Summary
우리는 지역화 된 칼슘 이온 기울기를 사용 하 여 소포의 비접촉 식 micromanipulation 위한 기술 제시. 주변에 거 대 한 지질 기 칼슘 이온 솔루션의 microinjection는 막 관 돌출의 생산의 결과로 지질 막 개장 하기 위하여 이용 된다.
Abstract
막 매매 및 apoptosis, 등 기본적인 세포 프로세스의 다양 한 세포 막 모양 전환 동시에 칼슘 이온 농도 있는 지역 변이 발생합니다. 이러한 프로세스에 관련 된 주요 분자 구성 요소 확인 되었습니다; 그러나, 칼슘 이온 기울기 및 세포 막 내의 지질 사이 특정 상호 작용은 훨씬 덜 알려진, 생물 세포의 복잡 한 본질 때문에 주로 및 관측 계획의 성사. 이 격차를 해소 하 합성 접근은 세포 막을 모방에 칼슘 이온의 지역화 된 영향을 성공적으로 구현 됩니다. 셀 내에서 조건을 닮은 모방을 설정 하는 것은 severalfold 문제 이다. 첫째, 적절 한 크기와 막 구성 적절 한 biomimetic 모델 셀의 물리적 특성을 캡처하는 데 필요 합니다. 둘째, 특정 막 위치에 칼슘 이온의 작은 금액을 제공 하는 micromanipulation 설치 필요 합니다. 마지막으로, 감지 하 고 외부 자극에 대 한 지질 막의 응답을 기록 관찰 제도 필요 합니다. 이 문서에서는 칼슘 이온 막 상호 작용, 지질 기 시스템, multilamellar 소포 (MLV)에 연결 된 거 대 한 unilamellar 소포 (우두머리) 구성 된 지역화 된 칼슘에 노출은 공부에 대 한 자세한 biomimetic 접근 그라데이션은 microinjection 시스템을 사용 하 여 형성 했다. 막에 이온 영향의 역학 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 관찰 하 고 비디오 프레임 속도에서 기록 했다. 막 자극 결과로 높은 막 관 돌출 (MTPs) 우두머리, 막 거리 중심 안에 형성 된 곡선. 기술된 접근 완전히 비접촉 식 하 고 제어 된 방식으로 지질 막 및 MTP 생산의 리 모델링을 유도 합니다. 이 이렇게 세부의 칼슘 이온 막 상호 작용, 세포 막 재편의 메커니즘을 연구 하는 새로운도 제공 하는 수단을 소개 합니다.
Introduction
생물 학적 과정, 신호, 세포 분열, 그리고 막 융해에서 특히 그들의 관련에서 칼슘 이온의 역할 많은 기계 연구1의 초점 이다. 세포내 세포질 칼슘 이온 농도 100의 순서는 nM, 동안 바인딩과 그물, 분 비 소포 등 미토 콘 드리 아, 세포에서 칼슘 농도에 millimolars의 최대 수만 레벨에 도달. 이 세포내 막2,3,,45,6,7,8에 걸쳐 가파른 칼슘 이온 농도 기온 변화도 크기 순서를 만듭니다. ,9. 세포 외 칼슘 이온 수준 약 2 m m 이며 따라서, 칼슘 이온 농도의 변화는 extracellular와 세포 수준에서 발생 합니다. 또한, 최근 연구 제공 증거 이벤트 신호는 세포내 칼슘 이온 및 신경 활동의 중요성을 나타내는 세포 외 칼슘 이온 농도의 지역 동요의 조건 하에서 발생할 수 있습니다 동기화 내부-그리고 세포 외 칼슘 이온 변화10.
칼슘 이온 및 생물학 막, 원시 세포 막 지질 bilayer vesicles로 대체는 합성 접근 사이의 상호 작용을 이해 하는 것을 목표로 성공적으로 구현 되었습니다. 지질과 막 단계 전환11,12의 분리 뿐만 아니라 지질 머리 그룹 및 탄 화 수소 체인 패킹, 증가 막 긴장, 및 소포 집계, 변화를 리드 칼슘 이온 솔루션에 소포를 노출 ,,1314,,1516. 칼슘 이온에 노출 시 지질 막의 속성 같은 실험적인 기법을 사용 하 여 x 선, 1H NMR 분 광 또는 열역학적 연구11,16, 로 조사 되었습니다. 17 , 18.이 연구에서 막 구성 종종 닮은 원시 세포 막으로 phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), 및 phosphatidylserine (PS)으로 같은 생리 적 지질을 포함. 추 신: 특히 중요 하다 인공 소포 준비에서 세포내 막 매매, exocytosis, apoptosis19,20를 포함 하는 많은 세포질 과정에 필수적인 구성 요소 이기 때문에.
합성된 지질 소포 크기 종종 몇 마이크로미터 나노미터에서 배열 한다. 다른 기 준비, 거 대 한 unilamellar 소포 (GUVs), 가운데는 몇 마이크로미터 직경에서의 수만,는 밀접 하 게 닮은 그들의 상대적으로 큰 크기 때문에 특별 한 중요성의 개인의 차원 셀21 , 22 , 23.는 GUVs의 사용 가능한 표면 영역에서는 막 공부 될 biophysical 속성에 로컬 화학 기온 변화도의 효과. 외부 자극에 막 표면의 일부만 노출 하 여 막 역학 수 더 면밀 하 게 조사. 예를 들어 GUVs의 표면에 화학 또는 pH 기온 변화도의 지역화 된 응용 프로그램 대량 노출24,25에서 관찰 되지 않는 했다 관 돌출의 형성에 이르게 표시 되었습니다. 막 행동에 관찰된 차이 개장 하는 세포 막의 메커니즘에 대 한 몇 가지 통찰력을 얻기 위해 단일 소포 심문 제도의 발전 방법에 대 한 호출 합니다.
Microinjection와 micromanipulation는 이른 1900 년대26,27,28 200023,단일 기 조작 체계의 최근 발전 관련의 방법에 따라 건물 이 기사는 막에서 리 모델링 및 우두머리 막에서 막 관 돌출 (MTPs)의 형성 칼슘 이온의 로컬 응용 프로그램에 대 한 응답에서 생성 됩니다 접근 제공.
우리의 접근 multilamellar 소포 (MLV)에 연결 하는 우두머리의 biomimetic 막 모델 시스템 (그림 1A)로 구성 된 복잡 한 소포를 이용 한다. MLV는 복잡 한 지질 자료 우두머리를 칼슘 이온 기온 변화도에 노출 동안에 공급을 위한 지질 저수지로 필요 합니다. 이 연결에는 개장 하는 유도 하는 동안 막 긴장의 증가 대 한 보상 및 우두머리 막의 전환 모양 MTP 성장을 위한 지질을 제공 하는 복잡 한 수 있습니다. 또한,는 MLV 용이 하 게 표면 동원 정지 질량은 큰 때문에 우두머리의 비교. 우두머리 MLV 단지, 고체 기판 위에 움직일 때 이전 나노튜브 소포 네트워크 생산, 폴리머 막 상호 작용을 공부 하 고 exocytosis29,30의 후반 단계를 흉내 낸에 대 한 사용 되었습니다. 31,,3233.
이전 프로토콜 활용 콩 극 지 지질 추출 (SPE) 우두머리 MLV 단지28준비 하. SPE PC (45.7%), PE (22.1%), phosphatidylinositol (PI, 18.4%), 포함 하는 인지질 혼합물 phosphatidic 산 (PA, 6.9%), 및 다른 지질 (6.9%)의 혼합으로 구성 됩니다. 여기 우리의 프로토콜 SPE 혼합물 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (나트륨 소금)의 20% 첨가 모방 세포 원형질 막의 내부 전단지 (훨씬 DOP). 추가 1%의 거 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-마약) 얼룩 지질 bilayer 막 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개장의 모니터링을 활성화 하는 데 사용 됩니다. GUVs는 bilayer에 걸쳐 대칭 지질 구성 있고 로컬로 5mm (CaCl2) 염화 칼슘의 농도에 노출 되는. 높은 칼슘 이온 농도와 같은 실험 조건 또한 어디 PS 분자 표현된34는 apoptotic 세포의 외부 막을 전단지를 모방. 우두머리 MLV 단지의 형성에 의해와 켈러35에 의해 처음 개발 된 수정된 재-탈수 방법의 사용을 해야 합니다. 기 준비 프로토콜 솔루션에서 작은 소포를 형성 하는 데 사용 하는 건조 지질 층의 형성을 포함 합니다. 이 솔루션은 다음 탈수 하며 최종 우두머리 MLV 복합물을 형성 하기 위하여 rehydrated. 그림 2A -D 일반적인 우두머리 MLV 복합물의 준비에 대 한 주요 단계를 보여 줍니다.
소포 준비 완료 하 고 복잡 한 소포 유리 기판에 움직일, 오픈 팁 유리 제 micropipette 통해 우두머리의 외부 전단에 적은 양의 칼슘 이온을 제공 microinjection 기술이 사용 됩니다. 팁에서 칼슘 솔루션의 흐름 막 개장 및 세대는 MTPs의 우두머리 막 표면에 지역화 된 칼슘 이온 그라디언트를 생성 합니다. 여 MTPs 칼슘 이온 소스에서 동쪽으로 향하게 하 고 우두머리 내부 성장. 이 MTP 형성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 직접 모니터링할 수 있습니다 및 디지털 카메라를 사용 하 여 기록. 그림 3 막 개장 생성을 위해 사용 하는 실험적인 체제를 보여준다. 이 프로토콜에서 MTPs (그림 2E , 그림 4)의 형성 대량 볼륨 조건에서 수행 하는 칼슘 이온 노출 실험 대조 결과 보여 줍니다. 대량 조건는 GUVs 파열 고 막 패치25유리 표면 관찰 될 수를 형성 한다.
칼슘 이온의 microinjection를 수행 하는 절차로 서 우두머리 MLV 복합물의 대형에 세부 사항 더,이 문서에 설명 되어 있습니다. 프로토콜은 주로 칼슘 이온 microinjection;에 초점을 맞춘합니다 그러나,이 방법은 공부 막 응답 다른 이온 또는 단백질에 로컬 노출 때문에 사용 하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한,는 소포의 구성 막 개장 과정 지질 구성 요소 역할을 분리 조정 될 수 있습니다. 제시 프로토콜 우두머리 MLV 단지를 생산 하기 위해 어떤 정교한 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 재현성의 높은 수준에 의해 특징입니다.
Protocol
1입니다. 작은 지질 Vesicles의 준비
- 79/20/1.The 최종 클로 프롬에 지질 농도 1 mg/mL, 그리고 마지막 질량은 0.6 mg (일반적으로 미만 1 밀리 그램)의 비율을 혼합 하는 질량을 가진 클로 프롬에 지질 SPE/훨씬 DOP/ATTO488-마약의 솔루션을 준비 합니다. 미리 청소 단계 없이 지질 솔루션을 준비할 때 바닥 유리 튜브 (둥근 바닥 유리 튜브, 10 x 75 mm) 라운드 일회용을 사용 합니다.
- 유리 주사기 (25 µ L) 5 번 이상 사용 하기 전에 클로 프롬과 린스를. 작성 하 고 린스 유리 주사기 5 배 이상, 3-4 mL의 클로 프롬은 충분 합니다.
주의: 때 클로 프롬, 처리 유리 주사기를 사용 하 여 적절 한 장갑을 착용 하는 동안 증기 두건에 모든 절차를 수행 하 고 항상 보호 안경. 클로 프롬을 처리할 때 어떤 플라스틱 플라스 크, 주사기, 또는 펫 사용 하지 마십시오.
- 유리 주사기 (25 µ L) 5 번 이상 사용 하기 전에 클로 프롬과 린스를. 작성 하 고 린스 유리 주사기 5 배 이상, 3-4 mL의 클로 프롬은 충분 합니다.
- 주변광에서 내용을 보호 하기 위해 클로 프롬, 80 rpm 7 kPa 진공 도달 압력 제거 하 3 h에 대 한 회전 증발 기에서 용 매를 증발 금속 호 일 지질 혼합물을 포함 하는 유리 유리병을 감싸 줍니다. 건조 지질 필름 증발 (그림 2A) 후 유리 유리병의 바닥에 형성 된다.
참고: 여러 번 확장 하 고 더 많은 양의 지질을 사용 하 여 클로 프롬의 전체 제거 되도록 회전 증발 장시간이 필요할 수 있습니다. - 천천히 인산 염의 600 µ L 말린된 지질 필름 위에 식 염 수 (PBS) 버퍼 솔루션 (pH 7.8, 희석 하지 않고) 버퍼 추가 합니다. 버퍼의 추가 따라 부드럽게 우두머리 MLV 형성 단계 (1 wt %의 글리세롤의 최종 농도 달성)36동안 완벽 한 탈수에서 샘플을 보호 하기 위해 글리세롤의 6 µ L를 추가 합니다. 주변 빛 으로부터 보호 하기 위해 금속 호 일 parafilm와 커버를 사용 하는 유리 유리병 밀봉. 4 ° C에서 냉장고에 하룻밤 보관.
참고: PBS 버퍼 솔루션 이루어져 0.151 g Trizma 자료의, 1.592 g K3PO4의 KH2포41.021 g, 0.062 MgSO4 ·7H2O, g 및 물 정화의 250 mL에 EDTA의 0.0465 g. 4 ° C에서 솔루션을 저장 하 고 사용 하기 전에 실내 온도에 온난 한. 10 mM HEPES buffer의 상응 하는 금액은 PBS 솔루션 대신 사용할 수 있습니다. HEPES 버퍼 솔루션 순화 된 물 1 M HEPES 재고 솔루션을 diluting 하 여 준비가 되어 있습니다. - 다음 날, ultrasonication 목욕을 사용 하 여 실 온에서 1 분에 대 한 솔루션을 포함 하는 유리 유리병 sonicate. parafilm 제거 하 고 플라스틱 작은 지질 vesicles의 시각적으로 균일 한 솔루션 구성 될 때까지 (그림 2B). Aliquot 30 µ L 개별 0.5 mL 플라스틱 튜브로 얻은 작은 지질 기 솔루션의. 최대 6 개월-18 ° C에서 이러한 재고 aliquots를 유지.
참고: 작은 지질 기 솔루션 하지 않으면 시각적으로 균일, 소용돌이 4 번에 대 한 1-2 최대 속도로 소용돌이 믹서를 사용 하 여 솔루션.
2입니다. 우두머리 MLV 복합물의 준비
- 실내 온도에 녹여 작은 지질 vesicles의 냉동된 정지의 약 수를 포함 하는 플라스틱 튜브. 소용돌이 관 4 번 최대 속도로 소용돌이 믹서를 사용 하 여 1-2 s.
- 장소 5 µ L를 작은 유리 커버 슬립 (24 x 60 m m)의 표면에 작은 지질 기 정지의 물방울 라운드. 미리 청소 단계 없이 유리 커버 슬립을 사용 합니다.
- 진공 desiccator에 유리 커버 슬립을 배치 (< 100 kPa 진공) 20 분.
- 4 분 동안 실 온에서 말린된 지질 영화를 저장 한 다음 천천히 플라스틱 재에 대 한 건조 지질 필름 위에 10 mM HEPES 버퍼의 50 µ L. 미리 우두머리 MLV 단지 (그림 2C)를 5 분 기다립니다.
- 현미경 단계에 유리 커버 슬립 센터 다음 그것에 HEPES 버퍼의 300 µ L 플라스틱을 목표 (그림 3B) 위에 작은 물방울의 중심.
- HEPES 솔루션 (300 µ L)으로 미리 형성 된 우두머리 MLV 솔루션의 50 µ L를 전송 합니다. 유리 커버 슬립 (2D 그림)의 표면에 단단히 준수 띄엄띄엄 형성된 우두머리 MLV 단지 수 있도록 25 분을 기다립니다.
참고: 때때로, 우두머리 MLV 복합물을 형성 하지 않는다 유리 커버 슬립에 고 대신 지질 패치 또는 MLVs만 관찰 된다. 이 실수로 떨고 샘플의 단계 동안 작은 소포 서 스 펜 션의 2.4 또는 2.6, 또는 수많은 freeze-thaw 주기 설명 될 수 있다. 반복 단계 2.1 2.6 또는 우두머리 MLV 단지를 갓된 지질 재고 솔루션 (단계 1.1)을 사용 하 여.
3. micropipette 준비 및 Microinjection
- 부드럽게 모 세관을 배치 하 여 붕 규 산 유리 모 세관의 모서리 라운드는 micropipette micropipette 홀더를 연결 하는 동안 나눠지지 않도록 촛불의 불꽃에 끝납니다.
- 3 유리 모 세관 프로그램 세트를 사용 하 여 자동 레이저 풀러를 사용 하 여 당겨: 열 400, Fil = = 4, 벨 = 50, 델 225, 풀이 = =; 열 = 400, Fil = 4, 벨 = 60, 델 150 인치 = = 120. 프로그램 세트 풀이 비어의 첫 번째 값을 입력 합니다. 붕 규 산 유리 모 세관의 내경 (아이디)를 사용 하 여 1.00 m m 외부 직경 (마약) 0.78 m m에서에서 및 결과 micropipette 직경에서 약 0.3 µ m의 팁 열기와 함께.
- 다시-채우기 각 micropipette 5 mM HEPES buffer (10 mM)는 microloader를 사용 하 여에서 CaCl2 솔루션의 8 µ L로. CaCl2 솔루션 0.2-0.5를 사용 하 여 필터링을 피 펫 팁의 막힘을 피하기 위해 사용 전에 µ m 주사기 필터.
주: CaCl2 단계 2.4-2.6에 대 한 사용 또한 HEPES 버퍼 솔루션에 완전히 용 해 되도록 합니다. - micromanipulator micropipette 홀더를 연결 합니다. 탑재는 micropipette micropipette 홀더에 단단히. 주입 펌프 및 모 세관 홀더 공급 튜브를 사용 하 여 연결 합니다.
- 주입 펌프를 시작 합니다. 20 hPa (사출 압력)를 주입 펌프에 설정을 조정 하 고 자동 모드에서 5 hPa 보상 압력을 설정 합니다. micropipette는 microinjection에 대 한 준비가 될 때까지 주입 펌프를 일시 중지 합니다.
- 현미경 대물 모드를 설정 합니다. 미분 간섭 콘트라스트 (DIC)에 대 한 구성 합니다. 63 X 또는 100 X 높은 NA (1.3) 목표를 사용 하 여 최적의 막 가장자리 해상도 달성 하기 위해.
- 거친 micromanipulator를 사용 하 여 포함 하 우두머리 MLV 단지 방울 위에 micropipette 위치. 목적은 위에 micropipette의 끝을 찾습니다.
- 우두머리 MLV 복잡의 중간점에 현미경을 집중 하 고 그 우두머리 위에 약 50 µ m 촛점. 부드럽게 초점으로는 micropipette가지고 micromanipulator의 거친 모드를 사용 합니다.
- 좋은 모드 micromanipulator 스위치입니다. 천천히 아래로 micropipette 팁을 번역 하 고 초점에 팁을 유지 하면서 우두머리 표면에 촛점. 우두머리 표면에서 micropipette 팁 약 20 µ m를 놓습니다. 유리 커버 슬립 ( 그림 5B에서 예제)와 우발적인 접촉 한다고 micropipette 팁 이면 샘플 대량 솔루션으로 불필요 한 칼슘 이온 출시를 피하기 위해 즉시 그것을 교체 합니다.
4. 형성 및 칼슘 이온 소스를 사용 하 여 MTPs 번역
- 현미경 형광 모드로 설정 합니다. 488에서 자극 dichroics 설정 nm 505-550 nm에서 방출을 검출 하 고.
- 주입 펌프에 전환 하 고 칼슘 이온 주입을 시작 합니다. Micromanipulator의 고급 모드를 사용 하 여 천천히 micropipette 팁 우두머리. CaCl2 솔루션 MTPs 양식 (그림 4)에 있도록 micropipette에서 주입 하는 동안 micropipette 팁 막 표면에서 3 µ m의 거리에 위치.
- 우두머리 표면 따라 MTPs 번역, 천천히 이동 피 펫 팁 (속도 0.1-0.3 µ m/s) 우두머리 주위 표면 미세 micromanipulator (그림 6)를 사용 하 여. 칼슘 이온 주입을 계속 하는 동안 약 사이 같은 거리 (3 µ m) 우두머리 표면과 micropipette 팁을 유지 합니다.
참고: 높은 번역 micropipette 팁 (위 0.7 µ m/s)의 속도,는 MTPs 마이그레이션되지 않습니다는 micropipette와 동기화. 대신, 그들은 뿌리 하 고 단축, 새로운 MTPs micropipette 팁 (그림 7)의 새로운 위치에서 형성 될 것입니다 하는 동안 것입니다. - microinjection을 중지, 주입 펌프를 해제 하 고 우두머리 표면에서 micropipette를 이동 합니다.
Representative Results
이 작품에서 우두머리 MLV 단지와 어떻게 세포 막 역학에 칼슘 이온 기울기의 영향을 명료 하 게를 사용할 수 있습니다 설명 합니다. 표면 부착 우두머리 MLV 단지는 microinjection 통해 이온 그라디언트를 설정 하는 동안 고정된 셀 크기의 모방 수 있도록 이러한 실험에 대 한 필요 합니다. 우두머리 막 MTPs 칼슘 이온 소스에서 감독의 형성을 통해 지역화 된 칼슘 농도에 응답 합니다. 또한, 여 MTPs micropipette 팁 막 표면 주위를 이동 하 여 비접촉 식 방식으로 우두머리 주위에 번역 될 수 있다.
우두머리 MLV 준비 절차의 도식 적인 그림은 그림 2에 표시 됩니다. 제시 프로토콜 우두머리 MLV 단지는 이미 미리 형성 단계 2.4 (그림 2C), 비록에 띄엄띄엄 형성된 우두머리 MLV 단지 수 기 솔루션 버퍼 (프로토콜의 단계 2.6)의 또 다른 300 µ L 작은 물방울 전송 충분히 유리 기판에 준수 합니다. 이 방법에서는, micromanipulation 및 microinjection에 대 한 적합 한 복잡 한 설정 (그림 2D). 때때로, GUVs는 그림 4A와 같이 MTP 형성에 영향을 주지 않습니다 하나 또는 여러 개의 봉된 지질 소포 포함. 이러한 GUVs 생산 MTPs; 그러나, 봉된 소포 큰 경우는 영상 방해 수 있습니다. 준비 된 GUVs의 대부분 (75%까지) 반구형 나타나고 그림 1A와 같이, MLVs에 연결 된. 이 소포는이 프로토콜의 주요 초점 고 microinjection 절차에 적합. 나머지 GUVs의 약 25% 기복 나타납니다 (그림 1B), 낮은 막 긴장 정권의 지표입니다. 이러한 기복 소포는 또한 관 돌출;의 형성에 대 한 허용 그러나, 그들은 다른 속도 론 및이 프로토콜25의 범위를 벗어납니다 형성된 MTPs의 다른 형태 전시. 준비 된 소포의 전형적인 직경 2 ~ 15 µ m는 MLVs에 대 한 2 ~ 40 µ m는 GUVs에 대 한 다릅니다. 최적의 우두머리 칼슘 이온에 노출은 5 µ m 크기 또는 더 큰.
Micropipettes 몇 십년37,38합성 GUVs의 조작을 요구 하는 절차로 또한 단일 셀 심문 구성표에서 사용 되었습니다. 이러한 응용 프로그램의 대다수는 micropipette 셀 또는 소포 표면 사이 직접적인 신체 접촉 관련. 예로 패치 클램프 기술 또는 나노튜브 소포 네트워크23,,2839건물 뿐만 아니라 우두머리 막에서 막 밧줄을 당기고 있습니다. 최근, micropipettes 또한 이온 및 다른 유형의 셀 microenvironments,2425를 재구성 하는 GUVs 주위 분자의 지역화 된 그라디언트를 생성 하기 위해 사용 되었습니다. 제시 프로토콜에 제대로 작동 micropipette (그림 5A)에 포함 된 솔루션을 출시 하 여 우두머리 표면에 칼슘 이온 기울기를 설정 하기 위한 중요 한 요소 이다. 적절 한 우두머리 표면에 micropipette의 위치와 지질 막과의 접촉을 피하는 성공적인 microinjection에 대 한 필수적입니다. Micropipette 팁 MTPs 칼슘 세포 막 근처의 유사를 흉내 낸 동시에 생성 하는 최적의 거리는 우두머리 표면에서 대략 3 µ m의 거리에서 개최 됩니다. Micropipette 팁 실수로 깨진된 (그림 5B) 인 경우에, 보충이 필요 합니다. MTP 형성에 대 한 허용, micropipette 내부 이전 시험된 농도 범위 CaCl2 2, 5 m m25, 세포 외 칼슘 농도에 해당 하는 사이입니다. 낮은 CaCl2 농도, 즉, 1 mM, 아니 MTPs 관찰 된다.
칼슘 microinjection 따라 MTPs 형성 MTPs 노출 (그림 4B)의 사이트에 증가 하는 작은 멤브레인 invaginations의 대형으로 시작 합니다. 여 MTPs 만큼 칼슘 이온에 노출 우두머리 막 남아 성장을 계속 합니다. 그들은 변동 하 고 칼슘 이온 소스 (그림 4C, 보충 영화 1)에서 가리킵니다. 칼슘 이온 공급 종료 되었을 때, 어렵게 여 MTPs 유지 여부 결국 사라질 결론 우두머리 표면 MTPs 분산형.
직접 관련 된 지역화 된 칼슘 이온 우두머리 막의 노출된 외부 전단지에 바인딩 및 자발적인 곡률 (m), 트리거링 MTPs의 형성을 설명할 수 있다 자발적인 형성 긴장 σ = 2κm2 (Κ 는 굽 힘 강성), 그 막의 굽 힘 및 안으로 MTPs 형성 유도. 이전 보고서는 응축에 의해 설명 및 클러스터링 부정적인 자발적인 곡률40에서 결과, 막에는 칼슘 이온의 바인딩 시 부정 청구 지질 막의 변형 수 증명 하고있다. 또는, 부정 청구 bilayer의 표면에 캘리포니아2 + 의 강한 바인딩 노출된 지질 bilayer 전단지의 표면 충전 밀도 중화. 0이 아닌 자발적인 곡률, 구 부 막25충분 한 결과로 bilayer에 걸쳐 충전 밀도 차이을이 끈다.
MTPs의 관찰된 형성 칼슘 이온을 지질 막의 감도 보여줍니다 및 막 관 구조를 제작 하기 위한 새로운 비접촉 식 접근 방식을 제공 합니다. 기원 elucidating이 막 tubulation의 막 모양 다양 한 세포 기능 및 세포 재편 중 전환의 역학을 이해 하기 위한 중요 한 수와 세포 내 지질 조직으로 통찰력을 얻고에 대 한 도움이 될 수 있다 막입니다.
관찰된 MTPs 항상 칼슘 이온 노출을 받고 막에 사이트에서 생성 됩니다. 따라서, micropipette 팁의 위치를 선택 하 여 돌출 성장 위한 우두머리 표면 영역 정의 가능 하다. 다음의 경우는 micropipette 천천히 (0.1-0.3 µ m/s), 막에서 이격 거리를 유지 하면서 우두머리 표면 이동 여 MTPs는 micropipette 함께에서 변환 됩니다. 그림 6 와 해당 보 영화 2 우두머리 표면 주위 MTPs의 마이그레이션 등을 보여 줍니다. 이 과정은 새로운 MTPs 연속 칼슘 이온 주입25시의 형성에 의해 동반 될 가능성이 높습니다. (0.7 µ m/s) 이상 높은 번역 가격, 여 MTPs micropipette 팁을 따를 수 없습니다. 대신, 새로운 돌출 micropipette 팁 (그림 7)의 새로운 위치에 형성 된다.
관찰 된 비접촉 식 칼슘 이온 가이드 번역 MTPs의 추가 운전의 우리의 이해의 세포 내부 막 관 구조 역학에 뒤에 세력 우두머리 표면 수 주위. 또한,이 방법은 화학 그라디언트를 사용 하 여 부드러운 문제 시스템에 자료의 전송 제어를 위한 새로운 비접촉 식 모드를 제공 합니다.
그림 1 : 유리 커버 슬립의 표면에 움직일 우두머리 MLV 단지의 대표 형광 현미경 이미지. (A). 구형 우두머리의 예. 우두머리는 MLV에 연결 된 반구의 형태로 나타납니다. (B). 기복 우두머리의 예. 검은 화살 막의 변형된 영역을 나타냅니다. 이미지 강화 하 고 거꾸로 붙일 레이블된 우두머리 막의 시각화를 개선 하는. 눈금 막대 나타냅니다 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 우두머리 MLV 준비 및 microinjection 체계의 도식 일러스트. (A). 건조 지질 층 지질 솔루션에서 클로 프롬의 회전 증발의 결과로 유리 유리병의 바닥에 형성 된다. (B). rehydrated 지질 층 sonicated 및 작은 지질 소포 형성 된다. (C). 소포 솔루션 (5 µ L)의 작은 물방울 유리 커버 슬립의 표면에 놓이고 탈수 지질 솔루션 (이 단계는 표시 되지 않습니다.) 건조 지질 막을 형성을 20 분 동안 desiccator로 전송. 버퍼 솔루션의 50 µ L로 건조 지질 영화 재 미리 형성 된 우두머리 MLV 단지 생성 합니다. (D). 유리 커버 슬립의 표면에 부착 된 띄엄띄엄 분리 우두머리-MLVs의 형성에서 버퍼 결과의 더 큰 볼륨을 미리 형성 된 단지의 전송. (E). micropipette 우두머리의 표면 근처에 위치 하 고 칼슘 이온 방출 MTPs의 형성을 트리거합니다. 그림 안 그려 규모. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 칼슘 이온의 microinjection에 대 한 실험적인 체제. (A). 여 MTPs는 GUVs에서 생성 하는 데 필요한 실험 설치의 구성 요소. (B). microinjection 설치의 세부 사항. 우두머리 MLV 단지의 솔루션 유리 coverslip 현미경 스테이지에 배치합니다. micropipette 유리 커버 슬립의 서피스 사이의 각도 30 ° (화이트에 표시)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : MTPs 우두머리의 표면에서 칼슘 이온의 microinjection 시의 형성. (A). 칼슘 이온 기온 변화도에 노출 이전에 우두머리 MLV 복잡 한. 화살표 우두머리, 내부 침투 지질 소포 나타내고 있는 MTPs. (B) 관찰을 방해 하지 않습니다. 작은 MTPs 칼슘 이온 (CaCl2 는 micropipette의 5 mM 농도)의 microinjection에 따라 형성 된다. (C). 칼슘 이온에 지속적인 노출 시 MTPs의 성장. 형광 이미지는 향상 하 고 시각화를 위해 반전. 눈금 막대 나타냅니다 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 유리 칼슘 이온 microinjection에 사용 되는 micropipettes. (A). 제대로 작동 micropipette의 예. (B). 깨진된 팁 (손상된 영역 표시 됩니다 검은색 화살표)는 micropipette의 예. 두 이미지는 향상 하 고 더 나은 시각화를 위한 반전. 눈금 막대 나타냅니다 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 우두머리의 표면 주위 MTPs의 칼슘 이온 가이드 번역. (A).는 MTPs 5mm CaCl2 솔루션의 microinjection 시 우두머리 표면에 형성 된다. (B-C)입니다. Micropipette 팁의 번역 (0.2-0.3 μ m/s) 막 주위 표면 MTPs 칼슘 이온 소스의 방향으로 움직임을 트리거합니다. 검은 화살표 micropipette 운동의 방향을 강조 표시합니다. 이미지 향상 되며 반전 막 시각화를 향상. 눈금 막대 나타냅니다 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : Micropipette 팁의 높은 번역 속도로 MTPs. (A).는 MTPs 5mm CaCl2 솔루션 (흰색 선)의 microinjection에 우두머리 표면에 형성 된다. (B-C)입니다. 우두머리 표면 (1 μ m/s) 주위 micropipette의 높은 번역 속도 micropipette 팁 (자홍색 선)의 새로운 위치에 새로운 MTPs 형성 이전 형식의 MTPs (흰색 선)의 분산 뿐만 아니라 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 1: Ca에 지역화 된 노출 시 우두머리에 MTPs 형성 2 + 그라데이션. 이 영화를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 영화 2: 칼슘 이온 인도 MTP 마이그레이션 우두머리 표면 주위. 이 영화를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
생체 모방 셀 시스템의 이온, 단백질, 나노 입자 등 외부 자극에 노출 되 면 막 행동 연구에 대 한 허용. GUVs, 같은 모델, 자주 관 구조와 invaginations24,,4142,43의 형성을 포함 하는 그들의 모양을 조정 하 여 화학 환경에서 변경에 응답할 수 있습니다. .
이 문서는 MTPs 우두머리 표면에서 칼슘 이온의 지역화 된 주입 시 우두머리의 리 모델링을 통해 비접촉 방식으로 생성 하는 방식을 제공 합니다. 프로토콜의 방법으로 칼슘을 생성 하는 microinjection 기술을 채택 하 이온 그라디언트 우두머리에 가까운 형태로 MTPs 표면 셀 플라즈마 멤브레인, 또한 모방 우두머리 MLV 복잡 한 준비를 설명 합니다. 칼슘 이온 막 상호 작용 해결 이전 실험 연구의 대부분 대량으로 칼슘 이온 농도14,17지질 소포 노출. 실험 조건에 따라 같은 대량 노출 관 돌출 형성25와 다른 막 응답 될 수 있습니다.
우두머리 MLV 단지의 형성은 오히려 간단 하며만 회전 증발 기, 초음파 탕, 진공 desiccator 등 표준 실험실 장비. 아직도, 소포 준비 하는 동안 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 그것은 (2.3의 단계는 프로토콜) 완료 되는 소포의 탈수 및 건조 원형 지질 영화 포함 하는 작은 양의 소금 결정은 유리 커버 슬립의 표면에 형성 하는 것이 중요. 실험 중 기 솔루션의 취급 주의 신선한 HEPES 버퍼, 클로 프롬에 신선한 지질 재고 솔루션을 사용 하 여 필수적 이다 우두머리 MLV 단지의 성공적인 준비를 위해. 또한, 유리 커버 슬립 표면에 우두머리 MLV 단지의 안전한 첨부 파일은 micromanipulation 및 microinjection에 대 한 중요 합니다. 우두머리 MLV의 적절 한 접착을 확인 하려면, 복잡 한 (사출 흐름) 없이 micropipette 사용할 수 있습니다 우두머리 표면에 부드럽게 밀어. 단단히 준수 소포 직접적인 물리적 접촉 시 표면 슬라이드 하지 합니다. 실험은 몇 시간 동안 심문 수 있습니다 하는 오픈 버퍼 작은 물방울에서 수행 되기 때문에 증발으로 적용 해야 합니다. 버퍼 물방울에서 증발에 영향을 미칠 수 있는 소포는 불안정 삼투성 조건 변경 됩니다. 삼투성 조건에 복원 하려면 원래 볼륨을 복원 하려면 샘플에 순수한 물의 정기 추가 항상성에 시스템을 반환 합니다.
지질 막 구성, 수정할 때 그것은 중요는 MLV 막 재편 중 우두머리를 지질 자료를 전송 하기 위한 허용 하기 때문에 소포 우두머리 MLV 복잡 한 형태로 생산 됩니다. 이전 연구는 순수 지질와 SPE 혼합물의 구성 요소를 교체 하거나 5-30%, 콜레스테롤의 추가 또한 우두머리 MLV 복잡 한 대형28,44수 나타났습니다. 준비 된 GUVs의 대부분은 unilamellar45.
또한, 다른 divalent 양이온, 마그네슘 이온 등을 테스트 하는 경우는 MTPs 형성 무 겁 게 달려 있다 지질 혼합물에서 부정 청구 훨씬 DOP의 존재. 여 MTPs 훨씬 DOP, 하지 않고이 프로토콜에서 설명 하는 소포를 형성 하지 않는다. 또한, 칼륨과 나트륨, 등 여러차례 양이온 훨씬 DOP를 포함 하는 소포25에서도 MTPs의 형성 발생 하지 마십시오.
준비 및 조작은 GUVs의 중요 한 단계 이외에 microinjection 절차 동안 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 요인이 있다. 칼슘 이온의 성공적인 microinjection 무 겁 게 의존 하 고 제대로 작동 실험 당일 준비 micropipettes 유리. Micropipette 오작동을 일으킬 수 있는 몇 가지 요인이 있다. 일반적인 이유는 막힌된 팁 오프닝 이다. 소포 준비의 부산물 인 작은 지질 입자 솔루션에서 분산 하 고 그로 인하여 생성 한 막힘 micropipette 팁을 준수 하는 경향이. 피 펫 팁을 청소 최고의 소포 해결책에서 그것을 해제 하 고 다시 우두머리 표면 가까이 배치 하 여 이루어집니다. Microinjection 펌프의 분출 기능의 사용 대량 솔루션으로 칼슘 이온의 대규모 주입에 결과 때문에 피해 야 한다. 또한, 작은 기포는 micropipette 내부 침투 방지 적절 한 microinjection, 어떤 경우는 micropipette 새 것으로 교체 해야 합니다. 팁 파손 크게 팁 진동을 최소화 하기 위해 진동 방지 테이블에 실험적인 체제를 배치 하 여 최소화할 수 있습니다.
또한, 케어 최고의 시간 해결 이미지를 취득 하는 동안 photobleaching를 최소화 하기 위해 관측 계획을 선택할 때 주의가 필요 합니다. 넓은 필드 레이저 유도 형광 현미경 검사 법에 객관적인 제한 프로브 깊이에서 상대적으로 높은 이미지 수집 속도 대 한 허용 하기 때문에이 프로토콜에서 이용 되었다. 또한, 거꾸로 현미경의 사용 동시 microinjection 및 지질 소포 및 MTPs 관찰 할 수 있습니다.
제시 방법의 주요 한계 중 하나는 광범위 한 수동 작업의 충분 한 micromanipulation 기술을 요구 사항입니다. 복합물은 자발적인 붓기 과정을 통해 형성 된다, 때문에 GUVs와 MLVs의 크기를 제어할 수 없습니다. 또한,이 프로토콜 막 개장 관련 하 여 추가 정보를 수집 해야 할 수도 있습니다 준비 우두머리 MLV 단지의 막 장력의 제어에 대 한 허용 하지 않습니다. GUVs는 GUVs에서 사용할 수 있는 멤브레인을 활용 하 여 전적으로 달성 하는 건 불가 능할 것 이라고 어느 정도 MTPs의 실질적인 성장에 대 한 후자의 공급 지질 자료와 MLVs에 연결 됩니다. MLVs도 낮추는 우두머리 MLV 복잡 한44, micropipette 포부를 사용 하 여는 기의 장력을 제어 하는 시도 복잡 하 게는 내 모든 측면 표면 장력 변화에 기여. 이 우두머리 MLV-기반 모델 더 나은 모방 세포 막 구조 막 주름과 invaginations46같은 막 저수지에 연결 되어 있는 긴장 정권 낮은 긴장을 제공지 않습니다. 동시에 micropipette 포부 기술은 성공적으로 단일 GUVs에 막 장력 제어에 적용할 수 있습니다. 예를 들어 Graber 외. 여 작품 제공 세부 막 관 invaginations 바인딩에 따라 단일 GUVs에서 칼슘 이온의 형성에 대량 조건에서 막에 다양 한 긴장 정권40에서. 마지막으로, 칼슘에 모두 로컬 및 대량 노출에서 막 행동의 비교는이 프로토콜의 범위를 벗어납니다 표면에 막 접착의 향상 된 제어를 필요 합니다.
요약, 제안 된 기술 비접촉 식 막 개장 및 칼슘 이온 지역화 된 자극에 따라 MTPs의 형성 수 있습니다. 셀 blebs 같은 네이티브 생물 세포 막 합성 기 시스템에서 번역에이 방법 센터의 미래 응용 프로그램입니다. 제안된 된 방법 패치 클램프 또는 microelectrode amperometry 같은 다른 단일 셀 심문 제도와 통합 하거나 함께 수 지역화 전략31,,4748난방. 다른 이온 또는 분자의 효과 테스트 간단 하 고 단순히 관심의 분자와 칼슘 이온을 대체 하는 포함 한다. 또한, 복잡 한 합성 지질 소포 세포 재편 및 세포 막 역학의 감지와 관련 된 물리학의 우리의 이해를 확장 수 있습니다 막 횡단 단백질 막 기능화를 통해 생성 될 수 있다 화학 기온 변화도입니다. 마지막으로, 지질 막의 비접촉 식 자극 또한 고분자 소프트 문제 시스템, 새로운 비접촉 식 조작 플랫폼에 대 한 기초를 제공 하 고 번역 될 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1x25 mg |
| ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
| Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
| Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
| Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
| Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
| Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
| Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
| Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
| Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
| Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
| Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
| MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
| EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
| HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24x60 mm |
| Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
| Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
| Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
| Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
| VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
| 488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
| Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
| Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
| Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
| PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
| Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
| Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
| P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
| Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |
References
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