نقدم تقنية للاتصال ميكرومانيبوليشن من الحويصلات، استخدام التدرجات أيون الكالسيوم المترجمة. Microinjection الحل أيون الكالسيوم، بالقرب حويصلة دهن عملاقة، يستخدم ليعيد الغشاء الدهني، أسفر عن إنتاج الأغشية نتوءات أنبوبي.
في مجموعة متنوعة واسعة من عمليات الخلية الأساسية، مثل الاتجار بغشاء والمبرمج، تحدث التحولات شكل غشاء الخلية التزامن مع الاختلافات المحلية في تركيز أيون الكالسيوم. وقد تم التعرف على المكونات الجزيئية الرئيسية المشاركة في هذه العمليات؛ ومع ذلك، أقل بكثير يعرف التفاعل محددة بين التدرجات أيون الكالسيوم والدهون داخل غشاء الخلية، أساسا بسبب الطابع المعقد للخلايا البيولوجية وصعوبة من أنظمة المراقبة. لسد هذه الفجوة، ينفذ بنجاح نهج اصطناعية للكشف عن أثر مترجمة من أيونات الكالسيوم في غشاء الخلية يقلد. إنشاء تقليد تشبه الظروف داخل خلية مشكلة سيفيرالفولد. أولاً، أن نموذج المحاكاة البيولوجية مناسبة مع الأبعاد المناسبة وتكوين غشاء مطلوب لالتقاط الخصائص الفيزيائية للخلايا. ثانيا، مطلوب إعداد ميكرومانيبوليشن لتسليم كمية صغيرة من أيونات الكالسيوم إلى مكان غشاء خاص. وأخيراً، مطلوب نظام مراقبة لاكتشاف وتسجيل استجابة الغشاء الدهني للمؤثر الخارجي. تقدم هذه المقالة نهج المحاكاة البيولوجية مفصلة لدراسة التفاعل غشاء أيون الكالسيوم، حيث يتعرض نظام حويصلة في الدهون، يتكون من أونيلاميلار العملاقة حويصلة (جيوف) متصلاً حويصلة مولتيلاميلار (ملف)، لكالسيوم مترجمة وشكلت التدرج اللوني باستخدام نظام microinjection. لاحظ استخدام مجهر الأسفار ديناميات تأثير الأيونية في الغشاء وسجلت أسعار إطار الفيديو. نتيجة تحفيز غشاء، الغاية منحنى غشاء نتوءات أنبوبي (MTPs) شكلت داخل جيوف، التوجه بعيداً عن الغشاء. النهج الذي وصف بالحث على إعادة عرض الغشاء الدهن وإنتاج الخطة المتوسطة الأجل بطريقة الاتصال بها والتي تسيطر عليها تماما. ويدخل هذا النهج وسيلة لمعالجة تفاصيل التفاعلات غشاء أيون الكالسيوم، توفير سبل جديدة لدراسة آليات إعادة تشكيل غشاء الخلية.
دور أيونات الكالسيوم داخل العمليات البيولوجية، على وجه التحديد مشاركتهم في الإشارات وانقسام الخلايا، والغشاء الانصهار، هو محور العديد من الدراسات الميكانيكية1. تركيز أيونات الكالسيوم داخل الخلايا هيولى يقارب 100 نانومتر، بينما الكالسيوم في العضيات، مثل هيولى والحويصلات الافرازية، الميتوكوندريا، الوصول إلى مستويات تصل إلى عشرات ميليمولارس في التركيز. يؤدي هذا إلى إنشاء أوامر الانحدار تركيز أيون الكالسيوم الحاد من حجم عبر الأغشية داخل الخلية2،3،،من45،،من67،8 ،9. مستوى أيون الكالسيوم خارج الخلية حوالي 2 ملم ومن ثم تحدث اختلافات تركيز أيون الكالسيوم على الصعيدين خارج الخلية وداخل الخلية. وعلاوة على ذلك، مزامنة الأخيرة الدراسات دليلاً على أن أيون الكالسيوم داخل الخلايا مما يشير إلى الأحداث ونشاط الخلايا العصبية يمكن أن يحدث في ظل ظروف التقلبات المحلية من تركيزات أيون الكالسيوم خارج الخلية، مما يشير إلى أهمية داخلها والكالسيوم خارج الخلية أيون الاختلافات10.
تهدف إلى فهم التفاعل بين أيونات الكالسيوم والأغشية البيولوجية، واتباع نهج اصطناعية التي يتم استبدال أغشية الخلية الأصلية بدهن بلير حويصلات قد نفذت بنجاح. تعريض الحويصلات إلى حلول أيون الكالسيوم يؤدي إلى تغييرات في مجموعات دهن الرأس والهيدروكربونية سلسلة التعبئة، والغشاء زيادة التوتر، وتجميع حويصلة، فضلا عن فصل الدهون والغشاء المرحلة الانتقالية11،12 ،،من1314،،من1516. خصائص الأغشية الدهنية عند التعرض لأيونات الكالسيوم قد تم التحقيق باستخدام هذه التقنيات التجريبية كالأشعة السينية، 1ح-الرنين المغناطيسي النووي، والدراسات الطيفية أو دينامي حراري11،16، 17 , 18-وفي هذه الدراسات، تكوين غشاء يتم ضبطها وكثيراً ما تشبه أغشية الخلية الأصلية وتحتوي على مثل هذه الدهون الفسيولوجية phosphatidylcholine (PC) وفوسفاتيديليثانولاميني (PE) وفوسفاتيديلسيريني (PS). ملاحظة: يكتسي أهمية خاصة في إعداد حويصلة مصطنعة لأنها عنصر أساسي في العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك الاتجار بغشاء داخل الخلايا، والرقابة، والمبرمج19،20.
غالباً ما يتراوح حجم الحويصلات الدهنية المركبة نانومتر إلى عدة ميكرومتر. بين حويصلة مختلف الاستعدادات، الحويصلات أونيلاميلار العملاقة (جوفس)، التي هي عدة عشرات ميكرومتر في القطر، تتسم بأهمية خاصة نظراً لحجمها الكبير نسبيا، تشبه الخلايا أبعاد الفرد21 , 22 , 23-مساحة متوفرة جوفس تمكن أثر التدرجات الكيميائية المحلية على غشاء الخصائص الفيزيائية دراستها. وذلك بتعريض جزء من سطح الغشاء للمؤثرات الخارجية فقط، يمكن أن يحقق أوثق ديناميات الغشاء. على سبيل المثال، فقد ثبت أن التطبيق المترجمة من التدرجات الكيميائية أو درجة الحموضة إلى سطح جوفس يؤدي إلى تكوين نتوءات أنبوبي، التي لم تراع في المجمع التعرض24،25. ما لوحظ من الاختلافات في سلوك الغشاء الدعوة لزيادة تطوير أسلوب مخططات الاستجواب حويصلة واحدة الحصول على بعض الأفكار في آليات إعادة عرض غشاء الخلية.
بناء على أساليب microinjection وميكرومانيبوليشن من أوائل القرن العشرين26،27، فيما يتعلق بالتطورات الأخيرة أكثر من مخططات التلاعب حويصلة واحدة من،القرن الحادي والعشرين2328 ، يعرض هذا المقال نهج في الغشاء الذي يعيد البناء وتشكيل غشاء نتوءات أنبوبي (MTPs) في غشاء جيوف يتم إنشاؤها استجابة للطلب المحلي من أيونات الكالسيوم.
ويستخدم نهجنا حويصلة معقدة تتألف من جيوف متصلاً حويصلة مولتيلاميلار (ملف) كنظام نموذجي غشاء المحاكاة البيولوجية (الشكل 1A). ملف مطلوب كمستودع المحتوى دهني للمجمع لتوريد المواد الدهنية جيوف أثناء التعرض لتدرج أيون كالسيوم. يتيح هذا الاتصال المعقدة للتعويض عن زيادة التوتر الغشاء أثناء إعادة عرض المستحث وشكل الانتقال من الغشاء جيوف وتوفر الدهون للنمو الخطة المتوسطة الأجل. وعلاوة على ذلك، يسهل ملف التثبيت السطحي لأن كتلته أكبر مقارنة جيوف. المجمعات جيوف-ملف، عند معطلة على ركيزة صلبة، وقد استخدمت سابقا لإنتاج شبكات أنابيب نانوية-حويصلة، ودراسة التفاعل غشاء البوليمر، ومحاكاة المراحل المتأخرة من الرقابة29،30، 31،،من3233.
