Vi presenterer en teknikk for kontaktløse micromanipulation av blemmer, bruker lokaliserte kalsium ion graderinger. Microinjection av en kalsium ion løsning, i en gigantisk lipid vesicle, benyttes til oppussing lipid membran, som resulterer i produksjon av membran rørformede utstikkende deler.
I en rekke grunnleggende celleprosesser, som membran smugling og apoptose, skjer cellemembranen figur overganger samtidig med lokale variasjoner i kalsium konsentrasjon. Molekylær hovedkomponentene i prosessen har blitt identifisert; imidlertid bestemte samspillet mellom kalsium ion graderinger og lipider inni cellen membranen er langt mindre kjent, hovedsakelig på grunn av den komplekse naturen av biologiske celler og vanskelig av observasjon ordninger. For å oppnå dette, er en syntetisk tilnærming implementert for å avdekke lokaliserte effekten av kalsiumioner på cellemembranen imiterer. Etablere en etterligne slik forholdene i en celle er et severalfold problem. Først er en tilstrekkelig biomimetic modell med aktuelle dimensjoner og membran sammensetning nødvendig for å fange de fysiske egenskapene til cellene. Andre er en micromanipulation oppsett nødvendig for å levere en liten mengde kalsiumioner til en bestemt membran plassering. Endelig er en observasjon plan nødvendig å oppdage og registrere svaret av lipid membranen eksterne stimulering. Denne artikkelen inneholder en detaljert biomimetic tilnærming for å studere kalsium ion-membran samhandling, hvor en lipid vesicle system, bestående av en gigantisk unilamellar vesicle (GUV) koblet til en multilamellar vesicle (MLV), utsettes for en lokalisert kalsium Gradert dannet ved å bruke en microinjection. Dynamikken i ioniske påvirker membranen ble observert bruker fluorescens mikroskopi og innspilt på video bildefrekvens. Som følge av membran stimulering, buet sterkt membran rørformede utstikkende deler (MTPs) dannet inne GUV, orientert fra membranen. Beskrevet tilnærming induserer remodeling av lipid membran og MTP produksjonen på en helt kontaktløse og kontrollert måte. Denne tilnærmingen introduserer å ta detaljene av kalsium ion-membran samspill, gir nye muligheter for å studere mekanismer cellemembranen omforming.
Rollen av kalsiumioner i biologiske prosesser, spesielt deres engasjement i signalering, celledeling og membran fusion, er fokus for mange mekanistisk studier1. Intracellulær cytoplasmatiske kalsium ion konsentrasjonen er på 100 nM, mens kalsium i organeller, som endoplasmatiske retikulum, sekretoriske blemmer og mitokondrier, nå nivåer i titalls millimolars i konsentrasjon. Dette skaper bratt kalsium ion konsentrasjon gradient størrelsesordener over intracellulær membraner2,3,4,5,6,7,8 ,9. Derfor variasjonene av kalsium konsentrasjon forekommer på både de ekstracellulære og intracellulær ekstracellulære kalsium ion nivået er rundt 2 mM. Videre synkronisert nyere studier beviser at intracellulær kalsium ion signalisering hendelser og neuronal aktivitet kan inntreffe under vilkår av lokale svingninger av ekstracellulære kalsium ion konsentrasjoner, indikerer viktigheten av intra- og ekstracellulære kalsium ion variasjoner10.
Å forstå samspillet mellom kalsiumioner og biologiske membraner, en syntetisk tilnærming som innfødt cellemembraner erstattes med lipid bilayer blemmer har blitt implementert. Utsette blemmer kalsium ion løsninger fører til endringer i lipid hodet grupper og hydrokarbon kjeden pakking, økt membran spenning, og vesicle aggregering, samt segregering av lipider og membran fase overgang11,12 ,13,14,15,16. Egenskapene for lipid membraner ved eksponering til kalsiumioner har blitt undersøkt med eksperimentelle teknikker som X-ray og 1H-NMR spektroskopiske eller termodynamisk studier11,16, 17 , 18. i disse studiene, membran sammensetningen er ofte innstilt slik innfødt cellemembraner og inneholder slike fysiologiske lipider phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) og fosfatidylserin (PS). PS er spesielt viktig i kunstig vesicle forberedelse fordi det er en vesentlig komponent i mange mobilnettet prosesser inkludert intracellulær membran smugling, exocytosis og apoptose19,20.
Størrelsen på syntetiserte lipid blemmer ofte varierer fra nanometer til flere mikrometer. Blant annet vesicle preparater, gigantiske unilamellar blemmer (GUVs), som er flere titalls mikrometer i diameter, er spesielt viktig på grunn av deres relativt store størrelsen, ligner dimensjonene av enkelte celler21 , 22 , 23. tilgjengelig areal på GUVs gjør effekten av lokale kjemiske graderinger på membran Biofysiske egenskaper studier. Ved å utsette bare en del av membran overflaten til eksterne stimuli, kan membran dynamikken bli mer nøye undersøkt. For eksempel har det vært vist at lokaliserte anvendelse av kjemiske eller pH graderinger på overflaten av GUVs fører til dannelse av rørformede utstikkende deler som ikke ble det observert bulk eksponering24,25. Observerte forskjeller i membranen atferd ringe for metoden videreutvikling av enkelt-vesicle avhør ordninger for å få noen innsikt i mekanismer av cellemembranen remodeling.
Bygge på metoder for microinjection og micromanipulation fra det tidlige 1900-tallet26,27, i forbindelse med nyere fremskritt av enkelt-vesicle manipulasjon ordninger fra 2000-tallet23,28 , denne artikkelen presenterer en tilnærming i som membran remodeling og dannelsen av membran rørformede utstikkende deler (MTPs) i GUV membranen genereres svar på lokal anvendelse av kalsiumioner.
Vår tilnærming benytter en vesicle består av en GUV koblet til en multilamellar vesicle (MLV) som biomimetic membran modellsystem (figur 1A). MLV kreves som et lipid reservoar for komplisert å levere lipid materiale til GUV ved eksponering for kalsium ion gradering. Denne tilkoblingen kan komplisert å kompensere for økningen i membranen spenningen under indusert remodeling og forme overgangen av GUV membranen og gi lipider for MTP. Videre MLV forenkler overflaten immobilisering fordi den er større sammenlignet med GUV. GUV-MLV komplekser, når immobilisert på en solid underlaget, har tidligere blitt brukt for produsere nanotube-vesicle nettverk, studere polymer-membran samhandling og etterligne på slutten stadier av exocytosis29,30, 31,32,33.
Tidligere protokoller brukes soyabønner polar lipid ekstrakt (SPE) å forberede GUV-MLV komplekser28. SPE består av en blanding av fosfolipider som inkluderer PC (45,7%), PE (22.1%), phosphatidylinositol (PI, 18.4%), phosphatidic syre (PA, 6,9%) og en blanding av andre lipider (6,9%). I vår protokollen heri, SPE blandingen er dopet med 20% av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (natrium salt) (DOPS) å etterligne indre heftet av plasma cellemembranen. En ytterligere 1% av ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) brukes stain lipid-bilayer for å aktivere overvåking av membran remodeling bruker fluorescens mikroskopi. GUVs har symmetrisk lipid sammensetning over bilayer og utsettes lokalt for 5 mM konsentrasjoner av veisalt (CaCl2). Slike eksperimentelle forhold, med en forhøyet kalsium konsentrasjon, etterligne også ytre membran heftet av apoptotisk celler, hvor PS molekylene er uttrykt34. Dannelsen av GUV-MLV komplekser krever bruk av en modifisert rehydrering-dehydrering metode opprinnelig utviklet av Criado og Keller35. Vesicle forberedelse protokollen inneholder dannelsen av en tørr lipid lag, som deretter brukes til små blemmer i løsningen. Denne løsningen er så dehydrert og utvannet for å danne siste GUV-MLV komplekser. Figur 2A -D illustrerer de viktigste trinnene for utarbeidelse av en typisk GUV-MLV kompleks.
Etter vesicle forberedelsen er fullført og danner komplekse er immobilized på glass underlaget, brukes microinjection teknikken til å levere små mengder kalsiumioner til ytre heftet av GUV gjennom et åpent tips glass brønnene. Flyten av kalsium løsning av spissen genererer en lokalisert kalsium ion gradient på GUV membran overflaten, fører til membran remodeling og generering av MTPs. MTPs er orientert fra kalsium ion kilden og vokser inne GUV. Denne MTP-formasjonen kan overvåkes direkte bruke fluorescens mikroskopi og registrert bruker et digitalt kamera. Figur 3 viser eksperimentelle oppsettet brukes til å produsere membran remodeling. Dannelsen av MTPs (figur 2E og Figur 4) i denne protokollen demonstrerer et kontrasterende resultat til kalsium ion eksponering eksperimenter utført i bulk volumer. Under bulk forhold, GUVs brudd og danne membran oppdateringer som kan observeres for å overholde glass overflaten25.
Mer informasjon om dannelsen av GUV-MLV komplekser, samt prosedyren for å utføre microinjection av kalsiumioner, er beskrevet i denne artikkelen. Protokollene er hovedsakelig fokusert på kalsium ion microinjection; men kan denne tilnærmingen enkelt endres for bruk i å studere membran svarene på grunn av lokale eksponering til andre ioner eller proteiner. I tillegg stilles sammensetningen av blemmer for å isolere lipid komponent rollene under membranen remodeling. Presentert protokollen krever ikke noe avansert utstyr å produsere GUV-MLV komplekser og er preget av en høy grad av reproduserbarhet.
BioMimetic celle systemer tillater for studier av membran oppførsel etter eksponering for eksterne stimuli som ioner, proteiner eller nanopartikler. GUVs, blir slik modell, kan svare på endringer i kjemiske miljøet ved å justere formen, som ofte innebærer dannelsen av rørformede strukturer og invaginations24,41,42,43 .
Denne artikkelen inneholder en tilnærming for å generere MTPs på en kontaktløse måte via ombygging av GUV overflaten på lokaliserte injeksjon av kalsiumioner på GUV overflaten. Protokollen beskriver utarbeidelse av GUV-MLV komplekset, som etterligner en celle plasma membran, samt hvordan for å ansette en microinjection teknikk for å generere kalsium ion graderinger nær GUV overflaten skjemaet MTPs. Flertallet av tidligere eksperimentelle studier som adressert kalsium ion-membran interaksjoner utsatt lipid blemmer til bulk kalsium ion konsentrasjon14,17. Avhengig av eksperimentelle forhold, kan slik bulk eksponering resultere i forskjellige membran svar med ingen rørformede utstikkende deler dannet25.
Dannelsen av GUV-MLV komplekser er ganske grei og krever bare standard laboratorieutstyr og som roterende fordamperen, ultralydbad og vakuum desiccator. Likevel er det flere viktige tiltak for å vurdere under vesicle utarbeidelsen. Det er viktig å sikre at dehydrering av blemmer er fullført (under trinn 2.3 protokollen) og en tørr sirkulær lipid film som inneholder bare en liten mengde salt krystaller dannes på overflaten av glass cover slip. Under eksperimentet, forsiktig håndtering av vesicle løsningen, bruke fersk lipid lagerløsning kloroform samt fersk HEPES buffer, er avgjørende for vellykket utarbeidelse av GUV-MLV komplekser. Videre er sikkert feste GUV-MLV komplekset til glass cover slip overflaten avgjørende for micromanipulation og microinjection. For å bekrefte tilstrekkelig vedheft av GUV-MLV komplekse, brønnene (uten injeksjon flow) kan brukes Skyv mot GUV overflaten. En fast adhered vesicle vil ikke Skyv langs overflaten på direkte fysisk kontakt. Fordi eksperimenter utføres i en åpen buffer dråpe, som kan bli avhørt i flere timer, må fordampning tas i betraktning. Fordampning fra bufferen slippverktøyet endres de osmotisk forholdene som kan påvirke og destabilisere blemmer. For å gjenopprette osmotisk forhold, returnerer periodisk tillegg rent vann å prøve å gjenopprette opprinnelige volumet systemet å homeostase.
Når du endrer lipid membran sammensetningen, er det avgjørende at blemmer produseres i form av et GUV-MLV kompleks fordi MLV tillater overføring lipid materialet til GUV under membranen gjenreisningen. Tidligere studier har vist at erstatte komponentene av SPE blandingen med ren lipider eller legge til 5-30% av kolesterol, også tillater GUV-MLV komplekse formasjon28,44. Fleste av de forberedt GUVs er unilamellar45.
Videre når testing andre divalent kasjoner, som magnesium ioner, avhengig dannelsen av MTPs tungt av tilstedeværelsen av negativt ladde DOPS i lipid blandingen. Uten DOPS form MTPs ikke i blemmer beskrevet i denne protokollen. Også resultere monovalent kasjoner, som kalium og natrium, ikke i dannelsen av MTPs, selv i DOPS inneholder blemmer25.
I tillegg til kritiske trinnene forberedelse og manipulering av GUVs er det flere viktige faktorer å vurdere under microinjection prosedyren. Den vellykkede microinjection av kalsiumioner er sterkt avhengig av godt fungerende glass Mikropipetter, som tilberedes på dagen for eksperimentet. Det er flere faktorer som kan forårsake brønnene funksjonsfeil. En felles grunn er en tett tips åpning. Liten lipid partikler, som er biprodukter av vesicle utarbeidelse, spres i løsningen og overholder brønnene spissen, og dermed generere en tilstopping. Rengjøring pipette spissen er best gjøres ved å løfte den fra vesicle løsningen og plassere den tilbake nær GUV overflaten. Bruken av funksjonen blåse ut av microinjection pumpen må unngås fordi det resulterer i enorme injeksjon av kalsiumioner i bulk løsning. Videre, bobler lite luft fanget inne i brønnene hindre riktig microinjection, der tilfelle av brønnene skal erstattes med en ny. Tips brudd kan reduseres betydelig ved å plassere eksperimentelle oppsettet på en vibrasjon harddiskspor tabell å minimere tips svingninger.
Videre må omsorg tas når du velger en observasjon ordningen, minimere photobleaching mens å skaffe de beste tid-løst bildene. Wide-field laser-indusert fluorescens mikroskopi ble benyttet i denne protokollen fordi det gir en relativt høy oppkjøpet hastighet på en objektiv begrenset sonde dybde. Videre gir bruk av invertert mikroskopi samtidig microinjection og observasjon av lipid blemmer og MTPs.
En av de viktigste begrensningene av metoden presentert er behovet av omfattende manuelt arbeid og tilstrekkelig micromanipulation ferdigheter. Fordi komplekser dannes gjennom en spontan hevelse, ikke kan størrelsen på GUVs og MLVs kontrolleres. I tillegg tillater ikke denne protokollen for kontroll av membran spenningen i forberedt GUV-MLV komplekser, som kan være nødvendig å samle ytterligere informasjon med hensyn til membran remodeling. GUVs er koblet til MLVs med sistnevnte leverer lipid materialet for betydelig vekst i MTPs i et omfang som ville være umulig å oppnå utelukkende bruker membranen tilgjengelig fra GUVs. MLVs også bidra til å senke alle lateral overflatespenning varianter i den GUV-MLV komplekse44, som vil komplisere forsøkene på å kontrollere spenningen av vesicle ved hjelp av brønnene aspirasjon. Denne GUV-MLV-baserte modellen gir en lavere spenning som etterligner bedre spenning regimer i mobilnettet membran strukturer koblet til membran reservoarer som membran folder og invaginations46. Samtidig, kan brønnene aspirasjon teknikken kunne brukes for å kontrollere membran spenning i én GUVs. For eksempel gitt arbeidet Graber et al. detaljer av membran rørformede invaginations i ett GUVs ved binding av kalsiumioner til membranen på bulk forhold variert spenning regimer40. Til slutt, sammenligning av membran virkemåten på både lokale og bulk eksponering for kalsium krever forbedret kontroll av membran vedheft til overflaten, som er utenfor omfanget av denne protokollen.
For å oppsummere, muliggjør foreslåtte teknikken kontaktløse membran remodeling og dannelsen av MTPs på lokaliserte stimulering med kalsiumioner. Fremtidige anvendelser av denne metoden center på oversettelsen fra syntetiske vesicle systemer til innfødte biologiske membraner, for eksempel celle blebs. Den foreslåtte metoden kan innlemmet med andre encellede avhør ordninger, som patch-klemme eller microelectrode amperometry, eller kombinert med lokalisert varme strategier31,47,48. Teste effekten av andre ioner og molekyler er grei og innebærer å erstatte de kalsium ionene med molekyler av interesse. Videre kan komplekse syntetiske lipid blemmer produseres gjennom membranen functionalization med transmembrane proteiner, som kan utvide vår forståelse av biofysikk av cellen omforme og cellemembranen dynamikken knyttet sensing av lokale kjemisk graderinger. Sist men ikke minst, kontaktløse stimulering av lipid membran kan også oversettes til polymere myk saken systemer, tilbyr et grunnlag for en roman kontaktløse manipulasjon plattform.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |