细菌细胞的空间高度组织。为了跟随这个组织随着时间的推移在缓慢生长的Myxococcus xanthus细胞, 建立了荧光活细胞成像的一个高时空分辨率的几个世代。利用该方法可以确定重要蛋白质在染色体分离和细胞分裂中的时空动力学。
细菌细胞的荧光活细胞成像是分析中心细胞周期事件的蛋白质和染色体的时空动态的关键方法。然而, 在缓慢生长的细菌中, 这些分子的成像是一个挑战, 由于漂白的显影和毒性在图像采集过程中。在这里, 我们描述了一个简单的协议, 以规避这些限制的情况下, Myxococcus xanthus (它的世代时间 4-6 小时)。为此, m. xanthus细胞生长在一个富含营养的琼脂垫上, 温度控制湿润环境。在这些条件下, 我们通过跟踪单个细胞的生长来确定单个细胞的加倍时间。此外, 关键的细胞过程, 如染色体分离和细胞分裂可以通过荧光活细胞成像的细胞, 包括相关荧光标记蛋白, 如 ParB YFP, FtsZ GFP, mCherry PomX 超过多个细胞周期。随后, 获取的图像被处理生成蒙太奇和/或电影。
细菌细胞在空间上高度组织与许多蛋白质本地化非对称在细胞舱1,2,3,4。这种局部化通常是高度动态的, 随着时间的推移, 对细胞周期提示或外部信号发生变化。同样地, 细菌染色体在空间上高度组织与各自的基因座被安置到特定亚细胞位置在分离过程之前和期间5。这种动态空间组织对于生长、分裂、细胞周期调控、分化、运动、信号传导以及染色体组织和分离等都具有重要意义;因此, 它主要影响细菌功能的所有方面。
这些细胞过程的时空动力学正在分析各种不同的细菌物种, 大肠杆菌,枯草芽孢杆菌, 霍乱弧菌, Caulobacter crescentus作为重要模型有机体。然而, 这四种物种只涵盖了巨大的细菌多样性的小范围, 也许不奇怪的是, 由于这些物种之间的大系统发育距离, 细胞组织和极化机制在这些不同的细菌。这就提高了研究其他细菌种类的必要性, 以便最终提取细菌细胞时空动力学的一般原理。
革兰阴性三角洲-proteobacterium m. xanthus是研究细菌6中的社会行为和合作的模型有机体。m. xanthus是一个严格的好氧生物, 在营养物质的存在下, 它形成了细胞以高度协调、蜂拥的方式向外扩散, 并捕食其他微生物7的菌落。为了应对营养饥饿, 细胞启动了一个发育计划, 结果形成了由数以千计的细胞组成的果体, 在其中, 杆状运动细胞分化为球状双胞孢子8。这两种类型的行为,即蜂拥和果体形成, 只有被放置在固体表面的细胞执行。此外, 在这两种营养条件下, 细胞都参与了涉及直接细胞接触的过程, 包括交换外部膜脂蛋白, 在接受者9、10 中可能刺激运动或作为毒素作用., 交换 LPS11, 刺激运动的多糖对相邻的细胞12, 细胞间信号传递的单元格表面定位信号蛋白13,14。
最近, m. xanthus也成为研究运动的机制和它的章程15, 细胞分裂16,17,18和染色体组织19的模型有机体 ,20,21。在m. xanthus细胞周期的关键步骤已详细分析了荧光显微镜下使用的快照图像或短时间推移记录的菌株携带相关的荧光标记蛋白16, 17,18,19,20。理想情况下, 许多细胞应遵循单细胞分辨率的荧光活细胞成像至少一个完整的细胞周期, 以获得可靠的定量数据的细胞周期参数。然而, 这是一个挑战, 在 m. xanthus的情况下, 由于其相对长的时间 4-6 小时在标准实验室条件下, 由于漂白显影和毒性在图像采集。
在这里, 我们描述了一个协议, 遵循m xanthus细胞与单细胞分辨率的荧光活细胞成像至少24小时, 并涵盖几个细胞周期。重要的是, 在整个协议期间, 细胞保持在琼脂垫上, 并密切接触, 允许接触依赖的活动至关重要的社会生活方式的 m. xanthus。该协议还允许用户在高时间分辨率和单细胞分辨率下监视形状、大小、除法和荧光探针, 从而能够量化细胞间的变异性和细胞周期事件的相关性。
荧光活细胞成像已成为研究细菌细胞时空动态的有力工具。然而, 诸如m. xanthus这样的运动和慢生长细菌的时间失效荧光显微术一直具有挑战性, 只在短时间内进行。在这里, 我们提出了一个易于使用和稳健的方法的活细胞成像的m. xanthus的时间推移荧光显微镜。这种方法允许用户遵循细胞和荧光标记蛋白质的几个回合的细胞周期与单细胞分辨率。
有几个先决条件, 影响生长缓慢的m. xanthus细胞的活细胞成像的成功, 包括: 1) 一个固体表面的细胞附着;2) 养分和氧气的供应;3) 恒定的湿度和温度;4) 实验条件的优化, 如曝光时间和图像采集频率。
在我们的实验设置中, 我们使用厚的琼脂糖垫补充养分。使用厚的琼脂糖垫, 而不是微流控装置来跟踪单个细胞具有一些根本的好处, 但也有一些缺点。首先, 琼脂糖垫不仅为m xanthus细胞的附着和运动提供了表面, 而且还有足够的养分促进生长至少24小时。第二, 通常用于研究荧光标记蛋白的细胞内定位的快照分析, 以前是在同一类型的琼脂糖垫16,17,29。因此, 从快照分析中得到的数据可以与此处描述的方法直接比较。第三, 琼脂糖垫可以很容易地修改和补充抗生素或其他补充物, 如丘索4和香草酸, 通常用于基因表达诱导18,30。最后, 由于细胞在实验过程中被允许形成 microcolonies, 这种设置还允许研究直接细胞间相互作用对特定参数的影响。这方面是特别重要的情况下, m. xanthus , 因为这种细菌显示几个接触依赖的相互作用。该方法的主要缺点是实验条件是在实验期间预设的。相比之下, 微流控装置通常允许在实验过程中通过添加抗生素31来改变实验条件。
免费的软件包 (例如, MicrobeJ, Oufti) 可以自动分析单个细胞的生长和蛋白质的定位。然而, 这些软件只适用于对单个细胞或小组细胞的分析。因此, 自动分析此处描述的 24 h 记录所生成的数据仍然是一个挑战。
总之, 我们描述了一个易于使用的和可重现的协议, 执行活细胞成像与缓慢增长的m. xanthus细菌。我们表明, 简单的营养补充琼脂糖垫足以维持至少24小时的增长, 并允许观察和分析蛋白质的定位和生长, 单细胞分辨率数代。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到德国研究委员会 (DFG) 在 Transregio 174 “细菌细胞时空动态” 和普朗克社会的框架内的支持。
DMI6000B with AFC | Leica microsystems | 11888945 | Automated inverted widefield fluorescence microscope with adaptive focus control |
Universal mounting frame | Leica microsystems | 11532338 | Stage holder for different sample sizes |
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 oil PH3 | Leica microsystems | 11506197 | Phase contrast objective |
Orca Flash 4.0 camera | Hamamatsu | 11532952 | 4.0 megapixel sCMOS camera for picture aquisition |
Filter set TXR ET, k | Leica microsystems | 11504170 | Fluorescence filter set, Ex: 560/40 Em: 645/75 |
Filter set L5 ET, k | Leica microsystems | 11504166 | Fluorescence filter set, Ex: 480/40 Em: 527/30 |
Filter set YFP ET, k | Leica microsystems | 11504165 | Fluorescence filter set, Ex: 500/20 Em: 535/30 |
ProScan III | Prior | H117N1, V31XYZEF, PS3J100 | Microscope automation controller with interactive control center |
EL 6000 light source | Leica microsystems | 11504115 | External fluorescence light source |
Incubator BLX Black | Pecon | 11532830 | Black incubation chamber surrounding the microscope |
Tempcontrol 37-2 digital | Leica microsystems | 11521719 | Automated temperature control for incubation chamber |
Gentmycin sulphate | Carl Roth | 0233.4 | Gentamycin |
Oxytetracylin dihydrate | Sigma Aldrich | 201-212-8 | Oxytetracyclin |
Kanamycin sulphate | Carl Roth | T832.3 | Kanamycin |
Filtropur BT25 0.2 bottle top filter | Sarstedt | 831,822,101 | Bottle top filter for sterilization of buffers |
Deckgläser | VWR | 630-1592 | Glass cover slip (60 x 22 mm, thickness: 0.7 mm) |
Seakem LE agarose | Lonza | 50004 | Agarose for microscopy slides |
Leica Metamorph AF | Leica microsystems | 11640901 | Microscope control software and software for picture analysis |
Tetraspeck Microsperes, 0.5 µm | ThermoFisher | T7281 | Fluorescent microspheres |
petri dish | Greiner Bio-one | 688102 | 120 mm x 120 mm x 17 mm squared petri dish for agarose pads |
BD Bacto Casitone | Becton Dickinson | 225930 | Casitone |
Parafilm M | VWR | 291-1213 | Parafilm |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Carl Roth | AE15.2 | Tris |
Magnesium sulphate heptahydrate | Carl Roth | P027.2 | Magnesium sulphate |
Potassium dihydrogen phosphate p.a. | Carl Roth | 3904.1 | Potassium dihydrogen phosphate |
1% CTT medium: 1 % (w/v) BD Bacto™ casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4 | Cultivation medium for M.xanthus | ||
TPM buffer: 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4 | Buffer for preparation of microscopy slides for M.xanthus |