Fonctionnalités de bêta-cellules sont importante pour l’homéostasie du glucose dans le sang, qui est évalué à cellule unique résolution utilisant un journaliste génétiquement codé pour l’influx de calcium.
Cellules bêta-pancréatiques répondent aux concentrations croissantes de glucose sanguin en sécrétant de l’insuline, une hormone. La dysfonction des cellules bêta entraîne une hyperglycémie et des conséquences graves, mortelles. Comprendre comment les cellules bêta fonctionnent dans des conditions physiologiques et quels sont les facteurs génétiques et environnementaux pourraient provoquer leur dysfonctionnement pourrait conduire à meilleures options de traitement pour les patients diabétiques. La capacité à mesurer les niveaux de calcium dans les cellules bêta sert comme un indicateur important de la fonction des cellules bêta, comme l’afflux de calcium ions déclencheurs libération d’insuline. Nous décrivons ici un protocole pour la surveillance de l’influx de calcium stimulée par le glucose dans les cellules bêta-poisson-zèbre à l’aide de GCaMP6s, un capteur codé génétiquement de calcium. La méthode permet la surveillance de la dynamique de calcium intracellulaire avec résolution unicellulaire dans les îlots ex vivo monté. La glucose-réactivité des cellules bêta dans le même îlot peut être capturée simultanément sous différentes glycémies, qui suggère la présence d’hétérogénéité fonctionnelle entre cellules bêta-poisson-zèbre. En outre, la technique offre haute résolution temporelle et spatiale, qui révèle la nature oscillatoire de l’influx de calcium lors de la stimulation de la glycémie. Notre approche vous ouvre les portes pour utiliser le poisson-zèbre comme modèle pour étudier la contribution des facteurs génétiques et environnementaux à la fonction des cellules bêta et dysfonctionnement.
Notre glycémie est maintenue dans une fourchette étroite, en grande partie grâce à la fonction du pancréas endocrine. Le rôle endocrine du pancréas est interprété par les îlots de Langerhans, qui contiennent des cellules sécrétant des hormones. Les bêta-cellules insulino-sécrétrices sont responsables de la réduction des niveaux de glycémie après un repas contenant des glucides. Diabète1, qui se caractérise par une glycémie élevée soutenue peut provoquer la sécrétion d’insuline insuffisante de cellules bêta. Type 1 et diabète de Type 2, qui ravagent actuellement déjà plus de 400 millions de personnes dans le monde, mène à la morbidité et la mortalité2. En examinant les facteurs moléculaires et environnementaux qui contribuent à la dysfonction des cellules bêta, nous comprendrons mieux comment le diabète de type 2 commence et progresse. En outre, la capacité de différencier les cellules souches humaines en cellules bêta fonctionnelle in vitro peut fournir une source de nouvelles cellules bêta pour les thérapies de remplacement cellulaire dans le diabète de Type 1. À cette fin, il est important d’étudier la fonction des cellules bêta et maturation en organismes modèles génétiques afin d’acquérir les connaissances nécessaires pour faire des bêta-cellules fonctionnelles dans un plat.
Fonctionnalités de bêta-cellules peuvent être surveillée au niveau de l’ensemble-îlot en quantifiant le montant total de l’insuline sécrétée en réponse à la stimulation de la glycémie. Cette approche cumulative étudie l’îlot comme un seul groupe de cellules sans différencier les propriétés individuelles d’une cellule. Cependant, l’analyse de la réponse glycémique de bêta-cellules individuelles ont révélé une diversité dans les propriétés fonctionnelles des cellules bêta et la présence d’hétérogénéité3. Pour évaluer la fonction des cellules bêta individuelles, il est possible de surveiller les changements intracellulaires qui mènent à la sécrétion de l’insuline4. La sécrétion d’insuline est précédée par une entrée du glucose dans les cellules bêta. Le glucose qui pénètre dans les cellules bêta est rapidement métabolisé à l’ATP. Des concentrations plus élevées d’ATP intracellulaires diminuent la probabilité d’ouverture des canaux d’ion potassium ATP-sensibles conduisant à une dépolarisation des cellules bêta. Dépolarisation ouvre les canaux d’ion calcium sensibles à la tension et augmente le calcium intracellulaire. À son tour, calcium déclenche l’exocytose de l’insuline, qui est libérée dans la circulation et diminue la glycémie en favorisant l’utilisation du glucose5,6,7.
Plusieurs stratégies ont été appliquées pour étudier la fonction des cellules bêta, y compris la surveillance du potentiel de membrane8, visualisation directe de l’insuline-vésicules d’exocytose9et la quantification des intracellulaire Ca2 + afflux comme indicateur de glycémie-réactivité10. Parmi eux, l’imagerie du Ca intracellulaire2 + présente l’avantage de l’analyse à plusieurs cellules individuelles dans le même îlot11,12, permettant une comparaison directe de la glycémie-réactivité entre élargissement bêta-cellules individuelles. Ca2 + concentration intracellulaire peut être surveillée à l’aide de colorants fluorescents sensible au calcium13 ou calcium codé génétiquement indicateurs (GECIs)14. Considérant que la spécificité de type cellulaire manque colorants calcium-indicateur, GECIs peut être exprimée dans un type de cellule spécifique de promoteurs spécifiques. En outre, la nouvelle génération de GECIs, tels que GCaMP6, offre meilleur rapport signal-bruit plus rapidement la dynamique temporelle15. Nous décrivons ici l’utilité de la nouvelle génération de GECIs, en particulier GCaMP6s, de visualiser le calcium dans les cellules bêta à cellule unique résolution. Nous appliquons cette méthode à l’îlot principal de poisson-zèbre comme notre modèle de choix. Durant le développement embryonnaire, bêta-cellules dans l’îlot primaire proviennent de la partie dorsale et ventrale du pancréas bourgeons16. L’îlot principal est situé dans une position anatomique stéréotypée dans le pancréas de poisson-zèbre, permettant son identification facile et l’isolement. Bêta-cellules dans l’îlot primaire sont nécessaires pour la régulation du glucose, leur ablation génétique conduit à une hyperglycémie17,18. En outre, ces cellules bêta devient glucose-réactif lors de développement précoces zebrafish19. Ce protocole peut être également appliqué à imagerie les îlots secondaires, qui forment aux stades postembryonnaire. Le protocole permet aux cellules bêta image ex vivo, à un stade ultérieur du développement et sous des concentrations de glucose définie.
Nous démontrons une technique permettant la quantification de la réactivité de glucose des cellules bêta à cellule unique résolution. Ceci est rendu possible en surveillant la concentration intracellulaire en calcium à l’aide d’un indicateur de calcium codé génétiquement, GCaMP6s. L’activité de cellules bêta est capturé ex vivo par le montage de l’îlot dans un moule de thrombine-fibrinogène. Une étape critique du protocole est la stabilité du moule. Un délai suffisant doit être accordée pour le fibrinogène se dissoudre dans la solution HBSS. Sans cela, le moule ne pas polymériser suffisamment pour assurer la stabilité pendant la session d’imagerie. Un îlot monté dans le moule de la thrombine-fibrinogène et plongé dans les milieux de culture de cellules peut rester viable pendant au moins une semaine (données non présentées). Des solutions de rechange au moule thrombine-fibrinogène, tels que l’agarose de la bas point de fusion, peuvent être utilisées pour monter l’ îlot22. Un autre paramètre essentiel est la dissection de l’îlot. Au cours de cette étape, les tissus entourant l’îlot doit être retiré sans blesser ou piquer l’îlot. Une dissection habile vient avec la pratique.
Une limitation du protocole d’imagerie est la restriction à un seul plan confocal de l’îlot. Ceci est fait pour saisir la dynamique de l’influx de calcium dans les cellules bêta individuelles. Une Z-pile à travers toute l’épaisseur de l’îlot conduit aux basses vitesses et perte du signal oscillant de cellules individuelles d’imagerie. Cette limitation pourrait être améliorée en utilisant un moyen plus rapide d’imagerie confocale-telles que la microscopie de filature-disque, permettant de saisir la dynamique du calcium en 3 dimensions. Une autre frontière serait in vivo calcium d’imagerie12. La nature transparente de l’embryon de poisson zèbre ou l’utilisation de souches de pigment-moins de poissons zèbres adultes23 pourrait ouvrir la possibilité d’en vivo imagerie dans l’avenir.
L’imagerie de l’activité des cellules bêta à haute résolution spatiale et temporelle permet d’étudier l’hétérogénéité fonctionnelle entre les bêta-cellules individuelles. Cette approche peut faire toute la lumière sur l’existence de certaines sous-populations de cellules bêta. Récemment, plusieurs études ont montré l’existence de sous-populations dans les cellules bêta nominalement homogène24,25,26. Ex vivo imagerie est cumulable avec les journalistes génétiques pour caractériser de la réponse de la population-void au glucose. En outre, combinant le programme d’installation d’imagerie avec stimulation pharmacologique peut permettre de dépister des composés susceptibles d’améliorer la fonctionnalité des cellules bêta.
En résumé, la technique présentée ici permet de quantifier et comparer la réactivité de glucose pour les bêta-cellules individuelles. Il fournit une fenêtre directe dans la fonctionnalité des cellules bêta, un paramètre important dans le développement du diabète.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les membres du laboratoire Ninov pour commentaires sur le manuscrit, membres du Centre pour installation de poisson et microscopie de Dresde de thérapies régénératives (CRTD) pour l’assistance technique. N.N. est financé par la DFG-CRTD, Cluster d’Excellence à TU-Dresden, Fondation allemande de la recherche (DFG) et le Centre allemand de recherche sur la diabète (DZD).
Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |