komen, is het belangrijk om te beginnen met de juiste grootte, zodat de ademhaling bewegingen zijn onverstoorbaar. Is het ook nuttig en vaak nodig om te acclimatiseren van de dieren aan de experimentele opstelling en procedures, zoals het is reeds lang gevestigd in muizen dat beteugeling van invloed is op de ademhaling frequentie12. Afhankelijk van de proefopzet of voorwaarden, kunnen meerdere sessies van incrementele duur nodig zijn. Tot slot, zodat de tijd aan het begin van een experiment voor de dieren aan te passen aan de verandering van de kamer en de noodzakelijke behandeling is een eenvoudige overweging die effectief zijn om ervoor te zorgen bewezen dat het patroon van de ademhaling consequent regelmatige en ontspannen op de basislijn is. Werken onder omstandigheden waar de dieren comfortabel, goed aangepast, en rustig zijn zal ook gunstig qua resultaat variabiliteit en kwaliteit zijn. Het beperkt ook een stress-geïnduceerde release van catecholamine, die kan vergroten airway kaliber en een geïnduceerde bronchoconstrictie verzachten.
Het is belangrijk te begrijpen dat er een noodzaak om te scheiden als hermetisch mogelijk de nasale en thoracale stromen. Afhankelijk van het systeem of de soort studeerde, kan de verzegeling mechanisme variëren in vorm zo goed zoals in werkzaamheid. In de DCP we hierin beschreven, wordt het zegel gemaakt tussen de snuit van het dier en de beteugeling apparaat. Bij de beoordeling van de ademhalingsfunctie door DCP, is het ook essentieel om te voorzien van een voldoende en continu bias stroom, zoals een afname van de hoeveelheid zuurstof beschikbaar aan het dier leiden significante effecten tot zal. Rekening houdend met het welzijn van het dier in de afdekking beperkt de neiging voor lucht lekken gemaakt door agitatie en daardoor maximaliseert de kwaliteit van de gegevens. Productiestappen, een verbreking van de verzegeling zal resulteren in afgewezen datasets of een onderschatting van het aantal parameters.
Daarnaast opdat de afzonderlijke opname van het signaal van de nasale stroom, wordt de hoofd kamer meestal gebruikt om het dier te aërosol stoffen bloot te stellen. Zoals geïllustreerd in dit artikel, kan dit worden gebruikt voor het uitvoeren van een test van de bronchoprovocation om aan te tonen verschillende mate van responsiviteit. In dergelijke experimenten, aanpassing van het aantal geteste concentraties kan nodig zijn afhankelijk van de soort, stam of geslacht van de dieren studeerde. Als eerder bewezen8,9,10,27tonen de huidige resultaten aan dat de methacholine-geïnduceerde veranderingen in sRaw gecorreleerd met invasieve FOT metingen van de weerstand van de luchtwegen. De resultaten tonen ook aan dat de DCP-techniek niet zo gevoelig als de FOT voor haar vermogen is te detecteren van respiratoire dysfunctie en te identificeren van een veranderde respons gelokaliseerd binnen de lagere compartimenten van de longen (longweefsel en/of kleine perifere airways) . Omdat de luchtwegen van het dier intact zijn, de aanwezigheid van de bovenste luchtwegen, die goed is voor het grootste deel van de totale respiratoire weerstand luchtstroom28, kan invloed hebben op de distributie van spuitbussen en afzetting in de toevoeging aan het temperen van de bijdrage van de lagere luchtwegen klem zitten op een meting. Tabel 3 geeft een overzicht van andere verschillen tussen de DCP-techniek en de FOT. Ten slotte, hoewel het zou theoretisch mogelijk te schatten van het dier totaal airway weerstand (met inbegrip van de bovenste luchtwegen) uit een meting van sRaw, wordt het algemeen aanbevolen als aanvulling op de evaluatie van de DCP met een invasieve meting techniek zoals de FOT29 te verkrijgen directe metingen van gedetailleerde respiratoire mechanica. Afhankelijk van de doelstellingen van de studie, metingen van de bovenste luchtwegen-weerstand kunnen ook worden beschouwd als30,31,32.
Conclusie
Vanwege de beperkte mate van invasiviteit is de DCP een techniek die een belangrijke behoefte in het respiratoir onderzoek kan vervullen. Het is in staat om nauwkeurige uitlezingen van ventilatie patroon in bewuste dieren gelijktijdig met sommige onbetwiste indexen van obstructie van de luchtstroom. De verkregen informatie ook echt een aanvulling op die van meer invasieve benaderingen.
The authors have nothing to disclose.
SML wordt ondersteund door een studententijd van de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek, MG wordt ondersteund door een honorarium van de respiratoire netwerk van de gezondheid van de FRQS (Fonds de recherche du Québec – Santé) en YB is een onderzoeker van FRQS.
DE BIJDRAGE VAN DE INDIENERS
Alle auteurs hebben bijgedragen aan het ontstaan van het manuscript en/of de video. SML en LD de gegevens heeft verzameld. SML, LD, YB, DM, DB en AR bijgedragen aan data-analyse, de generatie van figuren en manuscript schrijven. YB, AR, KL en MG waren betrokken bij de voorbereiding van de video script. Het spel werd uitgevoerd door YB, KL en MG.
Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
Phosphate buffered saline | Multicell | 311-506-CL | PBS 10X |
House dust mite extract | GREER | 290902 | HDM |
DCP complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
iox software | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
flexiVent FX complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES |