אנו מציגים טכניקה עבור המיקרומניפולציה ללא מגע של שלפוחית, באמצעות מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות. Microinjection של פתרון יון סידן, באזור שלפוחית השומנים ענק, מנוצל כדי לשפץ ממברנה השומנים, וכתוצאה מכך הייצור של בליטות צינורי ממברנה.
במגוון רחב של תהליכים תא הבסיסיים, כגון סחר ממברנה אפופטוזיס, קרום התא צורה מעברים להתרחש במקביל בווריאציות מקומיות ריכוז יון הסידן. הרכיבים מולקולרית העיקריים המעורבים בתהליכים אלה זוהו; עם זאת, ספציפית יחסי הגומלין בין מעברי צבע יון סידן ליפידים בתוך קרום התא הרבה פחות ידוע, בעיקר בשל האופי המורכב של תאים ביולוגיים ואת difficultly של התבוננות ערכות. לגשר את הפער הזה, גישה סינתטית מיושם בהצלחה כדי לחשוף את ההשפעה המותאמות לשפות אחרות של יונים של סידן על קרום התא מחקה. הקמת לחקות להידמות התנאים בתוך תא היא בעיה severalfold. ראשית, מודל ביונים נאותה בממדים המתאימים והרכב ממברנה נדרש כדי ללכוד המאפיינים הפיזיים של תאים. שנית, מלכודת המיקרומניפולציה נדרש לספק כמות קטנה של יונים של סידן למיקום מסוים ממברנה. לבסוף, ערכת תצפית נדרש לשם זיהוי ורישום התגובה של קרום השומנים גירוי חיצוני. מאמר זה מציע בגישה ביונים מפורט ללמוד את האינטראקציה יון-הממברנה סידן, שבו מערכת שלפוחית השומנים, המורכב שלפוחית unilamellar ענק (בוס) מחובר של שלפוחית multilamellar (קמפנילה MLV), הוא חשוף של סידן המותאמות לשפות אחרות מעבר צבע נוצר באמצעות מערכת microinjection. הדינמיקה של ההשפעה יוניים על הקרום היו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות להקליט ולצפות במעשיהם במחירים מסגרת וידאו. בעקבות גירוי קרום, מאוד מעוקל ממברנה צינורי בליטות (MTPs) נוצר בתוך הבוס, אוריינטציה מן הקרום. הגישה המתוארת גורם שיפוץ של קרום שומנים בדם וייצור MTP בצורה לגמרי ללא מגע ומבוקר. גישה זו מציגה את האמצעים לטפל בפרטים של סידן יון-הממברנה אינטראקציות, מתן דרכים חדשות כדי לחקור את המנגנונים של עיצוב מחדש של קרום התא.
התפקיד של יוני הסידן בתוך תהליכים ביולוגיים, במיוחד מעורבותם איתות חלוקת התא, ממברנה היתוך, הוא המוקד של מחקרים מכניסטית רבים1. ריכוז יון הסידן cytoplasmic תאיים הוא גודל 100 ננומטר, תוך הסידן organelles, כגון רשתית תוך-פלזמית, שלפוחית הפרשה וכן המיטוכונדריה, להגיע עד עשרות millimolars בריכוז. פעולה זו יוצרת סידן תלול יון ריכוז הדרגתי סדרי גודל מעבר ממברנות תאיים2,3,4,5,6,7,8 ,9. הרמה יון סידן חוץ-תאי הוא בערך 2 מ מ, ומכאן, וריאציות של ריכוז יון הסידן להתרחש ברמות חוץ-תאית, תאיים בשני. יתר על כן, האחרונות מחקרים מספקים ראיות זה יון סידן תאיים איתות האירועים ועל פעילות. עצבית יכולה להתרחש בתנאים של תנודות המקומי של ריכוזים של יון סידן חוץ-תאית, המציין את החשיבות מסונכרנים אינטרה – ו וריאציות של יון סידן חוץ-תאית10.
במטרה להבין את יחסי הגומלין בין יונים של סידן מחקר ביולוגי, בגישה סינתטי שבו קרום התא יליד מוחלפים השומנים bilayer שלפוחית יושם בהצלחה. חשיפת שלפוחית לפתרונות יון סידן מובילה לשינויים קבוצות ראש השומנים, אריזה שרשרת פחמימנים, מתח הממברנה מוגברת, צבירת שלפוחית, וכן ההפרדה של ליפידים ו קרום שלב המעבר11,12 ,13,14,15,16. המאפיינים של הממברנות השומנים בתגובה לחשיפה יונים של סידן נחקרו באמצעות טכניקות נסיוני כזה כמו רנטגן, 1H-NMR, מחקרים ספקטרוסקופיות או תרמודינמי11,16, 17 , 18. במחקרים אלה, ההרכב ממברנה מכוון לעיתים קרובות להידמות יליד קרום התא ומכיל כאלה שומנים פיזיולוגיים כמו phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylserine (PS). נ. ב חשוב במיוחד כהכנה שלפוחית מלאכותי כי הוא מרכיב חיוני בתהליכים הסלולר רבים, כולל ממברנה תאיים סחר, אקסוציטוזה אפופטוזיס19,20.
לגודל ליפידים מסונתז שלפוחית נע לרוב בין ננומטר מספר מיקרומטר. בין שלפוחית שונים ההכנות, שלפוחית unilamellar ענק (כשמרוגזים), אשר הם מספר עשרות של מיקרון, יש חשיבות מיוחדת עקב גודלם גדולות יחסית, מקרוב הדומה הממדים של הפרט תאים21 , 22 , 23. האנשים שנגדם שטח זמין מאפשר את ההשפעה של מעברי צבע כימיים מקומיים על מאפייני biophysical ממברנה שילמדו. על ידי חשיפת רק חלק מן השטח ממברנה לגירויים חיצוניים, הדינמיקה קרום יכול מקרוב ייחקרו. לדוגמה, הוכח כי יישום מקומי של מעברי צבע כימית או pH השטח של האנשים שנגדם מוביל להיווצרות בליטות צינורי, אשר לא נצפו בצובר חשיפה24,25. ההבדלים שנצפו בהתנהגות ממברנה קוראים להמשך פיתוח שיטת החקירה יחיד-שלפוחית ערכות כדי לקבל כמה תובנות לגבי המנגנונים של איחוי קרום התא.
בונים על השיטות של microinjection ושל המיקרומניפולציה מ בתחילת המאה ה-2026,27, בקשר עם הפיתוחים האחרונים יותר של ערכות מניפולציה יחיד-שלפוחית ה28 של שנות האלפיים23, , מאמר זה מציג גישה בקרום אילו שיפוצים ועל היווצרות קרום צינורי בליטות (MTPs) בתוך הקרומית בוס נוצרים בתגובה יישום מקומי של יונים של סידן.
הגישה שלנו מנצל של שלפוחית מורכבים בהיקף של בוס מחובר עם שלפוחית multilamellar (קמפנילה MLV) כמו מערכת מודל ממברנה ביונים (איור 1 א’). קמפנילה MLV נדרש כמו מאגר השומנים למתחם לספק חומר השומנים הבוס במהלך חשיפה הדרגתי יון סידן. חיבור זה מאפשר המתחם לפצות על עליית מתח הממברנה במהלך שיפוץ המושרה ואת הצורה משתנה של קרום בוס ולספק ליפידים לצמיחה MTP. יתר על כן, קמפנילה MLV מקלה את הנייח משטח כי המאסה שלו הוא גדול יותר בהשוואה לזו של הבוס. מתחמי בוס-קמפנילה MLV, כאשר ותשמרו על גבי מצע מוצק, שימשו בעבר בייצור רשתות nanotube-שלפוחית, לומד פולימר-הממברנה האינטראקציה של מחקה את שלבי אקסוציטוזה29,30, מאוחר 31,32,33.
הפרוטוקולים הקודמים מנוצל תמצית ליפידים קוטביים סויה (SPE) להכין בוס-קמפנילה MLV מתחמי28. המהירות של הכדור הלבן מכיל תערובת של פוספוליפידים הכוללים PC (45.7%), PE (22.1%), phosphatidylinositol (PI, 18.4%), חומצה phosphatidic (PA, כ- 6.9%), תערובת של ליפידים אחרים (6.9%). בהפרוטוקול שלנו בזאת התערובת SPE הוא מסטול עם 20% של 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (מלח נתרן) (DOPS) כדי לחקות את העלון הפנימי של קרום פלזמה התא. 1% נוספים של אטו 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-סמים) משמש כדי להכתים את ליפידית כדי לאפשר פיקוח על שיפוץ ממברנה בעזרת מיקרוסקופ זריחה. האנשים שנגדם יש הרכב השומנים סימטרי לרוחב bilayer, נחשפים באופן מקומי 5 מ מ ריכוזי סידן כלורי (2CaCl). תנאים ניסיוני, עם ריכוז יונים סידן גבוהות, גם לחקות את העלון הממברנה החיצונית של מוות תאים, איפה מולקולות PS ביטוי34. היווצרות מתחמי בוס-קמפנילה MLV מחייב השימוש בשיטה שונה התייבשות-התייבשות שפותחה לראשונה על ידי קריאדו וקלר35. פרוטוקול הכנה שלפוחית כולל היווצרות שכבה יבשה השומנים, בו הוא משתמש כדי ליצור שלפוחית קטנה בפתרון. פתרון זה הוא לאחר מכן מיובש, ולמיומנות כדי ליצור את מתחמי בוס-קמפנילה MLV הסופי. איור 2A -D ממחיש את הפעולות הראשי עבור הכנת מתחם בוס-קמפנילה MLV טיפוסי.
לאחר השלמת הכנת שלפוחית שלפוחית מורכבים. הוא מרותק למיטה על המצע זכוכית, הטכניקה microinjection משמש כדי לספק כמויות קטנות של יונים של סידן העלעל החיצוני של הבוס דרך micropipette זכוכית פתוח-טיפ. הזרימה של תמיסת סידן הטיפ יוצר הדרגתי יון סידן מקומי על פני הממברנה בוס, המוביל אל קרום ואבו מהדור MTPs. MTPs הם שכיוונו הרחק מהמקור יון סידן ולגדול בתוך הבוס. המשקע MTP ניתן ישירות לנטר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות והקליט באמצעות מצלמה דיגיטלית. איור 3 מראה את הגדרת הניסוי נעשה שימוש לצורך ייצור את קרום הבנייה מחדש. היווצרות MTPs (2E איור , איור 4) ב פרוטוקול זה מדגים תוצאה מנוגדים ניסויים חשיפה של יון סידן לבצע בתנאי אחסון בצובר. בתנאים בתפזורת, האנשים שנגדם לקרע ויוצרים כתמים קרום כי יכול להיות שנצפו לדבוק משטח זכוכית25.
עוד פרטים על היווצרות את מתחמי בוס-קמפנילה MLV, כמו גם את ההליך כדי לבצע את microinjection של יוני סידן, מוסברים במאמר זה. הפרוטוקולים הם התמקדו בעיקר microinjection יון סידן; עם זאת, ניתן לשנות גישה זו בקלות לשימוש ללמוד את התגובות ממברנה עקב חשיפה מקומית יונים או חלבונים אחרים. בנוסף, ניתן לכוונן את ההרכב של השלפוחיות המוגלתיות כדי לבודד את התפקידים רכיב השומנים בתהליך שיפוץ ממברנה. פרוטוקול שהוצגו אינו דורש שום ציוד מתוחכם כדי לייצר את מתחמי בוס-קמפנילה MLV, מאופיין על ידי רמה גבוהה של הפארמצבטית.
מערכות תאים ביונים מאפשרות לחקר התנהגות קרום על החשיפה לגירויים חיצוניים כמו יונים, חלבונים או חלקיקים. בסדר, פרנקי, כזה דוגמנית יכול להגיב על שינויים בסביבה כימית על-ידי התאמת הצורה שלהם, אשר כרוך לעתים קרובות היווצרות של הכרישים מבנים, invaginations24,41,42,43 .
מאמר זה מציע גישה ליצירת MTPs באופן ללא מגע באמצעות עיצוב מחדש של המשטח בוס על הזרקת המותאמות לשפות אחרות של יוני סידן על פני גב. הפרוטוקול מתאר את הכנת המתחם בוס-קמפנילה MLV, אשר מחקה פלזמה קרום התא, כמו גם איך להעסיק טכניקה microinjection ליצירת סידן מעברי צבע יון קרוב הבוס לפני השטח לטופס MTPs. הרוב המכריע של מחקרים קודמים ניסיוני ממוען סידן יון-הממברנה אינטראקציות חשוף השומנים שלפוחית בכמות גדולה14,ריכוז יון הסידן17. בהתאם לתנאי הניסוי, חשיפה בכמות גדולה עלול לגרום לתגובה ממברנה שונים אין בליטות צינורי נוצרו25.
היווצרות מתחמי בוס-קמפנילה MLV פשוטה למדי ודורש רק ציוד מעבדה סטנדרטיים, כגון המאדה, באמבט אולטרא, desiccator ואקום. עדיין, ישנם מספר שלבים קריטיים לשקול במהלך הכנת שלפוחית. חשוב להבטיח התייבשות של השלפוחיות המוגלתיות הושלם (במהלך שלב 2.3 לפרוטוקול) סרט יבש השומנים מעגלית המכיל רק כמות קטנה של גבישי מלח נוצרת על פני השטח של תגית כיסוי זכוכית. במהלך הניסוי, זהיר של הפתרון שלפוחית, באמצעות פתרון מניות השומנים טריים כלורופורם, כמו גם מאגר HEPES טריים, חיוני עבור הכנת מתחמי בוס-קמפנילה MLV מוצלחת. יתרה מכך, מצורף מאובטח של המתחם בוס-קמפנילה MLV השטח מכסה זכוכית חיונית המיקרומניפולציה ו- microinjection. כדי לוודא היצמדות נאותה הבוס-קמפנילה MLV מורכבים, micropipette (ללא הזרקת flow) ניתן לדחוף בעדינות כנגד פני השטח בוס. שלפוחית מודבקת בחוזקה לא תחליק על פני בעת מגע פיזי ישיר. בגלל הניסויים מבוצעות ב- droplet המאגר פתוח, אשר עשוי להיות נחקר במשך מספר שעות, אידוי חייב להילקח בחשבון. התאדות מפני ה-droplet מאגר תשנה את התנאים osmotic, אשר יכול להשפיע על יציבות השלפוחיות המוגלתיות. כדי לשחזר את התנאים osmotic, הוספת כתב-העת טהור מים לדוגמה כדי לשחזר את אמצעי האחסון המקורי חוזר המערכת הומאוסטזיס.
בעת שינוי בהרכב הממברנה השומנים, חשוב כי השלפוחיות המוגלתיות מיוצרים בצורה של מתחם בוס-קמפנילה MLV כי קמפנילה MLV מאפשר העברת החומר השומנים הבוס במהלך, ממברנה העיצוב מחדש. מחקרים קודמים הראו כי החלפת הרכיבים של התערובת SPE ליפידים טהור, או הוספת 5-30% של כולסטרול, מאפשר גם בוס-קמפנילה MLV היווצרות מורכבות28,44. הרוב המכריע של האנשים שנגדם מוכן הם unilamellar45.
יתר על כן, כאשר בדיקות אחרות קטיונים דו ערכיים, כגון יוני מגנזיום, היווצרות MTPs בכבדות תלויה הנוכחות של DOPS טעונים שלילית בתערובת השומנים. בלי DOPS, MTPs בצורה לא השלפוחיות המוגלתיות שמתואר פרוטוקול זה. כמו כן, קטיונים monovalent, כגון אשלגן, נתרן, התוצאה אינה היווצרות MTPs, אפילו בתוך שלפוחית המכילה DOPS25.
בנוסף לשלבים הקריטיים לגבי הכנה ומניפולציה של האנשים שנגדם, ישנם מספר גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון במהלך ההליך microinjection. Microinjection מוצלח יוני הסידן בכבדות מסתמך על מתפקד כראוי זכוכית micropipettes, אשר מוכנים ביום של הניסוי. ישנם מספר גורמים שעלולים לגרום את micropipette לכשלים. סיבה נפוצה היא פתיחה עצה סתומות. חלקיקים קטנים השומנים, שהם תוצרי לוואי של הכנת שלפוחית, מפוזרים בפתרון, נוטים לדבוק הטיפ micropipette, ובכך יוצר של סתימת. ניקוי הטיפ פיפטה נעשית ע י מרימים אותו מהפתרון שלפוחית והצבתו בחזרה קרוב לפני השטח בוס. השימוש בפונקציה מכריע של המשאבה microinjection יש להמנע כי התוצאה היא הזרקת מסיבית של יוני הסידן בתוך תמיסת בצובר. יתר על כן, בועות אוויר קטנות לכודים בפנים micropipette למנוע microinjection הנכון, שבו במקרה micropipette צריך להיות מוחלף עם אחד חדש. עצה שבירה ניתן למזער באופן משמעותי על-ידי הצבת את הגדרת הניסוי על שולחן כדי למזער את הטיפ תנודות רטט וגלים.
יתר על כן, הטיפול צריך להילקח בעת בחירת לסכימת תצפית, כדי למזער את photobleaching בזמן קבלת את התמונות הטובות ביותר זמן לפתור. מיקרוסקופיית שדה רחב לייזר המושרה פלורסצנטיות היה מנוצל פרוטוקול זה כי זה מאפשר קצב רכישת תמונה גבוהה יחסית בעומק בדיקה אובייקטיבית מוגבלת. יתר על כן, השימוש במיקרוסקופ הפוכה מאפשר microinjection בו זמנית והתבוננות של השומנים שלפוחית, MTPs.
אחת המגבלות העיקריות של השיטה הציג היא הדרישה של עבודה ידנית נרחב ומיומנויות המיקרומניפולציה מספיקות. כי מתחמי נוצרות בתהליך נפיחות ספונטנית, שלא ניתן לשלוט בגודל של האנשים שנגדם ו- MLVs. בנוסף, פרוטוקול זה אינו מאפשר לשליטה של המתח ממברנה של מתחמי בוס-קמפנילה MLV מוכן, אשר עשוי להיות נחוץ לאסוף פרטים נוספים לגבי קרום שיפוץ. האנשים שנגדם אתה מחובר MLVs החומר האחרון השומנים המספקת לצמיחה משמעותית של MTPs במידה זה יהיה בלתי אפשרי להשיג אך ורק ניצול זמין החל האנשים שנגדם הקרום. MLVs גם לתרום להורדת כל הווריאציות לרוחב מתח בתוך בוס-קמפנילה MLV מורכבים44, אשר מסבך את הניסיונות כדי לשלוט המתח של שלפוחית באמצעות שאיפה micropipette. מודל זה מבוסס על בוס-קמפנילה MLV לספק מתח נמוך המחקה כדאי המשטרים המתח נמצאו במבנים הממברנה התאית מחובר ממברנה מאגרים, כמו קרום הקפלים ואת invaginations46. במקביל, הטכניקה השאיפה micropipette ניתן להחיל בהצלחה כדי לשלוט מתח הממברנה כשמרוגזים יחיד. לדוגמה, עבודה מאת גרבר. ואח מסופקים פרטים על היווצרות קרום invaginations צינורי ב כשמרוגזים יחיד על איגוד יוני הסידן הקרום-תנאים בכמות גדולה מן המתח מגוון משטרים40. לבסוף, השוואת התנהגות ממברנה-חשיפה מקומיים והן בתפזורת סידן מחייב שליטה משופרת של הדבקה קרום על פני השטח, אשר מעבר להיקף של פרוטוקול זה.
לסיכום, הטכניקה המוצע מאפשר ממברנה ללא מגע שיפוצים ועל היווצרות MTPs על גירוי מקומי עם יונים של סידן. יישומים עתידיים של מרכז זה שיטה על תרגום ממערכות שלפוחית סינתטי מחקר ביולוגי מקורי, כגון תאים מגדלים פורחים. יכול להיות משולב עם ערכות תא בודד חקירה אחרים, כגון תיקון-קלאמפ או microelectrode amperometry, או בשילוב עם השיטה המוצעת מקומי חימום אסטרטגיות31,47,48. בוחן את ההשפעה של יונים או מולקולות אחרות היא פשוטה וכרוכה פשוט החלפת היונים של סידן עם המולקולות של עניין. יתר על כן, יכול להיות מיוצר השומנים סינתטיים מורכבים שלפוחית דרך הממברנה functionalization עם חלבונים transmembrane, אשר עשוי להרחיב את ההבנה שלנו ביופיזיקה של התא לעיצוב מחדש של קרום התא דינמיקה המשויך חישה של המקומיים מעברי צבע כימי. ואחרון אחרון חביב, גם יכול להיות מתורגם ללא מגע גירוי של קרום השומנים למערכות פולימריות חומר רך, המציע בסיס פלטפורמה הרומן מניפולציה ללא מגע.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |