Summary
Цель настоящей статьи заключается в том, предоставить подробное описание рекомендуемых процедур для оценки функции внешнего дыхания в сознательных мышей, двухкамерный плетизмографии.
Abstract
Изменения объема воздуха, созданный субъект сознательное дыхание спонтанно в поле тела находятся в основе плетизмографии, метод, используемый для неинвазивно оценить некоторые функции дыхательной функции в организме человека, а также лабораторных животных. Настоящей статьи фокусируется на применение плетизмографии двухкамерный (DCP) в мелких животных. Он предоставляет справочную информацию о методологии, а также подробные пошаговые процедуры успешно оценить функции внешнего дыхания в сознании, спонтанно дыхание животных неинвазивным способом. Пакет сбора данных может использоваться для мониторинга дыхательной функции нескольких животных в параллельном режиме, а также выявление изменений, вызванных аэрозольных веществ в течение выбранного периода времени и образом. Эксперименты по контролю и аллергических мыши используются здесь продемонстрировать полезность технику, объяснить связанные результаты параметров, а также обсудить соответствующие преимущества и недостатки. В целом пакет сбора данных обеспечивает действительными и теоретически звук показаний, которые можно доверять оценить дыхательной функции сознательного мелких животных как в базовых, так и после проблем с аэрозольных веществ.
Introduction
Более широкое использование мелких животных модель человека респираторных заболеваний настоятельно призвал разработка методов для количественной оценки функций дыхательной системы в этих животных. В настоящее время техника принудительные колебаний (ФОТ) признается как наиболее точный подход для оценки дыхания механики в мелких животных1,2. Однако как заявил принцип неопределенности фенотипа, что накопленный в точности измерений с ФОТ является компромиссом против потери в неивназивности3. Действительно измерения FOT приобретаются в высоко контролируемых экспериментальных условиях, которые требуют анестезии, трахеостомия или устные интубации, а также искусственной вентиляции легких; сценарий далеки от реальной жизни.
В ситуациях, когда экспериментально требования запрещают использование анестетиков или требуют мало или вообще не отклонения от естественного физиологического состояния животного может считаться двухкамерный плетизмографии (DCP). Как указывает его название, DCP установки состоит из двух подключенных жестких палат, построен, чтобы изолировать максимально герметично голова животного (или носа), в передней камере, от его грудной клетки, в задней камере. В течение установки животное сознательного и дышит спонтанно во время быть сдержанным. Потому, что стены палат нельзя расширять или убрать, движение воздуха снаружи и изнутри животного создает соответствующее но противоположного сигнала внутри задней камеры, в результате компрессии/декомпрессии окружающего воздуха. Волны вследствие носовой потока в передней камере, а связанные с движения грудной клетки в задней камере таким образом могут быть разделены и захватил одновременно. В зависимости от конструкции установки DCP эти сигналы могут быть приобретены с помощью набора преобразователи давления или pneumotachographs для соответственно записи изменений давления в камере или воздуха из камер как функцию от времени. Последний подход является более распространенным в настоящее время.
Хотя Частота дыхания животных можно точно определяется любого рода плетизмографии методов, положение является не то же самое для определения дыхательного объема и его связанные вентиляции параметров (например, минутная вентиляция, объем выдоха и т.д.). В отличие от метода всего тела плетизмографа (ФСФ), где животное дыхательный объем оценивается от box сигнал4,5, DCP техника обеспечивает точные оценки дыхательного объема. Это связано с прямого приобретения грудной движения животного в задней камере, которые пропорциональны изменений объема легких во время дыхания.
Помимо этих точных вентиляционной параметров (например, дыхательного объема, частоты дыхания и минутная вентиляция), некоторые неудобства в форме дыхательного цикла также может использоваться для расследования нейрональных аспекты, которые регулируют респираторные диск или дыхательных рефлексов. Конкретным примером этого приложения бы оценку потенциала раздражение вдыхании веществ, верхних дыхательных путей сенсорных нейронов6. Здесь длительность паузы в начале срока действия определяется с помощью параметра под названием конец вдоха паузы (EIP), также упоминается как продолжительность торможения6. Продолжение этой паузы, раздражающие вещества связано с закрытием глотки животного, вызывая измеримые период торможения в первой части истечения6,7.
Другим важным преимуществом DCP является, что он предоставляет два проверенных и бесспорным параметры, которые чувствительны к обструкции потока воздуха. Один называется поток в середине приливные объем выдоха и сокращенное EF508,9,10. Это поток воздуха на полпути объем каждого приливные дыхание во время истечения срока действия. EF50 извлекается из грудной потока трассировки и таким образом может быть измерена без передней камере (т.е., в голову из конфигурации). Другой называется конкретные сократимость сопротивления и сокращенное РАО11,12,13. Определение РАО требует одновременной записи потоков носовой и грудной животного как он вычисляется из время задержки между эти отдельные дыхательных следы точке нулевой поток в конце вдохновения. Обоснование, что описывает основу, в которой эта задержка относится к Рао был расплывчатым ранее11. Проще говоря, изменения объема легких предшествовать движение воздуха, поскольку градиент давления необходимо разработать в целях привода воздуха. В здоровых животных, дыхание спокойно эта задержка обычно очень мала. Однако градиент давления, которая требуется для размещения данного потока (например, потока, достаточной для обеспечения надлежащей вентиляции) зависит от степени сопротивления дыхательных путей. Например, во время бронхоспазма, градиент давления, необходимых для размещения данного потока больше, которое подразумевает, что животное должно работать для дыхания. Более градиент давления в грудной клетки животного также предполагает, что большую часть потока из задней камеры из-за сжатия/декомпрессии воздуха внутри грудной клетки, которая является частью общей грудной расширения/опровержения по фазе с носовой потоком. Увеличенное сопротивление вследствие бронхоспазма таким образом увеличить задержку между задней и передней камеры и тем самым увеличивает РАО. Градиента давления, что диски воздуха из легких зависит также от объема первоначальных грудной клетки газа (TGV). Например, на более Скоростных расширения/опровержения грудной клетки, необходимых для создания заданного градиента давления более (просто потому что перемещение объем, необходимый для создания заданного градиента давления больше), который также предполагает, что животное должно работать для дыхания. Опять же эти дополнительные грудной перемещения являются те необходимые для распаковки и сжатие воздуха в грудной клетки и таким образом из фазы с носовой потоком. Таким образом увеличение TGV будет также увеличить задержку между камерами и тем самым увеличивает РАО. Как видно, бронхоспазма и увеличение TGV привести в более важных усилий нарисовать воздух из легких. Это, по сути, физиологический смысл РАО. Он представляет собой работу, необходимую для дыхания5,14.
Поэтому важно понимать, что два различных факторов РАО: сопротивление дыхательных путей и TGV. В самом деле как продукт сопротивления дыхательных путей и TGV11может выражаться РАО. Сознательных животных можно изменять их TGV на волю, чтобы адаптировать их вентиляции в данной среде. В таких условиях, где природные физиологического состояния животного является неизменным, поэтому невозможно различить ли изменения в РАО проистекает от изменения сопротивления дыхательных путей, от изменений в ТГВ или из смеси двух. Следовательно рекомендуется для дополнения оценки DCP с более инвазивных измерения механики дыхания и/или легких томов, таких как предоставляемые фот1,15.
На сегодняшний день, пакет сбора данных был использован в различных исследовательских приложениях. Методика может использоваться с или без головы камеры в количественном и точно оценить эффект различных веществ, таких как фармацевтических агентов, аллергенов, раздражающие или других посредников, на функции внешнего дыхания в сознательных мелких животных 16,17,18. Передняя Камера может также использоваться как разоблачение камеры для аэрозольных вещества или концентрации (гипоксия, гиперкапния, и т.д.) различной газа19. Удобно это позволяет одновременно измерять острые последствия этих воздействий. В самом деле одна из частых применений DCP должен оценить степень реагирования аэрозольных метахолином в различных моделях респираторных заболеваний20,,21,22,,23, 24 , 25.
Хотя казалось бы простой метод DCP, некоторые практические проблемы могут потенциально препятствовать неопытных пользователей или нарушить точность и воспроизводимость результатов. Настоящий документ содержит подробное описание рекомендуемых процедур успешно записывать дыхательной функции по DCP в сознательные, сдержанная, спонтанно дыхание мышей. Описание заявленных оборудованию (см. Таблицу материалов). В общей модели легочной аллергические воспаления в двух штаммов мышей, испытания на базовом и в ответ на аэрозольных метахолином также продемонстрировал полезность и ценность DCP.
Protocol
Следующие процедуры были утверждены Квебек сердца и легких институт животное уход Комитета в соответствии с руководящими принципами Совета Канады на животное уход (CCAC).
1. Подготовка
- Исследование
- (Критический) Перед выполнением любой эксперимент, получите соответствующие разрешения (например, IACUC) и тренинги (например, животных обработку).
- Ознакомиться с оборудованием и программное обеспечение. Чтение руководства пользователя и, если необходимо, создайте файл конфигурации, чтобы определить количество сайтов, входных сигналов, анализаторы и параметры.
Примечание: Убедитесь в том выбрать высокий дискретизации (2 кГц). - Настройте параметры анализаторов для параметров, представляющих интерес.
- Выберите настройки из панели инструментов, а затем анализаторы.
- Отрегулируйте поток пороговое значение, правильно разделяющий вдохов (мышь: 0,5 мл/с) и выбрать Ti + Te для вычисления частоты дыхания.
- Установите значение для барометрического давления (760 мм Hg) и укажите максимальное отклонение объема вдоха/выдоха за дыхание, чтобы считаться действительными (мышь: 20%).
- Нажмите на параметр в поле вычисляемые параметры для настройки пределов признания.
Примечание: Для экспериментов описанных мыши использовались следующие параметры: время вдохновение, 50-170 МС; время истечения срока действия, 40 до 180 МС; частота дыхания, bpm 30 до 450; конкретные сократимость сопротивления, от 0 до 15 КМЗ2O·s; midexpiratory поток с точностью по крайней мере 3 десятичных знаков. - После завершения, выберите Применить и закрыть для выхода из диалогового окна.
- В инструмент бар меню перейдите к настройки снова, а затем хранения , чтобы установить скорость хранения нужных данных. Нажмите кнопку Применить и закрыть для выхода из окна.
Примечание: Среднем на каждые 10 s обычно используется. - Создание протокола в программное обеспечение определить последовательность команд и желаемого времени для каждого из них. Качестве примера отображается на рисунке 1.
- Если эксперимент включает в себя управление вещества аэрозоля, подготовьте соответствующие решения и разведения по концентрации для проверки.
- Животное
- Работа в тихом районе, вдали от жилья номер. Разрешить животных приспосабливаться к изменению окружающей среды.
- Вес животных и выберите размер соответствующие сдержанность.
- (Критический) Акклиматизироваться животных фиксатор и процедур до начала эксперимента. В зависимости от опытно-конструкторских, несколько сессий адаптационного увеличения продолжительности (например, 5-30 мин) могут быть необходимы.
Примечание: Животные, которые не акклиматизироваться должны быть удалены из исследования.- На каждой сессии acclimation вставьте животных в пределах фиксатор, исходя из заднего проема; держа устройство вертикально может быть полезным.
- Когда животное находится в положении, вставьте поршень обратно и осторожно зафиксируйте ее на месте без применения чрезмерной силы.
- (Критический) Визуально проверьте, что животное дышит нормально. При необходимости, скорректировать свою позицию, перемещая механизм блокировки. Убедитесь, что ноздри животного выступающие за пределами носовой конус с его мордой, отдыхая против внутренние стены фиксатор.
- Отсоединить задней панели грудной палаты, Вставьте фиксатор, содержащие животных через резиновые, открытие в зале грудной и закрыть камеру.
- Прикрепите голову камеры и обеспечивают смещения потока. Для мыши используйте поток 0,5 Л/мин.
- Позвольте животному отдохнуть в течение 5 мин.
- Как только животное спокоен, начните запись носовой и грудной поток сигналов. Проверить на экране компьютера, что следы являются гладкими и что они отображать шаблон регулярного дыхания; Смотрите пример на рисунке 2.
Примечание: Если протокол включает в себя управление аэрозоля вещество, физиологический вызов могут быть включены в процедуру адаптационного. - В конце каждой сессии удалите животное из грудной камеры и фиксатор и вернуть его жилье клетка и обслуживание.
- Оборудование
- В день эксперимента начать экспериментальный сеанс и загрузить соответствующий файл конфигурации.
Примечание: Убедитесь, что он содержит нужный протокол для эксперимента. - Перейдите в меню панели инструментов для запуска . Введите эксперимент и животного информацию. После этого, нажмите на кнопку запуска в нижней части окна.
- Продолжите калибровки системы. Калибровка каждого сайта и входной сигнал отдельно.
- Включите генератор смещения потока, подключите его к палате голову через кусок трубы и отрегулировать скорость потока.
- Закройте верхнее отверстие головки камеры с крышкой.
- Отсоединить задней панели грудной палаты, плотно вставьте калибровки инструмента внутри резиновые, открытие между головы и тела камеры для создания герметичное уплотнение. Затем закройте и повторно прикрепить задней панели грудной камеры.
- Убедитесь, что порт стороне грудной камеры ограничен.
- Меню бар инструмент программного обеспечения перейдите к Настройка , а затем калибровка.
- Перейдите на Вход 1 (грудной) и выберите калибровка для запуска диалогового окна калибровки для грудной потока сигнала.
- (Критический) Убедитесь, что перечисленные параметры в диалоговом окне калибровки отображаются соответствующие параметры, т.е., физический стресс применяется низкое значение: 0; Физический стресс применяется высокое значение:-20 мл/сек; Образцы: интегрировать. После этого, нажмите на ниже в окне образцы .
- Убедитесь, что сигнал генерируется постоянный через окна и затем выберите команду Закрыть.
- Подключите 20 мл шприц через порт стороне грудной камеры, используя пластиковый разъем и кусок трубы.
- (Критический) В окне образцы выберите высокий и немедленно ввести 20 мл воздуха в камеру над периодом 2 s как можно постоянн скоростью потока.
- Убедитесь, что сигнал появляется полностью внутри окна отображения. Используйте значок стрелки для проверки, является ли сигнал по центру и симметрично вокруг нулевой линии. Затем нажмите на Закрыть. Удалите любое смещение от нуля, щелкнув Удалить AC смещение в окне образцы
Примечание: Высокое значение калибровки может быть переделано, если это необходимо. - Убедитесь, что результирующий Диапазон входных масштабируется в пределах рекомендуемого диапазона (мышь: ±280 ±420 мл/сек). (Критический) Повторите шаги, калибровки, если значения вне допустимого диапазона.
- Калибровка голову камеры аналогичным образом как грудной камеры (шаг 1.3.3.6). На этот раз, выберите Вход 2 (носовые).
Примечание: (Важно) Должно быть присвоено значение для физического стресса применяется высокое значение + 20 мл/сек. Это будет изменить полярность потока в передней камере по отношению к задней камерой. Следовательно когда животное дышит, два потока сигналов почти будет в фазе, помимо задержки используется для вычисления РАО.
- В день эксперимента начать экспериментальный сеанс и загрузить соответствующий файл конфигурации.
2. легких функции измерения
- Взвешивание животных и отмечаем их веса тела.
- Вставьте животных в пределах фиксатор и поместите его в камере грудной плетизмографа (шаги 1.2.3.1 для 1.2.3.5).
- Позвольте животному отдохнуть по крайней мере 5 минут.
- Запустите протокол команд, выбрав первый шаг и затем нажмите на Execute.
- Проверить на экране компьютера, что животное дыхание сигналы являются регулярное и гладкой (рис. 2). Программное обеспечение автоматически отображает расчетных параметров на основе дыхание, дыхание. Убедитесь, что параметры животного являются стабильными.
- Запишите ритм дыхания в исходных условиях для до 10 минут.
- Для протоколов с участием администрации испытываемого вещества в аэрозоль сделать следующим образом:
- Распылитель на время обязанность цикла и, при необходимости отрегулируйте.
Примечание: В примерах продемонстрировал в этой статье, прибор эксплуатировался на 5% рабочий цикл для 10 s. - Выполните вызов транспортного средства (например, физиологического раствора) и запишите ответ.
- При необходимости, предоставлять животного для увеличения концентрации испытываемого вещества путем изменения концентрации в Ингалятор в эскалации шаги (например, удвоение концентрации). Запишите ответ после каждой администрации.
- В конце экспериментальной сессии если не сделано автоматически, остановите запись и вернуть животное его клетке жилье и обслуживание.
- Распылитель на время обязанность цикла и, при необходимости отрегулируйте.
- При необходимости выберите запустить из меню панели инструментов для запуска другой экспериментальной сессии.
- Между сессиями очистите плетизмограф камер и промойте распылитель с водой.
Примечание: Употребление алкоголя может вызвать необратимые повреждения плетизмограф.
- Между сессиями очистите плетизмограф камер и промойте распылитель с водой.
- Если исследование включает повторные оценки со временем, повторите весь измерения последовательности в каждой выбранной timepoint.
Примечание: Мудро рекомендуется дополнять исследования с некоторыми точных измерений механики дыхания и/или легких тома1,15.
3. анализ данных
Примечание: Программное обеспечение автоматически сохраняет файл экспериментальной и экспортирует записанные параметры, когда экспериментальная сессия закрыта.
- Расчет среднего базового для параметров, представляющих интерес для каждого животного и экспериментальной группы.
Примечание: таблица 1 перечисляет ряд типичных параметров, категории на основе типа информацию они предоставляют. - Когда это уместно, оцените эффект аэрозольных вещества, учился на параметры интерес на каждом концентрации с использованием определенной точки (например, максимальное или минимальное значение), среднем или полный курс; может также рассматриваться нормализации базовой линии.
- Доклад о результатах, с использованием средств группы и ошибки в таблице или в графическом формате. Анализировать результаты статистически.
Примечание: В настоящем исследовании, двусторонний ANOVAs с повторил меры были использованы для оценки эффекта метахолином, аллерген – дом пылевой клещ (HDM) – и их взаимодействие на различных показаний DCP (sRaw и EF50), а также различных показаний фот (NR, G и (H), в обоих штаммов мышей. Затем Sidak множественные сравнения тестов использовались для определения концентрации метахолином, на котором аллергических мышей отличается от управления мышей. Те же тесты были использованы для оценки эффекта дней, HDM и их взаимодействие на базовых (т.е., до метахолином) на индикацию обструкции (sRaw и EF50) и вентиляции образца (BF, ТВ, MV и EIP). Корреляции Пирсона были использованы для оценки корреляции между РАО, полученные с DCP и RN полученные с ФОТ. Все статистические анализы и графики были проведены с использованием альтернативных стандартного статистического программного обеспечения (например, GraphPad призмы). p ≤ 0,05 считался достаточно, чтобы отклонить нулевую гипотезу.
Representative Results
Результаты повторных оценок функции внешнего дыхания, DCP, осуществляемой в рамках исходных условий на три дня подряд (дней 12, 13 и 14 Протокола, показанного на рисунке 1) управления и аллергических мышей BALB/c, указаны в Рисунок 3 . Параметры, которые были отобраны, чтобы оценить шаблон дыхания включены, дыхание частоты (Рисунок 3А), дыхательный объем (рис. 3B), минутная вентиляция (рис. 3 c) и конец вдоха паузы (рис. 3D). Параметры, используемые для оценки обструкции были EF50 (Рисунок 3E) и РАО (Рисунок 3F). Итоги каждого выбранного параметра были стабильными в течение этих трех дней подряд в обеих группах, без явного эффекта, вызванных аллергического воспаления.
Степень реагирования на метахолином была оценена DCP на последующие дни (дни 12, 13 и 14 Протокола, показанного на рисунке 1) как управления, так и аллергических мышей BALB/c. Результаты, показанный на рисунке 4, отобразить изменения в два параметра, которые чувствительны к обструкции, а именно РАО (рис. 4A, B и C) и EF50 (рис. 4 d, E и F). Как и ожидалось, добавочное концентрации метахолином постепенно увеличилось sRaw и постепенно снизилась EF50. Эти ответы были потенцированные аллергические воспаления, особенно в окончательный концентрации испытания, что свидетельствует о наличии hyperresponsiveness. Результаты также показывают, что преувеличенной степени оперативности ограничивается в первый день (12), поскольку не было отмечено в ходе двух последующих оценок (т.е., в дни 13 и 14).
Результаты оценки механики дыхания по ФОТ, выполненных в последний день экспериментальный протокол (15-й день; Рисунок 1) как управления, так и аллергических мышей BALB/c показаны на рисунке 5. Эти эксперименты были включены в исследование в дополнение DCP оценок. FOT признается как более точный подход для оценки дыхательной функции2. Одной из его сильных сторон является, что она обеспечивает Топографическая идеи о том, какие сайты легких (проведение airways против периферийных дыхательных путей и легочной ткани), подвержены проверенных вмешательств (например, аллергенов и метахолином). Рекомендуемая методология для оценки дыхания механики с ФОТ был ранее описанных1. Здесь три FOT параметры были использованы для описания изменений в дыхательных механики, индуцированных аллергического воспаления и метахолином. Эти параметры включали: 1-ньютоновской сопротивление (RN; Рисунок 5A), для которой изменения в основном значения параметра отражают изменения в сопротивлении большой проведения дыхательных путей; 2-ткани затухания (G; Рисунок 5B), для которой изменения в основном значения параметра отражают изменения в ткани сопротивления; и 3-ткани elastance (H; Рис. 5 c), для которой изменения в основном значения параметра отражают изменения в ткани жесткость2. Как и ожидалось, было увеличение каждого из этих параметров в ответ Добавочные концентрации метахолином. В соответствии с РАО и EF50 результаты, полученные с DCP за предыдущий день (день 14; Рисунок 1), изменения в RN индуцированных метахолином (Рисунок 5A) были сопоставимы между элементом управления и аллергических мышей. В самом деле значения РАО на 14 день коррелирует с значения RN в день 15 (рис. 5 d). Рост в H, индуцированных метахолином также был похож между элементом управления и аллергических мышей (Рисунок 5B). Однако метахолином индуцированной увеличение G был значительно выше в аллергических мышей (рис. 5 c). Этот результат демонстрирует наличие сохраняющихся hyperresponsive фенотип аллергических мышей на 15-й день, который не был обнаружен, DCP оценок, проведенных на двух предыдущих дней.
Все исследование было повторено с мышей C57BL/6. Результаты последовательных DCP оценок РАО, в дни 12, 13 и 14 Протокола (рис. 1) и оценки фот RN, в день 15, показаны на рисунке 6. В этой конкретной мыши штамм преувеличенные метахолином ответ, наблюдается в аллергических мышей сохранялся на протяжении трех дней подряд (рис. 6A, Bи C). Этот hyperresponsive фенотип также изображался с ФОТ на 15 день ростом RN индуцированных метахолином, что было более выраженным в аллергических мышей (Рисунок 6E). Это были резко контрастирует с результатами, полученными с мышей BALB/c, где прогрессивного убывающий hyperresponsiveness произошло от дней 12-14 (Рисунок 4) и было отмечено отсутствие разницы в метахолином индуцированной увеличение RN день 15 (Рисунок 5A). Вместе эти результаты свидетельствуют о времени эффект аллергенов на метахолином индуцированной реакции между двумя штаммов мышей. Важно отметить, что этот штамм разница была изображена DCP и фот. Согласно значения sRaw измеряется DCP на 14 день коррелирует с значения RN измеряется фот в день 15 (рис. 6F), как было отмечено с мышей BALB/c (рис. 5 d).
Рисунок 1 . Протоколы, используемые вызвать аллергические воспаления легких и оценить степень реагирования метахолином. Это исследование было проведено на женский BALB/c и мышей C57BL/6, 7-9 недель возраста. Последовательность мероприятий, проведенных за всего исследования показана в панель (A). Половина из мышей подвергали 50 мкг, экстракта дом пылевой клещ (HDM) интраназально по 14 дней подряд, чтобы побудить легочной аллергического воспаления. Другая половина была воздействию солевых и используется в качестве элемента управления. Дыхательной функции был оценен двухкамерный плетизмографии (DCP) в трех отдельных случаях (дней, 12, 13 и 14; черные круги) после сессии для адаптационного (день 11; серый круг), который включал вызов с аэрозольных засолены. В ходе каждой сессии базовые функции дыхания и реакции на метахолином были оценены с использованием автоматизированных протокола, отображаемые в панели (B). На 15 день инвазивные оценку механики дыхания с техника принудительные колебаний (ФОТ) была выполнена ранее описанных1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Представитель потока сигналов от здоровой мыши BALB/c. Панелей видны следы типичная запись, полученная двухкамерный плетизмографии в мышь управления в исходных условиях. Грудной поток показан в верхней панели и носовые поток отображается в нижней панели. Отрицательные значения во время вдохновения и положительные значения во время истечения срока действия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Повторил оценки функции внешнего дыхания в сознательных мышей BALB/c. Базовые функции дыхания оценивали двухкамерный плетизмографии (DCP) управления (открытые символы) и аллергических (твердых символы) мышей на дни 12, 13 и 14 Протокола, показанного на рисунке 1. DCP параметры, используемые для оценки функции дыхания, включены дыхание дыхательный объем (ТВ) (B), частота в (A), конце вдоха, минутная вентиляция (MV) в (C) пауза (EIP) в (D), поток в середине приливные объем выдоха () EF50) в (E) и конкретных сократимость сопротивления (РАО) в (F). Значения дыхания частоты, ТВ, MV, sRaw и EIP для каждой мыши были средние значения записал более 1,5 мин. Значение EF50 было минимальное значение, полученное в течение этого периода записи. Результаты представлены как группа означает ± стандартное отклонение (n = 5/группа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Метахолином bronchoprovocation тест в сознательных мышей BALB/c. Метахолином реакции оценивалась путем двухкамерный плетизмографии (DCP) управления (открытые символы) и аллергических (твердых символы) мышей на дни 12, 13 и 14 Протокола, показанного на рисунке 1. DCP параметры, используемые для оценки реагирования включены конкретные сократимость сопротивления (РАО) в (A) через (C) и поток в середине приливные выдоха тома (EF50) в (D) через (F). Bronchoprovocation была выполнена aerosolizing метахолином в зале головы DCP для 10 s при добавочных концентрациях. Ответ был мониторинг в течение 1,5 мин после каждой концентрации. Значение РАО для каждой мыши на каждом концентрации было среднее значение записал более 1,5 мин. Значение EF50 было минимальное значение, полученное в течение этого периода записи. Результаты представлены как группа означает ± стандартное отклонение (n = 5/группа). Символ звездочка * обозначает статистически значимой разницы (p 
Рисунок 5 . Инвазивные оценки механики дыхания в мышей BALB/c. Респираторные механики на базовом и в ответ на метахолином оценивали методом принудительной колебаний (ФОТ) на день 15 Протокола, показанного на рисунке 1. Управления (открытые символы) и аллергических (твердых символы) мышах были проверены двухкамерный плетизмографии (DCP) те же дни, 12, 13 и 14. Параметры, используемые для оценки дыхания механики были ньютоновской сопротивления (RN) (A), ткани elastance (H) (B) и ткани, демпфирования (G) в (C). Bronchoprovocation была выполнена Небулайзерная добавочных концентрации метахолином непосредственно в эндотрахеальной трубки наркотизированных, назальной, парализована и механически вентилируемых мышей в лежачем положении. Ответ был мониторинг в течение 5 мин после каждой концентрации. Значение для каждого параметра для каждой мыши на каждом концентрации был пикового значения, полученные в течение этого периода записи. Результаты представлены как группа означает ± стандартное отклонение (n = 5/группа). Группа (D) показана взаимосвязь между конкретными сократимость сопротивления (РАО) измеряется DCP на 14 день и RN измеряется фот на 15 день. Открытые символы представляют значения в исходных и твердых символы представляют собой максимальные значения на самую высокую концентрацию метахолином испытания для управления (круги) или аллергические (квадраты) мышах. Врезные показывает коэффициент детерминации (2r). Символ звездочка * обозначает статистически значимой разницы (p ≤ 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Дыхательной функции и инвазивных механики дыхания в мышей C57BL/6. Конкретные сократимость сопротивления (РАО) оценивали двухкамерный плетизмографии (DCP) на базовом и в ответ на метахолином управления (открытые символы) и аллергических (твердых символы) мышей на дни 12 (A), 13 (B) и 14 (C) из Протокол, показанного на рисунке 1. Ньютоновской сопротивления (RN) на базовом и в ответ на метахолином были оценены методом принудительной колебаний (ФОТ) на день 15 (D). Bronchoprovocations были выполнены как описано в рисунке 4 и 5 для DCP и фот, соответственно. Результаты представлены как группа означает ± стандартное отклонение (n = 5/группа). Группа (E) показана взаимосвязь между РАО, измеряется DCP на 14 день и RN измеряется фот на 15 день. Открытые символы представляют значения в исходных и твердых символы представляют собой максимальные значения на самую высокую концентрацию метахолином испытания для управления (круги) или аллергические (квадраты) мышах. Врезные показывает коэффициент детерминации (2r). Символ звездочка * обозначает статистически значимой разницы (p ≤ 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Параметр | Единица | Описание | Информация |
| F | BPM | Частота дыхания | Системы вентиляции |
| ТЕЛЕВИЗОР | mL | Дыхательный объем | |
| MV | mL | Минутная вентиляция | |
| Ti | MS | Время вдоха | |
| TE | MS | Время выдоха | |
| ПИФ | Мл/сек | Пик вдоха потока | |
| PEF | Мл/сек | Пик выдоха | |
| EV | mL | Объем выдоха | |
| НТВ | mL | Носовые дыхательный объем | |
| NEV | mL | Носовые объем выдоха | |
| EIP | MS | Конце вдоха пауза | |
| ЭПЭ | MS | Конец экспираторного пауза | |
| dT | MS | Время задержки | Воздушный поток непроходимости |
| sRaw | КМЗ2O·s | Конкретные сократимость сопротивления | |
| Сгав | 1/КМЗ2O·s | Конкретные сократимость проводимость | |
| EF50 | Мл/сек | Поток в середине приливные выдоха тома | |
| SR | % | Показатель успеха | Контроль качества |
| N | Количество допустимых вдохов |
Таблицы 1. Список типичных параметров полученных от двухкамерный плетизмографии. Параметры были сгруппированы по характеру информации, которые они предоставляют во время вычисления функции дыхания.
| Преимущества | Ограничения |
| · Сознательных животных | · Необходимость контроля окружающей среды |
| · Параметры точная вентиляции | · Предварительное адаптационного животных |
| · Бесспорным индексы обструкции потока воздуха (РАО, EF50) | · Требование к герметически отдельные потоки носовой и грудной |
| · Адаптированы к различного вида и животных | · Изменчивость абсолютного значения для некоторых параметров результатов |
| · Используется во многих исследовательских приложениях | · sRaw не истинное измерение сопротивления |
| · Простая техника | · Присутствие верхних дыхательных путей |
| · Чувствительны к изменить | · Дополняя измерения с инвазивной оценки |
Таблица 2. Список преимуществ и ограничений, связанных с плетизмографии двухкамерный.
| Double-Chamber плетизмографии | Техника принудительные колебаний | |
| Животных в состояние сознания | Без изменений | Под наркозом (и обычно парализована) |
| Позицию животного | Вертикально | Лежа |
| Доступность животного | В камере | Доступны |
| Животных интеграция с помощью устройства измерения | Носа или шеи печать | Трахеостомия или устные интубации |
| Животного сократимость дерево | Нетронутыми | Частично – верхнюю авиалинию сегмент исключены (т.е. носовые проводит, глотки и гортани) |
| Объем легких, при котором получаются параметры результатов | Переменная - спонтанное тома, принятые животное | Стандартизированные - с использованием контролируемого набора маневров и положительное давление в конце выдоха. |
| Частота, на которой оцениваются параметры результатов | Переменная - частота спонтанного дыхания, принятые животное | Управление - с помощью стандартных сигналов на указанных частотах |
| Вклад из верхних дыхательных путей сегмента параметров результат | Следует ожидать | Обойти |
| Узел подачи аэрозоля | Внутри головы камеры | Непосредственно в трахеи |
| Влияние сегмента верхних дыхательных путей на ингаляционные дозы / шаблон осаждения аэрозолей | Следует ожидать | Предотвратить |
| Способность обнаруживать изменения - по результатам настоящего исследования | Наблюдается | Наблюдается |
| Присущих изменчивости техники - по результатам настоящего исследования | Колебания коэффициента вариации для РАО в базовых: 7,5-20,6% | Колебания коэффициента вариации для RN на базовые: 3.6-13,4% |
Таблица 3. Сравнение между двухкамерный плетизмографии и методы принудительного колебаний.
Discussion
Возможность измерения функции легких в сознательных животных явно оправданным в дыхательных путей исследования. В общем DCP является интересным подходом к оценить функцию вентиляция дыхательной системы в сознательных и спонтанно дыхание животных26. Говоря более конкретно DCP, или ее руководитель out вариант, часто поражает правильный баланс между качеством предоставленной информации и желаемого уровня инвазии3 (Таблица 2). Техника может быть адаптирована для различных видов (например, мышь, крысы, морская свинка) или животных размеров и может использоваться во многих исследовательских приложениях. Это особенно полезно для оценки многочисленных животных сразу в параллельного исследования дизайн, контролировать функции внешнего дыхания в неоднократных манере и захватить кинетики реакции с течением времени. Кроме того метод прост и могут быть извлечены в относительно своевременного. В настоящем документе, протокол, используя измерения DCP в мышах был использован как примером для описания практические аспекты этого сдержанной плетизмографии техника также обсудить критические шаги и связанные результаты.
При работе с сознательных животных, важно контролировать условия окружающей среды (например, тихий номер с ограниченным числом людей или деятельности), чтобы создать воспроизводимые результаты. Так как взводы прийти в различных размеров, важно начать с соответствующего размера, так что дыхательные движения невозмущенной. Это также полезно и часто требуется, чтобы акклиматизироваться животных в экспериментальной установки и процедуры, как у мышей, хорошо известно, что запретительные влияет на частоту дыхания12. В зависимости от опытно-конструкторских или условий может потребоваться несколько сеансов добавочных длительностей. Наконец позволяя время в начале эксперимента для животных, чтобы приспособиться к изменению номер и необходимой обработки является простое рассмотрение, что оказалось эффективным для обеспечения того, чтобы ритм дыхания последовательно регулярных и расслабленной в базовых. Работать в условиях, где животные удобные, хорошо отлаженную и спокойной также будет полезным с точки зрения результат изменчивость и качество. Она также ограничивает любой стресс индуцированного релиз катехоламинов, который может увеличить калибр сократимость и смягчить индуцированных бронхоспазма.
Важно понимать, что существует необходимость разделения как герметично максимально носовой и грудной потоков. В зависимости от системы или изученных видов герметизации механизм может варьироваться в форме также, как и эффективность. В DCP, которую мы описали здесь печать создается между морду животного и удерживающего устройства. При оценке функции дыхания, DCP, важно также обеспечить достаточное и постоянное смещение потока, как снижение уровня кислорода для животного приведет к значительные последствия. Принимая во внимание благосостояние животного в фиксатор ограничивает склонность для утечки воздуха, созданные агитации и тем самым повышает качество данных. Contrastingly ломать в уплотнении приведет к отклоненных наборов данных или недооценка некоторых параметров.
Кроме того чтобы включить отдельную запись носовой потока сигнала, голову камеры обычно используется подвергать животных для аэрозольных веществ. Как показано в этой статье, это может использоваться для выполнения bronchoprovocation тест для демонстрации различной степени реагирования. В таких экспериментов, регулируя диапазон протестированных концентраций могут потребоваться в зависимости от видов, деформации или секс животных изучены. Как ранее продемонстрировали8,9,10,27представить результаты показывают, что метахолином индуцированные изменения в РАО коррелирует с инвазивной FOT измерения сопротивления дыхательных путей. Результаты также показывают, что техника DCP не так чувствительны, как фот за его способности обнаружить дыхательной дисфункции и определить измененное ответ, локализованные в нижней секциях легких (легочная ткань или небольших периферийных airways) . Так как животного airways нетронутыми, присутствие верхних дыхательных путей, которое приходится самая большая часть дыхательных общее сопротивление воздуха28, может повлиять на распределение аэрозолей и осаждения в дополнение к ослабить вклад от нижних дыхательных путей к измерению. В таблице 3 приведены другие различия между DCP технику и фот. Наконец хотя было бы теоретически возможно оценить животного сопротивления всего дыхательных путей (включая верхних дыхательных путей) измерения РАО, обычно рекомендуется для дополнения оценки DCP с инвазивной измерений, таких как FOT29 для получения прямых измерений подробных механики дыхания. В зависимости от цели исследования измерения сопротивления верхних дыхательных путей может также рассматриваться30,,31-32.
Заключение
Вследствие своей ограниченной степени инвазии DCP — это метод, который может выполнять важную потребность в дыхательных исследований. Он способен обеспечить точные отсчетов вентиляции шаблона в сознательных животных одновременно с некоторые бесспорные индексы обструкции потока воздуха. Полученная информация также действительно дополняет от более инвазивных подходов.
Disclosures
DB и AR работают в научных дыхательных SCIREQ оборудование Inc, коммерческой организацией, участвует в темах, связанных с содержанием этой статьи. DB также владеет складе. SCIREQ Inc. — Компания ЕМКА технологий.
Acknowledgments
SML поддерживается студенчества от канадской институтов здравоохранения исследований, мг поддерживается стипендию от респираторных здоровья сети FRQS (Fonds de recherche Квебека – Santé) и YB исследования ученого от FRQS.
АВТОРОВ ВКЛАД
Все авторы способствовали концепции рукопись и/или видео. SML и LD собранных данных. SML, LD, YB, DM, DB и AR способствовали анализу данных, поколения деятелей и письменной рукопись. YB, AR, KL и мг участвовали в подготовке сценарий видео. Пьеса была исполнена YB, KL и мг.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
| Phosphate buffered saline | Multicell | 311-506-CL | PBS 10X |
| House dust mite extract | GREER | 290902 | HDM |
| DCP complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| iox software | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| flexiVent FX complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES |
References
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis Exp. (75), e50172 (2013).
- Bates, J. H. T. CORP: Measurement of lung function in small animals. J Appl Physiol (1985). 123 (5), 1039-1046 (2017).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (4), 1297-1306 (2003).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. J Vis Exp. (90), e51755 (2014).
- Enhorning, G., van Schaik, S., Lundgren, C., Vargas, I. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals? Can J Physiol Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Vijayaraghavan, R., Schaper, M., Thompson, R., Stock, M. F., Alarie, Y. Characteristic modifications of the breathing pattern of mice to evaluate the effects of airborne chemicals on the respiratory tract. Arch Toxicol. 67 (7), 478-490 (1993).
- Willis, D. N., Liu, B., Ha, M. A., Jordt, S. E., Morris, J. B. Menthol attenuates respiratory irritation responses to multiple cigarette smoke irritants. FASEB J. 25 (12), 4434-4444 (2011).
- Neuhaus-Steinmetz, U., et al. Sequential development of airway hyperresponsiveness and acute airway obstruction in a mouse model of allergic inflammation. Int Arch Allergy Immunol. 121 (1), 57-67 (2000).
- Glaab, T., et al. Tidal midexpiratory flow as a measure of airway hyperresponsiveness in allergic mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 280 (3), L565-L573 (2001).
- Glaab, T., et al. Noninvasive measurement of midexpiratory flow indicates bronchoconstriction in allergic rats. J Appl Physiol (1985). 93 (4), 1208-1214 (2002).
- Pennock, B. E., Cox, C. P., Rogers, R. M., Cain, W. A., Wells, J. H. A noninvasive technique for measurement of changes in specific airway resistance. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 46 (2), 399-406 (1979).
- DeLorme, M. P., Moss, O. R. Pulmonary function assessment by whole-body plethysmography in restrained versus unrestrained mice. J Pharmacol Toxicol Methods. 47 (1), 1-10 (2002).
- Flandre, T. D., Leroy, P. L., Desmecht, D. J. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J Appl Physiol (1985). 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Criee, C. P., et al. Body plethysmography--its principles and clinical use. Respir Med. 105 (7), 959-971 (2011).
- Robichaud, A., et al. Automated full-range pressure-volume curves in mice and rats. J Appl Physiol (1985). 123 (4), 746-756 (2017).
- Mizutani, N., Goshima, H., Nabe, T., Yoshino, S. Complement C3a-induced IL-17 plays a critical role in an IgE-mediated late-phase asthmatic response and airway hyperresponsiveness via neutrophilic inflammation in mice. J Immunol. 188 (11), 5694-5705 (2012).
- Nabe, T., et al. Roles of basophils and mast cells infiltrating the lung by multiple antigen challenges in asthmatic responses of mice. Br J Pharmacol. 169 (2), 462-476 (2013).
- Morris, J. B., et al. Immediate sensory nerve-mediated respiratory responses to irritants in healthy and allergic airway-diseased mice. J Appl Physiol (1985). 94 (4), 1563-1571 (2003).
- Merazzi, D., Mortola, J. P. Effects of changes in ambient temperature on the Hering-Breuer reflex of the conscious newborn rat. Pediatr Res. 45 (3), 370-376 (1999).
- Rao, R., Nagarkatti, P. S., Nagarkatti, M. Delta(9) Tetrahydrocannabinol attenuates Staphylococcal enterotoxin B-induced inflammatory lung injury and prevents mortality in mice by modulation of miR-17-92 cluster and induction of T-regulatory cells. Br J Pharmacol. 172 (7), 1792-1806 (2015).
- Agrawal, A., et al. Inhibition of mucin secretion with MARCKS-related peptide improves airway obstruction in a mouse model of asthma. J Appl Physiol (1985). 102 (1), 399-405 (2007).
- Mabalirajan, U., Aich, J., Agrawal, A., Ghosh, B. Mepacrine inhibits subepithelial fibrosis by reducing the expression of arginase and TGF-beta1 in an extended subacute mouse model of allergic asthma. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (3), L411-L419 (2009).
- Desmet, C., et al. Treatment of experimental asthma by decoy-mediated local inhibition of activator protein-1. Am J Respir Crit Care Med. 172 (6), 671-678 (2005).
- Zang, N., et al. Pulmonary C Fibers Modulate MMP-12 Production via PAR2 and Are Involved in the Long-Term Airway Inflammation and Airway Hyperresponsiveness Induced by Respiratory Syncytial Virus Infection. J Virol. 90 (5), 2536-2543 (2015).
- Shukla, M., et al. Carryover of cigarette smoke effects on hematopoietic cytokines to F1 mouse litters. Mol Immunol. 48 (15-16), 1809-1817 (2011).
- Murphy, D. J. Respiratory function assessment in safety pharmacology. Curr Protoc Pharmacol. , Chapter 10 Unit10 19 (2003).
- Lofgren, J. L., et al. Restrained whole body plethysmography for measure of strain-specific and allergen-induced airway responsiveness in conscious mice. J Appl Physiol (1985). 101 (5), 1495-1505 (2006).
- DiMaria, G. U., Wang, C. G., Bates, J. H., Guttmann, R., Martin, J. G. Partitioning of airway responses to inhaled methacholine in the rat. J Appl Physiol (1985). 62 (3), 1317-1323 (1987).
- Hoymann, H. G. Lung function measurements in rodents in safety pharmacology studies. Front Pharmacol. 3, 156 (2012).
- Agrawal, A., Singh, S. K., Singh, V. P., Murphy, E., Parikh, I. Partitioning of nasal and pulmonary resistance changes during noninvasive plethysmography in mice. J Appl Physiol (1985). 105 (6), 1975-1979 (2008).
- McLeod, R. L., Young, S. S., Erickson, C. H., Parra, L. E., Hey, J. A. Characterization of nasal obstruction in the allergic guinea pig using the forced oscillation method. J Pharmacol Toxicol Methods. 48 (3), 153-159 (2002).
- Miyahara, S., Miyahara, N., Takeda, K., Joetham, A., Gelfand, E. W. Physiologic assessment of allergic rhinitis in mice: role of the high-affinity IgE receptor (FcepsilonRI). J Allergy Clin Immunol. 116 (5), 1020-1027 (2005).