تستخدم البروتوكولات السابقة فول الصويا استخراج الدهن القطبي (SPE) لإعداد ملف جيوف مجمعات28. جمعية مهندسي البترول يتكون من خليط فوسفوليبيدات التي تتضمن أجهزة الكمبيوتر (45.7%)، PE (22.1%)، فوسفاتيديلينوسيتول (PI، 18.4 في المائة)، حمض فوسفاتيديك (السلطة الفلسطينية، ونسبة 6.9 في المائة)، وهي مزيج من الدهون الأخرى (6.9%). في بروتوكولنا هنا، هي يخدر الخليط جمعية مهندسي البترول بنسبة 20% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (ملح الصوديوم) (DOPS) لتقليد النشرة الداخلية لغشاء بلازما الخلية. % 1 إضافية أتو 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-منشطات) يستخدم لوصمة عار بلير الدهن لتمكين الرصد من الغشاء يعيد البناء باستخدام مجهر الأسفار. جوفس تكوين الدهن متماثل عبر بلير ويتعرض محلياً لتركيزات 5 مم من كلوريد الكالسيوم (كاكل2). أيضا تقليد هذه الظروف التجريبية، مع تركيز أيون كالسيوم مرتفعة، النشرة الغشاء الخارجي للخلايا أبوبتوتيك، حيث تكون الجزيئات PS أعرب34. تشكيل المجمعات جيوف-ملف يتطلب استخدام أسلوب الجفاف باﻹماهة معدلة وضعت في البداية من قبل كثيرين وكيلر35. ويتضمن بروتوكول إعداد حويصلة تشكيل طبقة الدهن الجاف، الذي ثم يستخدم بشكل حويصلات صغيرة في الحل. هذا الحل هو المجففة ثم امهاء لتشكيل المجمعات جيوف-ملف النهائي. الشكل 2 ألف د- يوضح الخطوات الأساسية لإعداد مجمع جيوف-ملف نموذجي.
بعد الانتهاء من إعداد حويصلة وهو المعطل تداولها حويصلة المعقدة في الركيزة الزجاج، يستخدم تقنية microinjection بتسليم كميات صغيرة من أيونات الكالسيوم إلى النشرة الخارجي من جوف من خلال ميكروبيبيتي زجاج تلميح مفتوحة. تدفق حل الكالسيوم من الطرف يولد تدرج أيون كالسيوم مترجمة على سطح الغشاء جيوف، مما يؤدي إلى إعادة عرض الغشاء وتوليد الخطط المتوسطة الأجل. تتجه بعيداً عن مصدر أيون الكالسيوم الخطط المتوسطة الأجل وتنمو داخل جيوف. هذا تشكيل الخطة المتوسطة الأجل يمكن رصدها مباشرة باستخدام مجهر الأسفار وتسجيلها باستخدام كاميرا رقمية. ويبين الشكل 3 الإعداد التجريبية المستخدمة لإنتاج الأغشية إعادة عرض. تشكيل الخطط المتوسطة الأجل (2E الشكل و الشكل 4) في هذا البروتوكول يوضح نتيجة متناقضة لايون الكالسيوم التعرض التجارب تجري في ظروف التخزين الأكبر. تحت معظم الظروف، تمزق جوفس وتشكل بقع الأغشية التي يمكن ملاحظتها على التمسك بسطح الزجاج25.
مزيد من التفاصيل حول تشكيل المجمعات جيوف-ملف، فضلا عن إجراءات لتنفيذ microinjection أيونات الكالسيوم، وهي الموضحة في هذه المقالة. البروتوكولات وتركز إلى حد كبير على microinjection أيون الكالسيوم؛ ومع ذلك، يمكن بسهولة تعديل هذا النهج لاستخدامها في دراسة الردود الغشاء بسبب التعرض المحلي إلى أيونات أو البروتينات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ضبطها تكوين الحويصلات لعزل أدوار المكون الدهني عملية إعادة عرض الغشاء. لا يتطلب أي معدات متطورة لإنتاج مجمعات جيوف-ملف البروتوكول قدم وتتميز بدرجة عالية من إمكانية تكرار نتائج.
تسمح أنظمة المحاكاة البيولوجية الخلية لدراسة سلوك الغشاء عند التعرض للمؤثرات الخارجية مثل البروتينات، أيونات أو جسيمات نانوية. جوفس، يجري هذا نموذج، يمكن الاستجابة للتغييرات في البيئة الكيميائية عن طريق تعديل شكلها، الذي غالباً ما ينطوي على تشكيل أنبوبي الهياكل وإينفاجينيشنز24،،من4142،43 .
تقدم هذه المقالة نهج لتوليد الخطط المتوسطة الأجل بطريقة الاتصال عن طريق إعادة عرض سطح جيوف عند حقن مترجمة من أيونات الكالسيوم على السطح جيوف. ويصف البروتوكول إعداد المجمع جيوف-ملف الذي يحاكي غشاء بلازما خلية، وكذلك كيفية توظيف تقنية microinjection لتوليد الكالسيوم التدرجات أيون قريبة من جيوف السطحية لنموذج الخطط المتوسطة الأجل. تعرض معظم الدراسات التجريبية السابقة التي تناولت التفاعلات غشاء أيون الكالسيوم الحويصلات الدهنية لمعظم الكالسيوم تركيز أيون14،17. تبعاً لظروف تجريبية، قد يؤدي هذا التعرض الأكبر استجابة غشاء مختلفة مع لا نتوءات أنبوبي شكلت25.
تشكيل المجمعات جيوف-ملف مباشرة بدلاً من ذلك ولا يتطلب سوى معدات المختبرات القياسية، مثل مبخر دوراني، وحمام الموجات فوق الصوتية، وفراغ مجففة. ومع ذلك، هناك العديد من الخطوات الهامة للنظر أثناء إعداد حويصلة. من المهم التأكد من أن جفاف الحويصلات كاملة (خلال الخطوة 2، 3 من البروتوكول) ويتكون فيلم دهن دائرية جافة التي تحتوي على كمية صغيرة فقط من بلورات الملح على سطح بكشف غطاء الزجاج. أثناء التجربة، حذراً في التعامل مع الحل حويصلة، استخدام الحل مخزون الدهن الطازج في كلوروفورم، فضلا عن الطازجة حبيس العازلة، أمر أساسي للإعداد الناجح للمجمعات جيوف-ملف. وعلاوة على ذلك، المهم مرفق أمن المجمع جيوف-ملف على سطح الزجاج كشف الغطاء ميكرومانيبوليشن و microinjection. للتأكد من مناسبة انضمام جيوف-ملف المعقدة، ميكروبيبيتي (بدون حقن التدفق) يمكن استخدامها لدفع بلطف على السطح جيوف. سوف لا الشريحة حويصلة التقيد بها بشدة على طول السطح عند الاتصال الجسدي المباشر. لأنه يتم تنفيذ التجارب في الحبرية فتح المخزن مؤقت، الذي قد يكون استجوابه لعدة ساعات، تبخر يجب أن تؤخذ في الاعتبار. التبخر من الحبرية المخزن المؤقت سوف تغير الظروف ناضح، التي يمكن أن تؤثر على وزعزعة استقرار الحويصلات. لاستعادة الأحوال ناضح، إرجاع إضافة دورية من المياه النقية إلى عينة لاستعادة وحدة التخزين الأصلية النظام إلى التوازن.
عند تعديل تكوين غشاء الدهن، من الأهمية بمكان أن الحويصلات يتم إنتاجها في شكل مجمع جيوف-ملف لأنه يسمح ملف لنقل المواد الدهنية جيوف أثناء إعادة الغشاء. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن استبدال مكونات المخلوط جمعية مهندسي البترول بالدهون نقية، أو إضافة 5-30 في المائة من نسبة الكولسترول في الدم، كما يسمح لملف جيوف تشكيل معقدة28،44. غالبيتهم من جوفس استعداد أونيلاميلار45.
وعلاوة على ذلك، عند اختبار الكاتيونات divalent الأخرى، مثل أيونات المغنيسيوم، تشكيل الخطط المتوسطة الأجل يتوقف إلى حد بعيد على وجود DOPS مشحونة سلبا في خليط الدهن. دون DOPS، لا تشكل الخطط المتوسطة الأجل في الحويصلات الموصوفة في هذا البروتوكول. أيضا، والكاتيونات الفموي الأحادي التكافؤ، مثل البوتاسيوم والصوديوم، لم تسفر عن تشكيل الخطط المتوسطة الأجل، حتى في الحويصلات المحتوية على DOPS25.
بالإضافة إلى خطوات حاسمة فيما يتعلق بإعداد والتلاعب جوفس، هناك عدة عوامل هامة للنظر أثناء إجراء microinjection. Microinjection الناجح من أيونات الكالسيوم تعتمد بشكل كبير على الأداء بشكل صحيح الزجاج ميكروبيبيتيس، التي تعد اليوم من التجربة. وهناك العديد من العوامل التي يمكن أن تسبب ميكروبيبيتي لعطل. أن سبب شائعة افتتاح نصيحة انسداد. جزيئات الدهن الصغيرة، التي مشتقات إعداد حويصلة، موزعة في الحل، وتميل إلى التمسك بنصيحة ميكروبيبيتي، مما يولد من انسداد. ويتم تنظيف تلميح ماصة أفضل حتى رفع من الحل حويصلة ووضعه مرة أخرى قريبة من السطح جوف. ويجب تجنب استخدام الدالة التفجرات مضخة microinjection نظراً لأنه يؤدي إلى ضخ أيونات الكالسيوم الضخمة في حل الجزء الأكبر. وعلاوة على ذلك، منع فقاعات الهواء الصغيرة الشرك داخل ميكروبيبيتي microinjection السليم، التي يستعاض عن القضية ميكروبيبيتي مع واحدة جديدة. يمكن تصغير الكسر تلميح إلى حد كبير عن طريق وضع برنامج الإعداد التجريبية على طاولة الاهتزاز الملطف للتقليل من التذبذبات تلميح.
وعلاوة على ذلك، يحتاج الرعاية الواجب اتخاذها عند اختيار نظام مراقبة، للتقليل من فوتوبليتشينج حين الحصول على الصور مرة حل أفضل. واستخدمت مجهرية fluorescence المستحثة بالليزر واسع المجال في هذا البروتوكول لأنه يسمح لمعدل الحصول على صورة عالية نسبيا في عمق موضوعية تحقيق محدودة. وعلاوة على ذلك، يتيح استخدام المجهر المقلوب microinjection المتزامنة والمراقبة للحويصلات الدهنية والخطط المتوسطة الأجل.
أحد القيود الرئيسية لأسلوب عرض هو شرط العمل اليدوي واسعة وكافية ميكرومانيبوليشن المهارات. لأن المجمعات التي تتشكل من خلال عملية تورم عفوية ولا يمكن التحكم في حجم جوفس وملفس. بالإضافة إلى ذلك، لا يسمح هذا البروتوكول للسيطرة على التوتر الغشاء من المجمعات جيوف-ملف المعدة، التي قد تكون ضرورية لجمع تفاصيل إضافية فيما يتعلق بإعادة عرض الغشاء. متصلة جوفس ملفس مع المواد الدهنية الموردة الأخير للنمو الكبير في الخطط المتوسطة الأجل إلى حد أنه سيكون من المستحيل تحقيق فقط استخدام الغشاء متاحة من جوفس. ملفس يسهم أيضا في تخفيض أي تغيرات التوتر السطحي الأفقي داخل ملف جيوف معقدة44، الذي من شأنه أن يعقد محاولات للسيطرة على التوتر من حويصلة باستخدام الشفط ميكروبيبيتي. يوفر هذا النموذج جيوف-المستندة إلى ملف خفض حدة توتر الذي يحاكي أفضل النظم التوتر التي وجدت في هياكل غشاء خلوي متصل بغشاء الخزانات، مثل الغشاء طيات وإينفاجينيشنز46. في الوقت نفسه، يمكن تطبيق تقنية الشفط ميكروبيبيتي بنجاح للتحكم في التوتر الغشاء جوفس واحد. على سبيل المثال، تقدم العمل الذي يقوم به غرابر et al. تفاصيل عن تكوين غشاء إينفاجينيشنز أنبوبي في جوفس واحدة عند ربط أيونات الكالسيوم للغشاء في معظم الظروف من التوتر المتنوعة نظم40. وأخيراً، يتطلب مقارنة سلوك الغشاء في التعرض المحلي والسائبة للكالسيوم تحسين الرقابة على التصاق الغشاء إلى السطح، والتي خارج نطاق هذا البروتوكول.
لتلخيص، يسمح الأسلوب المقترح لإعادة عرض تلامس الغشاء وتشكيل الخطط المتوسطة الأجل على تحفيز المترجمة مع أيونات الكالسيوم. التطبيقات المستقبلية لمركز هذا الأسلوب على الترجمة من نظم حويصلة الاصطناعية للأغشية البيولوجية الأصلية، مثل بليبس الخلية. الطريقة المقترحة يمكن إدماجها مع مخططات الاستجواب خلية واحدة أخرى، مثل أمبيروميتري التصحيح-المشبك أو ميكرويليكترودي، أو جنبا إلى جنب مع المترجمة تدفئة استراتيجيات31،،من4748. اختبار تأثير أيونات أو جزيئات أخرى واضحة، وينطوي على مجرد استبدال أيونات الكالسيوم مع جزيئات ذات الفائدة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تنتج الحويصلات الدهنية التركيبية المعقدة من خلال غشاء الروغان مع البروتينات ترانسميمبراني، والذي يمكن توسيع فهمنا للفيزياء الحيوية لديناميات تشكيل وغشاء الخلية الخلية المرتبطة بالاستشعار المحلية تدرجات الكيميائية. أخيرا وليس آخراً، يمكن أيضا ترجمة التحفيز تلامس الغشاء الدهني لنظم البوليمرية المسألة لينة، توفر أساسا لمنصة تلاعب تلامس رواية.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |