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Chemistry

Remodelage de membrane de vésicules géants en réponse aux Gradients d’Ion Calcium localisée

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57789
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology

Summary

Nous présentons une technique de micromanipulation sans contact de vésicules, avec des gradients d’ion calcium localisée. La microinjection d’une solution d’ion calcium, à proximité d’une vésicule lipidique géant, est utilisée pour remodeler la membrane lipidique, aboutissent à l’obtention de protubérances tubulaires de membrane.

Abstract

Dans une grande variété de processus cellulaires fondamentaux, comme le trafic de membrane et de l’apoptose, membrane cellulaire forme transitions se produisent en même temps que les variations locales de concentration en ions calcium. Les principaux composants moléculaires impliquées dans ces processus ont été identifiés ; Toutefois, l’interaction spécifique entre les gradients d’ions de calcium et des lipides dans la membrane cellulaire est beaucoup moins connue, principalement en raison de la nature complexe des cellules biologiques et le difficilement des régimes de l’observation. Pour combler cette lacune, une approche synthétique est implémentée avec succès pour faire apparaître l’effet localisé des ions calcium sur la membrane cellulaire imite. Établissant un imitateur pour ressembler à des conditions dans une cellule est un problème plusieurs fois. Tout d’abord, un modèle biomimétique suffisante avec les dimensions appropriées et composition de la membrane est nécessaire pour capturer les propriétés physiques des cellules. Deuxièmement, une configuration de micromanipulation est nécessaire pour offrir une petite quantité d’ions calcium à un emplacement particulier de membrane. Enfin, un système d’observation est nécessaire pour détecter et enregistrer la réponse de la membrane lipidique à la stimulation externe. Cet article propose une approche biomimétique détaillée pour l’étude de l’interaction ion-membrane de calcium, où un système de vésicules lipidiques, consistant en une vésicule unilamellaires géant (GUV) connectée à une vésicule multilamellaire (MLV), est exposé à un calcium localisé gradient formés à l’aide d’un système de micro-injection. La dynamique de l’influence ionique sur la membrane ont été observée à l’aide de la microscopie en fluorescence et comptabilisée au taux de trame vidéo. À la suite de la stimulation de la membrane, fortement courbé membrane tubulaire parties saillantes (MTP) formés à l’intérieur de la GUV, orientée loin de la membrane. L’approche décrite induit le remodelage de la membrane lipidique et de la production du PSG d’une manière tout à fait sans contact et contrôlée. Cette approche présente un moyen d’aborder les détails des interactions ion-membrane de calcium, offrant de nouvelles possibilités pour étudier les mécanismes de remodelage de la membrane cellulaire.

Introduction

Le rôle des ions calcium dans les processus biologiques, plus précisément leur implication dans la signalisation, la division cellulaire et fusion membranaire, est l’objet de nombreuses études mécanistes1. La concentration en ions calcium cytoplasmique intracellulaire est l’ordre de 100 nM, tandis que le calcium dans les organites, telles que le réticulum endoplasmique et des vésicules sécrétrices mitochondries, atteignent des niveaux pouvant atteindre des dizaines de millimolars de concentration. Cela crée raide calcium ions gradient de concentration ordres de grandeur à travers les membranes intracellulaires2,3,4,5,6,7,8 ,,9. La concentration d’ions de calcium extracellulaire est d’environ 2 mM, et par conséquent, les variations de la concentration en ions calcium se produisent aux niveaux intracellulaires et extracellulaires. En outre, ces dernières études prouvent que l’ion calcium intracellulaire des événements de signalisation et de l’activité neuronale peut se produire dans les conditions des fluctuations locales des concentrations d’ions de calcium extracellulaire, ce qui indique l’importance de synchronisé intra - et extracellulaire de calcium ionique variations10.

Visant à comprendre les interactions entre les ions calcium et les membranes biologiques, une approche synthétique dans laquelle native des membranes cellulaires sont remplacées par des vésicules de bicouche lipidique a été implanté avec succès. Exposer des vésicules vers les solutions d’ions de calcium entraîne des changements dans les groupes de tête de lipide et d’emballage chaîne d’hydrocarbure, tension membranaire accrue et agrégation de vésicule, ainsi que la ségrégation des lipides et membrane phase transition11,12 ,13,14,15,16. Les propriétés des membranes lipidiques par exposition à des ions de calcium ont été étudiées en utilisant ces techniques expérimentales comme les rayons x, 1H-RMN et études spectroscopiques ou thermodynamique11,16, 17 , 18. dans ces études, la composition de la membrane est souvent à l’écoute pour ressembler au natif des membranes cellulaires et contient des lipides physiologiques comme la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE) et la phosphatidylsérine (PS). PS est particulièrement important dans la préparation de la vésicule artificielle parce que c’est un élément essentiel dans de nombreux processus cellulaires, y compris le trafic membranaire intracellulaire, l’exocytose et l’apoptose19,20.

La taille des vésicules lipidiques synthétisées varie souvent de nanomètres à plusieurs micromètres. Parmi les préparations différentes vésicules, vésicules unilamellaires géant (GUVs), qui sont plusieurs à quelques dizaines de micromètres de diamètre, sont d’une importance particulière en raison de leur taille relativement importante, ressemblant étroitement à des dimensions de l’individu cellules21 , 22 , 23. la surface disponible des GUVs permet l’effet des gradients chimiques locales sur les propriétés biophysiques de la membrane à étudier. En exposant une partie seulement de la surface de la membrane aux stimuli externes, la dynamique de la membrane peut être étudiée de plus près. Par exemple, il a été démontré qu’application localisée des gradients de pH ou de produit chimique à la surface de GUVs conduit à la formation de protrusions tubulaires, qui n’a été observé à vrac exposition24,25. Les différences observées dans le comportement de la membrane appellent développement méthode des systèmes single-vésicule interrogatoire pour obtenir des idées sur les mécanismes de remodelage de la membrane cellulaire.

S’appuyant sur les méthodes de micro-injection et micromanipulation depuis le début des années 190026,27, dans le cadre des plus récentes avancées des systèmes single-vésicule manipulation depuis les années 200023,28 , cet article présente une approche dans laquelle la membrane remodelage et la formation de protrusions tubulaires de la membrane (MTP) dans la membrane GUV sont générées en réponse à une demande locale d’ions calcium.

Notre approche utilise une vésicule complexe consistant en un GUV relié à une vésicule multilamellaire (MLV) comme un système de modèle de membrane biomimétique (Figure 1 a). Le VCP est nécessaire comme un réservoir de lipides pour le complexe à fournir du matériel de lipides à le GUV pendant l’exposition à un gradient d’ions calcium. Cette connexion permet le complexe compenser l’augmentation de la tension de la membrane au cours de remodelage induite et façonner la transition de la membrane GUV et fournir des lipides pour la croissance du PSG. En outre, le VCP facilite l’immobilisation surface car sa masse est plus grande par rapport à celle de la GUV. Les complexes de GUV-MLV, lorsque immobilisée sur un substrat solid, ont été précédemment utilisés pour produire les réseaux de nanotube-vésicule, étudier les interactions polymère-membrane et imitant les derniers stades de l’exocytose29,30, 31,32,,33.

Précédents protocoles utilisés extrait de soja lipides polaires (SPE) pour préparer les GUV-MLV complexes28. La SPE compose d’un mélange de phospholipides incluant PC (45,7 %), PE (22,1 %), phosphatidylinositol (PI, 18,4 %), l’acide phosphatidique (PA, 6,9 %) et un mélange d’autres lipides (6,9 %). Dans notre protocole ci-après, le mélange SPE est dopé avec 20 % de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sel de sodium) (DOPS) pour imiter le feuillet interne de la membrane plasmique. Un autre 1 % d’ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) est utilisé pour colorer la bicouche lipidique pour permettre un suivi de la retouche de membrane à l’aide de la microscopie de fluorescence. Les GUVs ont la composition lipidique symétrique à travers la bicouche et sont localement exposés à des concentrations de 5 mM de chlorure de calcium (CaCl2). Ces conditions expérimentales, avec une concentration en ions calcium élevé, imitent également le dépliant de la membrane externe des cellules apoptotiques, où les molécules de PS sont exprimés34. La formation des complexes GUV-MLV nécessite l’utilisation d’une méthode de réhydratation-déshydratation modifiée développée initialement par Criado et Keller35. Le protocole de préparation de vésicule comprend la formation d’une couche de lipides sec, qui est ensuite utilisée pour former de petites vésicules dans la solution. Cette solution est ensuite déshydratée et réhydratée pour former les complexes GUV-MLV finales. Figure 2 a -D illustre les principales étapes pour la préparation d’un immeuble typique de GUV-MLV.

Après la préparation de la vésicule est terminée et la vésicule complexe est immobilisée sur le substrat de verre, la technique de microinjection est utilisée pour fournir de petites quantités d’ions calcium au feuillet externe de la GUV grâce à une micropipette de verre ouvert-pointe. L’écoulement de la solution de calcium sur la pointe génère un gradient d’ions calcium localisée à la surface de la membrane GUV, menant au remodelage de la membrane et la production de la MTP. Les MTP est orientées loin de la source d’ions de calcium et se développer à l’intérieur de la GUV. Cette formation de MTP peut être contrôlée directement à l’aide de la microscopie en fluorescence et enregistrées à l’aide d’un appareil photo numérique. La figure 3 montre le montage expérimental utilisé pour produire le remodelage de la membrane. La formation de la MTP (Figure 2E et Figure 4) dans le présent Protocole montre un résultat contrasté au calcium ions exposition expériences réalisées dans des conditions de volume en vrac. Dans des conditions en vrac, les GUVs se rompent et forment des taches de membrane qui peuvent être observées à adhérer à la surface de verre25.

De plus amples renseignements sur la formation de complexes GUV-MLV, ainsi que les procédures d’exécution de la microinjection d’ions calcium, sont expliqués dans cet article. Les protocoles sont en grande partie axés sur microinjection d’ions calcium ; Toutefois, cette approche modifiable facilement devant servir à étudier les réponses de membrane en raison de l’exposition aux autres ions ou les protéines. En outre, la composition des vésicules peut être ajustée afin d’isoler les rôles de composant lipidique dans le processus de remodelage de la membrane. Le protocole présenté ne nécessite pas un équipement sophistiqué pour produire les complexes GUV-MLV et se caractérise par un haut degré de reproductibilité.

Protocol

1. préparation des vésicules lipidiques petit

  1. Préparer une solution de lipides SPE/DOPS/ATTO488-DOPE dans le chloroforme avec une masse mélange ratio de 79/20/1.The final concentration de lipides dans le chloroforme est de 1 mg/mL, et la messe finale est 0,6 mg (généralement inférieure à 1 mg). Jetable ronde flacons en verre bas (rond bas tubes en verre, 10 x 75 mm) lors de la préparation de la solution lipidique sans une étape de nettoyage avant utilisation.
    1. Remplir et rincer les seringues de verre (25 µL) avec le chloroforme au moins 5 fois avant utilisation. Pour remplir et rincer la seringue en verre au moins 5 fois, 3-4 mL de chloroforme est suffisante.
      ATTENTION : Quelle manipulation chloroforme, utiliser des seringues de verre et exécuter toutes les procédures dans une hotte avec des gants appropriés et des lunettes de protection en tout temps. Ne pas utiliser les flacons en plastique, seringues ou pipettes lors de la manipulation de chloroforme.
  2. Envelopper le flacon en verre contenant le mélange de lipides avec feuille métallique pour protéger le contenu de la lumière ambiante et laisser évaporer le solvant dans un évaporateur rotatif pendant 3 h pour enlever le chloroforme, avec la pression atteint 7 kPa vide à 80 tr/min. Un film lipidique sèche se forme au fond de la fiole de verre après évaporation (Figure 2 a).
    Remarque : Scaling up plusieurs fois et en utilisant de plus grandes quantités de lipides peuvent nécessiter plus longtemps d’évaporateur rotatif afin d’assurer l’élimination complète du chloroforme.
  3. Ajouter lentement 600 µL de phosphate buffered une solution saline (PBS) tampon (pH 7,8, sans dilution) sur le dessus du film lipidique séchées. Après l’ajout de la mémoire tampon, doucement ajouter 6 µL de glycérol pour protéger l’échantillon de déshydratation complète durant les GUV-MLV formation étapes (atteindre une concentration finale de glycérol de 1 % en poids)36. Sceller le flacon en verre à l’aide de parafilm et couverture avec feuille métallique pour protéger de la lumière ambiante. Placez dans le réfrigérateur à 4 ° C durant la nuit.
    Remarque : La solution de tampon PBS comprend 0,151 g de base Trizma, 1,592 g K3PO4, 1,021 g de KH2PO4, 0,062 g MgSO4 ·7H2O et 0,0465 g d’EDTA dans 250 mL d’eau purifiée. Conserver la solution à 4 ° C et chauffer à température ambiante avant utilisation. L’équivalent d’un tampon HEPES 10 mM peut être utilisé au lieu de la solution de PBS. La solution de tampon HEPES est préparée par dilution d’une solution mère de HEPES de 1 M à l’eau purifiée.
  4. Le lendemain, laisser agir le flacon en verre contenant la solution pendant 1 min à l’aide d’un bain à ultrasons à température ambiante. Supprimer le parafilm et Pipeter jusqu'à forme une solution visuellement uniforme des vésicules lipidiques petit (Figure 2 b). Aliquote 30 µL de la solution de vésicules lipidiques petit obtenus dans des tubes en plastique de bouteille de 0,5 mL. Gardez ces stocks aliquotes à-18 ° C pendant un maximum de 6 mois.
    Remarque : Si la solution de vésicules lipidiques petit n’est pas visuellement des uniformes, des vortex la solution 4 fois pour 1-2 s à l’aide d’un agitateur Vortex à vitesse maximale.

2. préparation des Complexes GUV-MLV

  1. Décongeler à température ambiante, un tube en plastique contenant une partie aliquote de la suspension congelée de vésicules lipidiques petit. Vortex le tube 4 fois pour 1-2 s à l’aide d’un agitateur Vortex à vitesse maximale.
  2. Autour de la place 5 µL de la suspension de vésicules lipidiques petit sur la surface d’une lamelle de verre (24 x 60 mm) pour former une petite gouttelette. Utilisez une lamelle de verre sans aucune étape prénettoyage.
  3. Placer la lamelle de verre dans un dessiccateur à vide (< 100 kPa vide) pendant 20 min.
  4. Stocker le film lipidique séchés à température ambiante pendant 4 min, puis lentement distribuer 50 µL de tampon HEPES 10 mM sur le dessus du film lipidique sec pour la réhydratation. Attendre 5 min pour former des complexes GUV-MLV (Figure 2).
  5. Centrer une lamelle de verre sur la platine du microscope, puis distribuer 300 µL de tampon HEPES là-dessus et placer le centre de la goutte au-dessus de l’objectif (Figure 3 b).
  6. Transférer les 50 µL de la solution de GUV-MLV préformée dans la solution HEPES (300 µL). Attendre 25 min pour permettre à faible densité formé GUV-MLV complexes à adhérer fermement à la surface de la lamelle de verre (Figure 2D).
    Remarque : Parfois, les complexes de GUV-MLV ne font pas sur la lamelle de verre et plutôt patches lipidique ou seulement VCP est observées. Cela peut s’expliquer en secouant accidentelle de l’échantillon au cours des étapes 2.4 ou 2.6 ou de nombreux cycles de gel-dégel de la suspension de petites vésicules. Répétez les étapes 2,1 à 2,6 ou solution de réserve lipidique fraîchement préparée (étape 1.1) permet d’obtenir les complexes GUV-MLV.

3. microinjection et préparation de la micropipette

  1. Autour des bords des capillaires en verre borosilicate en plaçant doucement le tube capillaire se termine dans la flamme d’une bougie pour empêcher la rupture lorsque vous le fixez à l’exploitant une micropipette de la micropipette.
  2. Tirer au moins 3 capillaires en verre à l’aide d’un extracteur automatique laser à l’aide de l’ensemble des programmes : chaleur = 400, Fil = 4, Vel = 50, Del = 225, Pul = ; Chaleur = 400, Fil = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120. L’ensemble des programmes doit être saisi avec la première valeur de Pul laissée en blanc. À l’aide de capillaires en verre de borosilicate de diamètre intérieur (D.I.) 1,00 mm et diamètre extérieur (OD) 0,78 mm implique une micropipette avec une ouverture de pointe d’environ 0,3 µm de diamètre.
  3. Remblayer chaque micropipette avec 8 µL de 5 mM CaCl2 solution dans un tampon HEPES (10 mM) à l’aide d’un microloader. Filtrer la CaCl2 solution utilisant un 0,2 à 0,5 µm filtre de seringue avant utilisation pour éviter l’obstruction de l’embout de la pipette.
    Remarque : Assurez-vous que le CaCl2 est complètement dissous dans la solution tampon HEPES, qui est également utilisée pour des mesures 2,4 à 2,6.
  4. Se connecter à un détenteur d’une micropipette à un micromanipulateur. Montez la micropipette dans le support d’une micropipette étroitement. Branchez la pompe d’injection et capillaire titulaire en utilisant le tube d’alimentation.
  5. Démarrer la pompe d’injection. Ajuster les paramètres de la pompe d’injection à 20 hPa (pression d’injection) et mettre une pression de compensation 5 hPa, en mode automatique. La pompe d’injection une pause jusqu'à ce que la micropipette est prête pour la microinjection.
  6. Déplacez le microscope sur fond clair. Configurez-la pour contraste interférentiel différentiel (DIC). Objectifs d’utilisation 63 X ou 100 X NA élevé (1,3) pour obtenir la résolution de bord membrane optimal.
  7. Utilisez le micromanipulateur grossier pour positionner la micropipette au-dessus de la gouttelette contenant les complexes GUV-MLV. Localiser l’extrémité de la micropipette au-dessus de l’objectif.
  8. Concentrer le microscope sur le point médian du complexe GUV-MLV et recentrer alors environ 50 µm au-dessus du GUV. Utilisez le mode grossier du micromanipulateur pour mettre doucement la micropipette au point.
  9. Passez en mode fin le micromanipulateur. Recentrer lentement à la surface GUV tout en traduisant l’extrémité d’une micropipette vers le bas et en maintenant l’embout en bref. Positionner la micropipette pointe environ 20 µm de la surface GUV. Si la pointe d’une micropipette est rompue en raison d’un contact accidentel avec la lamelle de verre (par exemple dans la Figure 5 b), remplacez-le immédiatement pour éviter le relâchement d’ion calcium inutiles dans la solution d’échantillon en vrac.

4. formation et traduction de MTP à l’aide de la Source d’ions de Calcium

  1. Régler le microscope en mode de fluorescence. Définissez dichroiques pour exciter à 488 nm et de détecter l’émission à 505-550 nm.
  2. Mettre en marche la pompe d’injection et de commencer l’injection d’ion calcium. Utilisez le mode fin du micromanipulateur et approcher lentement le GUV avec la pointe d’une micropipette. Placer l’extrémité de la micropipette à une distance de 3 µm de la surface de la membrane tout en injectant la CaCl2 solution de la micropipette permettre à MTP au formulaire (Figure 4).
  3. Pour traduire la MTP le long de la surface GUV, déplacez lentement l’embout de la pipette (avec une vitesse de 0,1 et 0,3 µm/s) autour de la GUV de surface en utilisant le micromanipulateur fin (Figure 6). Maintenir environ la même distance (3 µm) entre la surface GUV et la pointe de la micropipette tout en continuant l’injection d’ion calcium.
    Remarque : À taux élevé de traduction de la pointe d’une micropipette (supérieures à 0,7 µm/s), le PSG ne migreront pas synchronisé avec une micropipette. Au lieu de cela, ils dispersent et raccourcir, tandis que le nouveau PSG se formera au nouvel emplacement de la pointe d’une micropipette (Figure 7).
  4. Pour arrêter la microinjection, éteignez la pompe d’injection et déplacer la micropipette loin de la surface GUV.

Representative Results

Dans ce travail, nous démontrons la création de complexes GUV-MLV et comment ils peuvent être utilisés pour élucider l’effet des gradients ioniques de calcium sur la membrane cellulaire dynamique. Rattaché au surface GUV-MLV complexes sont nécessaires pour ces expériences afin de permettre un imitateur de taille cellule fixe tout en établissant un gradient d’ions par microinjection. La membrane GUV répond à la concentration de calcium localisée par formation de MTP, dirigée à l’opposé de la source d’ions calcium. Par ailleurs, le PSG peut se traduire autour du GUV d’une manière sans contact en déplaçant l’extrémité d’une micropipette autour de la surface de la membrane.

Une illustration schématique de la procédure de préparation de GUV-MLV est illustrée à la Figure 2. Bien que dans le protocole présenté, les complexes de GUV-MLV sont déjà pré formées au cours de l’étape 2.4 (Figure 2), transférer la solution de la vésicule vers un autre 300 goutte µL de tampon (étape 2.6 du protocole) permet les complexes GUV-MLV peu formés à suffisamment d’adhérer au substrat de verre. De cette façon, un complexe adapté pour micromanipulation et microinjection est établi (Figure 2D). Occasionnellement, les GUVs contiennent une ou plusieurs vésicules lipidiques piégés, qui n’affectent pas la formation du PSG, comme illustré à la Figure 4 a. Ces GUVs produisent MTP ; Toutefois, l’imagerie peut être obstrué, si les vésicules piégés sont grandes. La majorité des GUVs préparés (jusqu'à 75 %) apparaissent hémisphérique et sont attachés à la VVA, comme illustré dans la Figure 1 a. Ces vésicules sont le principal objectif du présent protocole et conviennent pour la procédure de microinjection. Environ 25 % des GUVs restants apparaissent ondulante (Figure 1 b), qui témoigne d’un régime de tension de membrane inférieur. Ces vésicules ondulants permettent également à la formation des protubérances tubulaires ; Toutefois, ils présentent des cinétiques différentes et une morphologie différente de la MTP formé, qui déborde le cadre de ce protocole25. Le diamètre typique des vésicules prêts varie entre 2 à 15 µm pour le VVA et entre 2 et 40 µm pour les GUVs. L’optimale GUV taille pour l’exposition aux ions calcium est 5 µm ou plus grand.

Micropipettes ont été utilisées dans les régimes d’interrogatoire singe-cellule ainsi que dans des procédures qui nécessitent une manipulation de GUVs synthétiques pour plusieurs décennies37,38. La majorité de ces demandes en cause contact physique direct entre une micropipette et la surface des cellules ou des vésicules. Les exemples incluent la technique du patch-clamp ou extractions sangles de membrane de la membrane GUV, en plus de construire des réseaux de nanotube-vésicule23,28,39. Récemment, micropipettes ont également servis à générer des gradients localisées des ions et des molécules autour GUVs pour reconstruire les cellules hétérogènes microenvironnements24,25. Dans le protocole présenté, une micropipette fonctionne correctement (Figure 5 a) est un facteur crucial pour l’établissement d’un gradient d’ions de calcium à la surface GUV en libérant la solution contenue dans. Bon positionnement de la micropipette à la surface GUV et en évitant tout contact avec la membrane lipidique sont essentiels pour la microinjection réussie. La pointe d’une micropipette est maintenue à une distance d’environ 3 µm de la surface GUV, qui est une distance optimale pour générer des MTP tout en imitant les variations de calcium près de la membrane cellulaire. Si la pointe d’une micropipette est accidentellement cassé (Figure 5 b), un remplacement est nécessaire. La concentration précédemment testés gamme de CaCl2 à l’intérieur de la micropipette, qui permet la formation du PSG, est entre 2 et 5 mM25, ce qui correspond à des concentrations de calcium extracellulaire. À des concentrations plus faibles de2 CaCl, c'est-à-dire, 1 mM, aucune MTP n’est observés.

La formation de MTP sur la microinjection de calcium commence avec la formation d’invaginations membranaires petit, qui se développent en MTP sur le site de l’exposition (Figure 4 b). Le MTP continue de croître tant que les restes de membrane GUV exposés aux ions calcium. Ils fluctuent et diriger vers la source d’ions calcium (Figure 4, 1 de film supplémentaire). Lorsque l’alimentation en ion calcium est terminée, le scatter MTP au-dessus de la surface GUV, rendant difficile de conclure que le PSG reste ou finissent par disparaît.

La formation de MTP peut être expliquée par des ions de calcium localisée liant à l’exposé feuillet externe de la membrane GUV et déclenchement spontané courbure (m), qui sont directement associée à la formation spontanée de la tension σ = 2κm2 (Κ est la rigidité de flexion), qui induisent la flexion de la membrane et formant des MTP vers l’intérieur. Les rapports antérieurs ont démontré que la déformation de la membrane peut être expliquée par condensation et/ou regroupement des lipides chargés négativement sur la fixation des ions calcium à la membrane, ayant pour résultat négatif spontanée courbure40. Par ailleurs, la forte liaison du Ca2 + à la surface de la bicouche chargée négativement neutralise la densité de charge superficielle de la brochure de bicouche lipidique exposées. Cela conduit à la différence de densité de charge à travers la bicouche, aboutissant à la courbure spontanée non nul, suffisant pour plier la membrane25.

La formation observée de MTP démontre une sensibilité de membranes lipidiques d’ions calcium et offre une nouvelle approche sans contact pour produire des structures tubulaires de la membrane. Élucider l’origine de cette membrane tubulation peut être importante pour comprendre la dynamique de la membrane forme transition au cours de diverses fonctions cellulaires et le remodelage de la cellule et peut s’avérer utile pour obtenir un aperçu Organisation des lipides dans les cellules membranes.

Le MTP observées est toujours générés sur le site sur la membrane subissant l’exposition ion calcium. Ainsi, en choisissant l’emplacement de la pointe d’une micropipette, il est possible de définir la zone de la surface GUV pour la croissance de la saillie. Ensuite, si la micropipette est lentement (0,1 à 0,3 µm/s) s’installe autour de la surface GUV, tout en conservant la distance de séparation de la membrane, les MTP est traduits en tandem avec une micropipette. Figure 6 et la complémentaire correspondant Movie 2 démontrent ces migrations de la MTP autour de la surface GUV. Ce processus est susceptible d’être accompagné par la formation de nouveaux MTP sur continu calcium ions injection25. Aux taux de translation élevées (supérieures à 0,7 µm/s), le PSG n’est pas capables de suivre la pointe de la micropipette. Au lieu de cela, nouvelles saillies sont formés au nouvel emplacement de la pointe d’une micropipette (Figure 7).

La calcium sans contact observées guidée par ion traduction de MTP autour de la surface peut GUV plus loin notre compréhension de la conduite des forces derrière la dynamique des structures tubulaires de membrane à l’intérieur des cellules. En outre, cette approche offre un nouveau mode sans contact pour contrôler le transport du matériel dans les systèmes de la matière molle à l’aide de gradients chimiques.

Figure 1
Figure 1 : Images de microscopie fluorescente représentatif des complexes GUV-MLV immobilisés sur la surface d’une lamelle de verre. (A). exemple d’un GUV sphérique. Le GUV apparaît sous la forme d’un hémisphère, attaché à la canalisation principale. B. exemple d’une ondulante GUV. Les flèches noires indiquent les zones de déformation de la membrane. Les images sont améliorées et inversés afin d’améliorer la visualisation des membranes GUV fluorescent étiquetés. La barre d’échelle représente 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Illustrations schématiques de la préparation de GUV-MLV et les régimes de microinjection. (A). une couche lipidique sèche se forme au fond de la fiole de verre à la suite de l’évaporateur rotatif de chloroforme de la solution de lipides. B. la couche lipidique réhydraté est sonication et vésicules lipidiques petits sont forment. C. une petite goutte de la solution de la vésicule (5 µL) est placée sur la surface d’une lamelle de verre et transférée dans un dessiccateur pendant 20 min pour déshydrater la solution lipidique et former un film lipidique sec (cette étape n’est pas indiquée). Réhydratant le film lipidique sèche avec 50 µL de solution tampon produit les complexes GUV-MLV préformées. D. le transfert des complexes préformés pour une plus grande quantité de résultats de tampon dans la formation de GUV-VCP faiblement séparés attachés à la surface de la lamelle de verre. E. positionnement de la micropipette près de la surface de la GUV et libérant les ions de calcium déclenche la formation de MTP. Les illustrations ne sont pas dessinées à l’échelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Montage expérimental pour la microinjection des ions calcium. (A). les composants de l’installation expérimentale requis pour générer la MTP dans les GUVs. B. détails de la configuration de microinjection. La lamelle de verre avec la solution des complexes GUV-MLV placé sur la platine du microscope. L’angle entre une micropipette et la surface de la lamelle de verre est de 30° (marqué en blanc). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Formation de MTP sur la microinjection des ions calcium à la surface de la GUV. (A). The GUV-MLV complexe avant des exposer à un gradient d’ions calcium. La flèche indique une vésicule lipidique, pris au piège à l’intérieur de la GUV, et qui ne fait pas obstacle à l’observation de la MTP. (B). Petit MTP se forment sur la microinjection d’ions calcium (concentration de 5 mM de CaCl2 dans une micropipette). C. croissance de la MTP sur une exposition continue à des ions calcium. Les images de fluorescence sont améliorés et inversés à des fins de visualisation. La barre d’échelle représente 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Verre micropipettes utilisés pour microinjection d’ion calcium. (A). un exemple d’une micropipette fonctionnant correctement. B. un exemple d’une micropipette qui a une pointe cassée (la zone endommagée est indiquée par une flèche noire). Les deux images sont améliorées et inversés pour une meilleure visualisation. La barre d’échelle représente 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Traduction de calcium ionique-guidé de la MTP autour de la surface de la GUV. (A). les MTP sont formées à la surface GUV après microinjection de 5 mM CaCl2 solution. (B-C). Traduction de la pointe d’une micropipette (0,2 à 0,3 μm/s) autour de la membrane de surface déclenche le mouvement de la MTP en direction de la source d’ions calcium. Les flèches noires mettent en évidence le sens du mouvement une micropipette. Les images sont améliorées et inversés pour améliorer la visualisation de la membrane. La barre d’échelle représente 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : MTP au taux élevé de traduction de la pointe de la micropipette. (A). les MTP sont formées à la surface GUV sur la microinjection de 5 mM CaCl2 solution (ligne blanche). (B-C). Un taux élevé de traduction de la micropipette autour de la surface GUV (1 μm/s) entraîne la formation de nouveaux MTP au nouvel emplacement de la pointe d’une micropipette (ligne magenta), ainsi que la diffusion de la MTP précédemment formé (ligne blanche). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Movie 1
Film supplémentaire 1 : Formation de MTP en GUV sur exposition localisée à l’autorité de certification 2 + gradient. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film. 

Movie 2
Film supplémentaire 2 : Calcium ions guidée du PSG migration autour de la surface GUV.   S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film. 

Discussion

Biomimétique cellule systèmes permettent l’étude du comportement de la membrane lors de l’exposition à des stimuli externes tels que des ions, des protéines ou des nanoparticules. GUVs, étant un tel modèle, peuvent répondre aux changements dans l’environnement chimique en ajustant leur forme, ce qui implique souvent la formation de tubules des structures et des invaginations24,41,42,43 .

Cet article propose une approche visant à générer des MTP de manière sans contact via le remodelage de la surface GUV sur injection localisée des ions de calcium à la surface GUV. Le protocole décrit la préparation du complexe GUV-MLV, qui imite une membrane plasmique, ainsi que la manière d’employer une technique de microinjection pour générer le calcium gradients ioniques à proximité de la GUV de surface pour former MTP. La majorité des précédentes études expérimentales qui adressée interactions ion-membrane calcium exposés des vésicules lipidiques en bloc de calcium ion concentration14,17. Selon les conditions expérimentales, cette exposition en vrac peut entraîner une réponse différente de membrane avec aucun des protubérances tubulaire formés25.

La formation des complexes GUV-MLV est relativement simple et ne nécessite que des équipements de laboratoire standard, comme un évaporateur rotatif, cuve à ultrasons et dessiccateur à vide. Pourtant, il existe plusieurs étapes critiques à considérer lors de la préparation de la vésicule. Il est important de s’assurer que la déshydratation des vésicules est terminée (au cours de l’étape 2.3 du protocole) et un film sec de lipides circulaire contenant seulement une petite quantité de cristaux de sel se forme sur la surface de la lamelle de verre. Pendant l’expérience, attention manipulation de la solution de la vésicule, à l’aide de la solution mère de lipides fraîches dans le chloroforme, mais aussi un tampon HEPES fraîche, est essentiel pour le succès de la préparation des complexes GUV-MLV. En outre, un attachement sécurisant du complexe GUV-MLV à la surface du verre couvre-objet est crucial pour la micromanipulation et microinjection. Pour confirmer l’adhérence adéquate de la GUV-MLV complexe, une micropipette (sans débit d’injection) peut être utilisée pour pousser doucement sur la surface de GUV. Une vésicule fermement adhérée ne peut pas glisser le long de la surface au contact physique direct. Parce que les expériences sont effectuées dans une gouttelette de tampon ouvert, qui peut être interrogé pendant plusieurs heures, évaporation doit être prise en considération. L’évaporation de la gouttelette de tampon va changer les conditions osmotiques, qui pourraient affecter et déstabiliser les vésicules. Pour restaurer des conditions osmotiques, ajout périodique de l’eau pure à l’échantillon pour restaurer le volume d’origine renvoie le système à l’homéostasie.

Lorsque vous modifiez la composition lipidique de la membrane, il est crucial que les vésicules sont établis sous la forme d’un complexe de GUV-MLV parce que la canalisation principale permet de transférer le matériel de lipides à le GUV lors de la refonte de la membrane. Des études antérieures ont montré que remplacer les composants du mélange SPE avec des lipides purs, ou l’ajout de 5 à 30 % du cholestérol, permet également de GUV-MLV complexant28,44. La majorité des GUVs préparés est unilamellaires45.

En outre, lors de l’essai d’autres cations divalents, tels que les ions de magnésium, la formation de la MTP fortement dépend de la présence de DOPS chargées négativement dans le mélange de lipides. Sans DOPS, le PSG ne font pas dans les vésicules décrites dans le présent protocole. Aussi, les cations monovalents, tels que le potassium et de sodium, n’entraînent pas la formation de MTP, même dans les vésicules de DOPS contenant25.

Outre les étapes critiques en ce qui concerne la préparation et la manipulation des GUVs, il y a plusieurs facteurs importants à considérer lors de la procédure de microinjection. La microinjection réussie des ions calcium s’appuie fortement sur fonctionne correctement en verre micropipettes, qui sont préparés le jour de l’expérience. Il y a plusieurs facteurs qui pourraient causer une micropipette un dysfonctionnement. Une raison courante est une ouverture de l’extrémité obstruée. Particules lipidiques petites, qui sont des sous-produits de la préparation de la vésicule, sont dispersés dans la solution et ont tendance à adhérer à la pointe de la micropipette, générant ainsi un colmatage. Nettoyage de l’embout de la pipette est mieux fait en soulevant de la solution de la vésicule et lâchez-le retour près de la surface GUV. L’utilisation de la fonction de soufflage de la pompe de microinjection doit être évitée car elle se traduit par une injection massive d’ions calcium dans la solution en vrac. En outre, petites bulles d’air emprisonnés à l’intérieur de la micropipette empêchent microinjection appropriée, dans lequel cas la micropipette devrait être remplacé par un neuf. Bris de pointe peuvent être réduits significativement en plaçant le montage expérimental sur un tableau amortissement des vibrations pour réduire les oscillations de pointe.

En outre, les soins doivent être prises lors du choix d’un système d’observation, afin de minimiser le photoblanchiment tout en obtenant les meilleures images de résolution temporelle. La microscopie de fluorescence induite par laser de grand champ a été utilisée dans le présent protocole parce qu’il permet une fréquence d’acquisition relativement forte d’une image à une profondeur de sonde limitée objective. Par ailleurs, l’utilisation de la microscopie inversée permet la microinjection simultanée et l’observation des vésicules lipidiques et MTP.

Une des principales limites de la méthode présentée est l’exigence de beaucoup de travail manuel et de compétences suffisantes de micromanipulation. Parce que les complexes sont formés par un processus spontané de gonflement, la taille de la GUVs et VCP ne peut être contrôlée. En outre, ce protocole ne permet pas de contrôler la tension de la membrane des complexes préparés GUV-MLV, qui pourrait être nécessaire de recueillir des détails supplémentaires en ce qui concerne le remodelage de la membrane. Les GUVs sont connectés à la VCP avec le matériel de lipides fournissant ce dernier pour la croissance substantielle de la MTP dans une mesure qui seraient impossibles à réaliser en utilisant uniquement la membrane disponible à partir du GUVs. Le VCP contribue également à réduire les variations de tension de surface latérale dans le GUV-MLV complexe44, qui compliquerait les tentatives pour contrôler la tension de la vésicule à l’aide d’aspiration de la micropipette. Ce modèle de base de GUV-MLV fournit-il une tension basse qui imite mieux les régimes de tension trouvées dans les structures de la membrane cellulaire reliés aux réservoirs de membrane, comme la membrane des plis et des invaginations46. Dans le même temps, la technique d’aspiration micropipette peut être appliquée avec succès pour contrôler la tension de membrane dans GUVs unique. Par exemple, le travail de Graber et al. fourni des détails sur la formation des invaginations tubulaires de membrane dans GUVs unique lors de la liaison des ions calcium vers la membrane dans les conditions en vrac de tension divers régimes40. Enfin, la comparaison entre le comportement de la membrane à l’exposition locale et en vrac au calcium nécessite un contrôle amélioré de l’adhérence de la membrane à la surface, qui déborde le cadre du présent protocole.

Pour résumer, la technique proposée permet de remodelage de la membrane sans contact et de la formation de MTP lors d’une stimulation localisée avec les ions calcium. Applications futures de ce centre de méthode sur la traduction de systèmes synthétiques vésicule au natifs membranes biologiques, comme les bulles de la cellule. La méthode proposée peut être constituée avec les différents régimes d’interrogatoire unicellulaires, comme les patch clamp ou microélectrode ampérométrie, ou combinée avec localisée Chauffage stratégies31,47,,48. Tester l’effet des autres ions ou des molécules est simple et consiste à simplement remplacer les ions de calcium avec les molécules d’intérêt. En outre, des vésicules lipidiques synthétiques complexes peuvent être produits par le biais de fonctionnalisation de la membrane avec des protéines transmembranaires, ce qui peut élargir notre compréhension de la biophysique de la dynamique de remise en forme et de la membrane cellulaire cellule associée à la détection du local gradients chimiques. Enfin et surtout, une stimulation sans contact de la membrane lipidique peut également être traduite aux systèmes polymériques matière molle, offrant une base pour une plate-forme de nouvelle manipulation sans contact.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soy bean polar lipid extract Avanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		 541602C 100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS Avanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		 840035C 1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO-TEC (Germany) AD 488-31 1 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) Sigma Aldrich (Missouri, USA) 20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack Corning Incorporated (Corning, NY 14831) 99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer Sigma Aldrich (Missouri, USA) 650498-1L-D
Rotary evaporator Büchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm KEBO lab (Sweden) MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO Sharlau Chemie S.A. (Spain) P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% Sigma Aldrich (Missouri, USA) S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% Sigma Aldrich (Missouri, USA) G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% Sigma Aldrich (Missouri, USA) T-1503 2050 g
Trizma base Sigma Aldrich (Missouri, USA) P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) Sigma Aldrich (Missouri, USA) P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma Aldrich (Missouri, USA) 5886
MgSO4 Merck (USA) 34549-100 g
EDTA Sigma Aldrich (Missouri, USA) H0887 Sigma 
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture Sigma Aldrich (Missouri, USA) Z260282-1PAK 24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm Sigma Aldrich (Missouri, USA) 631-1339 
Menzel Gläzer #1, glass cover slip VWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccator Vacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bath Bandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixer Labnet International (USA)
488 nm laser line  Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopes Leica (Germany) 12847995 
Inverted fluorescence microscopy system  Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) Technologies GmbH (Thuringia, Germany) 300038
PatchStar Micromanipulator Scientifica (Uckfield, UK) 612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.  Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips) VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller  Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet Eppendorf (Germany)

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References

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Remodelage de membrane de vésicules géants en réponse aux Gradients d’Ion Calcium localisée
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Ali Doosti, B., Cans, A. S., Jeffries, G. D. M., Lobovkina, T. Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients. J. Vis. Exp. (137), e57789, doi:10.3791/57789 (2018).

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