Fluorescens Live-celle billeddannelse af den komplette Vegetative cellecyklus Slow-voksende sociale bakterien Myxococcus xanthus

Summary

Bakterieceller er rumligt yderst organiseret. For at følge denne organisation over tid i langsomt voksende Myxococcus xanthus celler, blev en set-up for fluorescens live-celle imaging med høj spatiotemporelle opløsning over flere generationer udviklet. Brug denne metode, kunne spatiotemporelle dynamics af vigtige proteiner til kromosom segregation og celledeling bestemmes.

Abstract

Fluorescens live-celle billeddannelse af bakterieceller er en vigtig metode i analysen af den rumlige og tidsmæssige dynamics af proteiner og kromosomer underliggende centrale cellecyklus begivenheder. Dog imaging af disse molekyler i langsomt voksende bakterier udgør en udfordring på grund af photobleaching af fluorophores og fototoksicitet under image erhvervelse. Her beskriver vi en enkel protokol for at omgå disse begrænsninger for Myxococcus xanthus (som har en generationstid på 4-6 h). Med henblik herpå, M. xanthus celler dyrkes på en tyk næringsstof-holdige agar pad i en temperatur-kontrolleret fugtigt miljø. Under disse omstændigheder er bestemme vi fordobling tidspunktet for enkelte celler ved at følge væksten af enkelt celler. Derudover processer centrale cellulære såsom kromosom segregation og celledeling kan være afbildet af fluorescens live-celle billeddannelse af celler, der indeholder relevante fluorescently mærket markør proteiner som ParB-YFP, FtsZ-normal god landbrugspraksis og mCherry-PomX over flere celle cyklusser. De erhvervede billeder behandles efterfølgende, generere montager og/eller film.

Introduction

Bakterieceller er rumligt yderst organiseret med mange proteiner lokalisering asymmetrisk inden for cellulære rum^1,2,3,4. Denne lokalisering er ofte yderst dynamisk og ændrer sig over tid i svar til cellecyklus stikord eller eksterne signaler. Ligeledes, den bakterielle kromosom er rumligt yderst organiseret med individuelle loci er placeret til bestemte subcellulært steder, før og under adskillelse proces⁵. Denne dynamiske rumlige organisation er vigtigt for vækst, division, celle cyklus regulering, differentiering, motilitet, signaltransduktion samt kromosom organisation og adskillelse; således, det berører stort set alle aspekter af bakteriel funktion.

Spatiotemporelle dynamikken i disse cellulære processer analyseres i en række forskellige bakteriearter hos Escherichia coli, Bacillus subtilis, Vibrio choleraeog Caulobacter crescentus tjener som vigtige modelorganismer. Men disse fire arter dækker kun en lille spektrum af de enorme bakterielle mangfoldighed, og måske ikke overraskende i betragtning af store fylogenetiske afstanden mellem disse arter, cellulære organisation og polarisering mekanismer er forskellige i disse bakterier. Dette øger behovet for at studere supplerende bakteriearter at til sidst uddrage generelle principper spatiotemporelle dynamikken i bakterieceller.

De Gram-negative delta-proteobacterium M. xanthus er en model organisme i studiet af sociale adfærd og samarbejde i bakterier⁶. M. xanthus er en streng aerobe og i overværelse af næringsstoffer, det danner kolonier, hvor celler spredes udad i en meget koordineret, myldrende mode og byttedyr på andre mikroorganismer⁷. Svar på næringsstof sult, celler indlede en udviklingsmæssig program, der resulterer i dannelsen af frugtsætning organer, der består af tusindvis af celler, og inden for hvilke, de stavformet motile celler differentiere til sfæriske diploid sporer⁸. Begge typer af adfærd, dvs., sværmer og frugtsætning krop dannelse, udføres kun af celler, der er placeret på en fast overflade. Desuden begge næringsstof betingelser celler engagere sig i processer, der omfatter direkte celle-celle kontakter herunder udveksling af ydre membran lipoproteiner, der kan stimulere motilitet eller fungere som toksiner i den modtagende^9,10 , udveksling af LP’ER¹¹, stimulering af motilitet af exopolysaccharides på tilstødende celler¹²og intercellulære signalering af en celle overflade-forankrede signalering protein^13,14.

For nylig, M. xanthus er også blevet en model organisme for at studere de underliggende motilitet og dets forordning¹⁵, celledeling^16,17,18, og kromosom organisation^{19 mekanismer ,20,21}. Kritiske trin den M. xanthus celle cyklus er blevet analyseret i detaljer af Fluorescens mikroskopi ved hjælp af snap-shot billeder eller korte time-lapse optagelser på stammer med relevante fluorescently mærket proteiner^{16, 17,18,19,20}. Ideelt set bør mange celler følges med én celle opløsning af fluorescens levende celle imaging for mindst én fuld cellecyklus at få robuste kvantitative data om cellecyklus parametre. Dette er dog en udfordring for M. xanthus på grund af dens forholdsvis lange generationstid på 4-6 h under standard laboratorieforhold og på grund af photobleaching af fluorophores og fototoksicitet under image erhvervelse.

Her, vi beskriver en protokol til at følge M. xanthus celler med enkelt celle opløsning af fluorescens live-celle imaging i mindst 24 timer og dækker flere celle cyklusser. Vigtigere, under den hele protokol, celler bevares på en agar pad og i tæt kontakt giver mulighed for kontakt-afhængige aktiviteter afgørende for den sociale liv stil M. xanthus. Protokollen giver også mulighed for brugere til dataskærm form, størrelse, divisioner og fluorescerende sonder på en høj tidsmæssige opløsning og med en enkelt celle opløsning, og således giver mulighed for kvantificering af celle til celle variabilitet og korrelationer af cellecyklus begivenheder.

Protocol

1. forberedelse og vækst af M. xanthus stammer Bemærk: Se tabel 1 og tabel 2. Forberede 1% casitone bouillon (CTT) vækst medium 1% (w/v) i bugspytkirtlen digest af kasein (fx, Bacto casitone), 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM KH2PO4 pH 7,6, 8 mM MgSO422, suppleret med kanamycin (50 µg/mL) eller oxytetracyklin (10 µg/mL). Tilføje phosphatbufferet (10 µg/mL) til alle medier til at reducere risikoen for forurening med andre bakterier, da M. xanthus celler er naturligt resistente over for det. Podes 5 mL 1% CTT indeholdende det relevante antibiotic(s) med en enkelt frisk dyrket koloni af vilde skrive (WT) DK1622 23, SA4420 (ΔmglA)24, SA4797 (ΔmglA, ΔpomX/PpomZ mCherry-pomX )16, SA8241 (ΔmglA, ftsZ+/PnatftsZ-normal god landbrugspraksis), eller SA4749 (ΔmglA, parB+/PnatparB-yfp) i den morgen i dag 1. Resuspend en enkelt M. xanthus koloni i 500 µL af 1% CTT suppleret med antibiotika i sterile rør og overføre hele suspension til en 50 mL Erlenmeyer-kolbe indeholdende 5 mL 1% CTT.Bemærk: Brug en Erlenmeyerkolbe med 10 gange mængden af kulturen for at sikre tilstrækkelig aeriation og optimal vækst. Vokse celler i otte generationer (ca. 40-48 h med en generationstid på 4-6 h) ved 32 ° C, rysten på 220 rpm, i mørke. Vedligeholde celler i den eksponentielle vækstfase (OD550 < 1.2) og forhindre dem i at nå den stationære fase. Hvis det er nødvendigt, fortyndes cellerne til frisk 1% CTT medie som indeholder de relevante antibiotic(s) til en OD550 på 0,1 – 0,2.Bemærk: En optimal OD550 til en enkelt celle mikroskopi er 0,5 – 0,7. På denne OD550findes et tilstrækkeligt antal celler pr. billede at give mulighed for kvantitativ bestemmelse samt statistisk analyse af cellulære parametre. 2. forberedelse af mikroskopi prøver Bemærk: Celler, der ses ved mikroskopi er placeret på et mikroskop coverslip og derefter er omfattet af en Agarosen pad der indeholder næringsstoffer. Coverslip er limet til en plastik eller metal ramme at give mekanisk støtte. Som forberedelse til mikroskopi, en stor pude af 1% agarose/TPM/0.2% CTT bør være forberedt på forhånd som beskrevet i trin 2.1-2.3. Henvises også til Bordet af materialer til specifikke produkter, der anvendes her. Forberede 500 mL af TPM-buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM KH2PO4 pH 7,6, 8 mM MgSO4) og autoklave eller filter sterilisere ved hjælp af en flaske top filter.Bemærk: Den sterile buffer kan opbevares i flere måneder ved stuetemperatur. Forberede 1% Agarosen mikroskopi løsning indeholdende 0,2% CTT (mix 1 g af Agarosen med 80 mL af TPM-buffer og 20 mL af 1% CTT medium). Varme i en mikrobølgeovn indtil Agarosen er smeltet.Bemærk: 0,2% CTT er tilstrækkelige til, at celler til at vokse og forhindre sult. Højere koncentrationer af CTT i mikroskopi medium vil resultere i høj baggrund fluorescens. Fyld en petriskål med den smeltede Agarosen til en tykkelse på 0,5 cm (for en 11,5 cm x 11,5 cm square petriskål, ca. 60 mL smeltet Agarosen er påkrævet) og lad det køle ned til stuetemperatur.Bemærk: Agarosen pad kan opbevares ved 4 ° C i et fugtigt miljø for op til 2 dage. Pre varm 1% agarose/TPM/0.2% CTT pad ved 32 ° C i mindst 15 min. før anvendelsen.Bemærk: For at forberede cellerne til mikroskopi, Følg trin 2.4-2.8. Placere et sterilt glas coverslip (60 mm x 22 mm, tykkelse: 0,7 mm) på en plastik eller metal ramme, der har et hul i midten (figur 1A); denne ramme fungerer som et mekanisk støtte til de tynde coverslip og hjælper med at reducere drift under mikroskopi. Lave coverslip til rammen med tape. At forberede rammen, skære en 75 mm × 25 mm ramme fra en 1 mm tyk metalplade, derefter skåret ud af en passende størrelse hul (20 mm × 30 mm i dette eksperiment) i midten. Tilføje 10-20 µL af eksponentielt dyrket M. xanthus celler på coverslip. Tilføj fluorescerende 0,5 µm mikrokugler som fiducial markører til cellerne til at forenkle sporing af celler eller proteiner i time-lapse optagelser. Fortynd mikrokugler 1: 100 i TPM-buffer og opbevares ved 4 ° C i op til flere måneder. Ryst grundigt før brug og tilføje 5-10 µL af de fortyndede mikrokugler til cellerne.Bemærk: Her mikrokugler der er fluorescerende i alle fælles blå, grøn, gul og rød, fluorescerende kanaler blev brugt. Klip en lille pad omtrent på størrelse med coverslip af den store pre varmede 1% agarose/TPM/0.2% CTT pad og placere den på toppen af celler (figur 1B). Placer en coverslip oven på 1% agarose/TPM/0.2% CTT Agarosen pad at forhindre fordampning og vedligeholde celler i et fugtigt miljø.Bemærk: Coverslip alene vil forhindre betydelig fordampning i mindst 2 timer. For længere time-lapse optagelser, skal 1% agarose/TPM/0.2% CTT pad og coverslip sandwich være forseglet med paraffin film at forhindre fordampning. Inkuber mikroskopi prøven ved 32 ° C i 15-20 min at lade cellerne tillægger bunden af Agarosen pad. Derefter starte time-lapse mikroskopi optagelser. 3. mikroskop Set-up og Time-lapse erhvervelse Bemærk: Protokollen beskrevet her blev udviklet til en inverteret widefield mikroskop med autofokus, et 100 X / 1,30 NA olie PH3 mål, en X, Y motoriserede stadium, en sCMOS kamera, en lyskilde, filtre til grønt-fluorescerende, rødt-fluorescerende eller gul-fluorescerende proteiner, og en temperatur kontrolleret inkubation kammer. Parlamentet holder celler beskyttet mod lys og ved konstant temperatur. Pre heat inkubation kammer og mikroskop til 32 ° C for ~ 1-2 h før du starter mikroskopi.Bemærk: Afhængigt af mikroskop set-up, kan varme tage længere tid. Forvarmning er afgørende for at mindske afdrift og stabiliserer autofokus kontrolsystem. Tænde mikroskopet og starte mikroskop kontrol software. Vælg det korrekte mål og den korrekte spejle og filtre til at erhverve fase kontrast billeder samt billeder af grønt-fluorescerende, rødt-fluorescerende eller gul-fluorescerende proteiner.Bemærk: Et mikroskop er typisk leveres med en foretrukne software til mikroskop kontrol og image erhvervelse. Her blev en kommercielt tilgængelig software (Se Tabel af materialer) brugt til at styre mikroskop og image erhvervelse. Tilføj en dråbe af høj kvalitet immersionsolie på linsen af målet og til bunden af prøven forud inkuberet ved 32 ° C. Placer mål på de laveste mulige Z-position til at undgå skadelige mål linsen, når prøven er placeret på stadiet mikroskop. Placer metalramme med prøve på mikroskop-scenen og med “hul-side” mod målet. Fastgør prøven sikkert i indehaveren af scenen. Fokusere på celler ved at flytte fase i Z-retning tættere til formålet. Bevæge bordet langsommere, når olien dråber på prøve nederste side og mål linsen gøre kontakt. Bevæge bordet i X / Y retning indtil flere enkelt celler er synlige i regionen i visningen, når celler i brændplanet. Sørg for, at mindst én fluorescerende microsphere er i regionen i udsigt for at senere Juster de erhvervede billeder.Bemærk: Under optimale forhold, en celle tæthed af 15-30 celler pr. region af visning (2.048 x 2.048 pixel eller 133.1 x 133.1 µm) skal nås. Åbn guiden Flerdimensionel erhvervelse af mikroskop control-software til at oprette en tid bortfalder eksperiment, der tillader mikroskop til at erhverve billeder på flere bølgelængder og fase holdninger, hvis det kræves. I fanen Main aktivere Timelapse og Flere bølgelængder. Ekstra faner vises på venstre side af vinduet. Klik på besparelse fanen og Vælg mappe til at vælge en tom mappe på computerens harddisk til at gemme de erhvervede billeder. Aktivere Increment basisnavn hvis filen findes for at sikre, at på hinanden følgende datasæt ikke overskriver tidligere. Derefter navngive eksperimentet med dato og stamme-navn eller titel af eksperimentet. Klik på fanen Timelapse til at justere parametrene time-lapse. Angive varigheden til 24 timer og angive Tidsintervallet til 20 min. Antallet af tidspunkter ændres automatisk.Bemærk: Optimale tidsintervallet afhænger af eksperimentet og cellefunktion skal analyseres. Hyppige billede opkøb kan forårsage photobleaching. Således skal en trade-off mellem tidsmæssige opløsning og photobleaching findes empirisk. Ved en fordobling tid på 4-6 timer, kan billeder være let erhvervet med et interval på 5 min (eller endnu mindre intervaller hvis det ønskes) til fase kontrast mikroskopi. Hvis Fluorescens mikroskopi over et tidsforløb af 24 h ønskes billeder skal registreres med et interval på ca 15-30 min. Klik på fanen bølgelængder . Vælg antallet af bølgelængder at erhverve for hvert billede for hvert tidspunkt ved at ændre antallet.Bemærk: For hver bølgelængde, en ny fane vises på venstre side af den flerdimensionel erhvervelse ” guiden og bølgelængder vil blive erhvervet i rækkefølge fra top til bund. For hver bølgelængde, kan erhvervelse indstillinger ændres separat. Klik på fanen første bølgelængde fra toppen. Vælg fasekontrast i rullelisten belysning . Vælg 100 ms for eksponering og vælg Hver gang punkt i rullelisten erhverve . Deaktivere Auto afsløre ved at vælge aldrig i drop-down listen. Gentag trin 3.5.5 for hver bølgelængde, der skal erhverves på hvert tidspunkt. For eksperimentel opsætning og fluorescently mærket proteiner beskrevet her, kan bruge følgende parametre for eksponering: 250 ms for mCherry fusion proteiner, 200 ms for YFP fusion proteiner og 1.000 ms for normal god landbrugspraksis fusion proteiner.Bemærk: Indstillingerne optimal belysning for hver stamme og fluorescerende proteiner bør fastsættes på forhånd ved at ændre lampe intensitet og image erhvervelse tid for hver bølgelængde. For lang billede erhvervelse gange vil øge den fototoksiske effekt og i sidste ende føre til vækst anholdelse og celle død. Derfor bør en afvejning mellem billede kvalitet og celle levedygtighed gennemføres. Erhverve billeder fra flere fase positioner til at øge antallet af celler, registreres i den samme eksperiment. For at erhverve billeder fra flere fase positioner, skal du aktivere Flere fase positioner i fanen hoved . Derefter skal du klikke på fanen fase og klikke på knappen Live at anskue synsfelt. Bevæge bordet i X/Y-retning, indtil en region af interesse (ROI) er i synsfeltet. Gem X – og Y-koordinater ved at klikke på bevæge “+” i den fase tab. bordet igen i X/Y-retning indtil en ny ROI er fundet og Gem koordinater igen ved at klikke på “+”. Gå, indtil det ønskede antal regioner er gemt.Bemærk: I tilfælde af fluorescens billede erhvervelse, Sørg for, at regioner af interesse (ROIs) ikke er for tæt på hinanden for at minimere fototoksicitet. Check endnu engang at cellerne er i fokus ved at klikke på de forskellige gemte X – og Y-holdninger og starte hardware autofokus ved at klikke på AFC hold hen til opbevare den gemte Z-position konstant i løbet af eksperimentet. Start de time-lapse optagelser i mikroskop kontrol software ved at klikke erhverve i guiden Flerdimensionel erhvervelse .Bemærk: Ét vindue vises for hver bølgelængde, der er erhvervet og en yderligere vindue vises der viser antallet af erhvervede tidspunkter og tiden indtil næste billede erhvervelse. Kontroller, at cellerne er stadig i fokus efter de første par tidspunkter i time-lapse optagelserne til at maksimere kvaliteten af billederne og koncentrere hvis det kræves. 4. generation af Time-lapse film og justering af billede Bemærk: Flere kommercielle og gratis software-pakker er tilgængelige for image erhvervelse og billedanalyse. Vi bruger en kommercielt tilgængelig software (Se Tabel af materialer) med flere præ-installeret plugins og yderligere værktøjer. Gemme de enkelte billeder fra time-lapse optagelser på en computer, der har billede analyse/forarbejdning software installeret. Starte softwaren og åbne billeder som en stak ved at klikke på anmeldelse flerdimensionel Data | Vælg Base fil | Vælg bibliotek. Åbn mappen med den flerdimensionelle data. Kontrollere datasættet og klik på Vis; datasættet vises som enkelt billeder fra tid pege en indtil udgangen. Aktivere bølgelængde (for at skabe et stack), skal du vælge alle billeder, der skal være i stakken og klik på Indlæs billedet. Gentag dette trin for alle bølgelængder og gemme udfyldte stakke. (Valgfrit) Åbne alle billeder kræves for film ved hjælp af fil | Åben.Bemærk: Det anbefales at åbne billeder af en erhvervet bølgelængde ad gangen til ikke sinke computeren hvis datakraft er begrænset. Hvis visse dele af de time-lapse optagelser, fx, starten, slutningen eller flere tidspunkter skal springes over, kan så det justeres i den færdige film. Aktivere stakken af billeder, der skal korrigeres for afdrift. Åbn værktøjet justering af Apps | Auto Juster… Check stak som kilde til billeder og første fly/gang punkt som referenceplanet. Vælg stakken med knappen Source stack og klik på Anvend.Bemærk: Den automatiske justering vil tage lidt tid og datakraft men er en god måde at korrigere store stakke for afdrift af mikroskop set-up. Denne automatiske justering virker godt hvis mikrokugler er inkluderet, men kan også arbejde uden dem. Gem den justeret stak. Bruge ROIs.Bemærk: Fluorescerende time-lapse mikroskopi let skaber store sæt af datafiler, tage en masse datakraft og bremse downstream behandling af disse film. Vi anbefaler derfor kraftigt at identificere ROIs og isolere cellerne til at arbejde med mindre filer. Vælg værktøjet Rektangulært Region . Oprette en ROI omkring celler af interesse ved at manuelt tegne en ROI på fase kontrast billede. Kontroller, at cellerne i interesse er synlig og i fokus i hele den hele time-lapse film. Åbn den time-lapse film af den anden bølgelængde af det samme datasæt. For at overføre ROI fra fase kontrast billeder til fluorescens billeder af den anden bølgelængde bruge værktøjet Overførsel regioner med regioner | Overføre regioner. Vælg fase kontrast datasæt som Kildebillede og den anden bølgelængde datasæt som Målbilledet. Vælg Alle regioner og tryk på OK. Gentag trin 4.6.2 for hver bølgelængde erhvervet til det samme datasæt. Vælg ROI og duplikere det som en stak med Rediger | Duplikere | Stak… eller tryk på Skift + Ctrl + D nøgler. Derefter gemme den duplikerede stak med fil | Gemme i den samme mappe som den oprindelige data. Gentag trin 4.6.4 for hver ROI af hver bølgelængde erhvervet til det samme datasæt For at generere en film i formaterne MOV eller AVI, åbne funktionen Gøre film via stak | Lave film. Vælg de time-lapse optagelser med knappen Source Stack . Vælg outputformat, framerate, antallet af billeder, og klik på Gem.

Representative Results

M. xanthus er en langsomt voksende bakterie, der bevæger sig på faste overflader. For at teste vores eksperimentelle set-up, udført vi en time-lapse eksperiment med motile DK1622 WT celler. Fase kontrast billeder blev erhvervet med intervaller på 5 min i 24 timer (figur 2A, B). Fleste celler på linje i grupper. Som forventet, celler vises motilitet og flyttede overvejende i grupper. Vi bemærkede endvidere, at celler lejlighedsvis vendt bevægelsesretning. Disse resultater tyder på, at WT celler på de testede betingelser opfører sig normalt i form af celle motilitet. Men selv når cellerne er indspillet hvert 5 min, identifikation af individuelle celler er vanskeligt. Desuden, fordi cellerne motile, mange celler flygte eller indtaste synsfelt, hvilket gør det vanskeligt at følge celler i længere perioder. For at spore det samme M. xanthus celler for flere runder af cellecyklus af live-celle imaging, kan du slette enkelte stammer for mglA -gen, som er afgørende for motilitet25. Dette forhindrer celler i at bevæge sig ud af synsfeltet under imaging-protokollen. I-frame sletninger er genereret, som beskrevet af Shi mfl. 26 Som forventet i fase kontrast live-celle imaging med ikke-motile ΔmglA celler (figur 3), celler ikke vise aktiv bevægelse. Vi var i stand til at følge den vækst og fordeling af individuelle celler under microcolony dannelse. Baseret på time-lapse optagelserne hvor billeder blev erhvervet med intervaller på 5 min til 24 h, var det muligt at opgøre den interdivision tid (tid mellem to celledeling begivenheder) med enkelt celle opløsning. Celler af ΔmglA mutant havde en Inter division tid på 235 ± 50 min. (n = 97 celler). Med ca. 4 h er den interdivision tid svarer til fordobling tid målt i suspension kulturer for WT celler. Dette giver bevis for, at M. xanthus celler vokse optimalt disse eksperimentelle betingelser. For at undersøge, om vores set-up tillader celler til at vokse normalt mens tracking YFP-mærket proteiner over lange perioder, vi udførte fluorescens time-lapse imaging med M. xanthus celler, der udtrykker en YFP-mærkede protein. Til dette formål fulgte vi ParB-YFP som markør for oprindelsen af replikering (ori). ParB er som komponent i ParABS i M. xanthus og binder sig til parS steder proksimale at ori; oprindelse dobbeltarbejde og kromosom adskillelse kan derfor være fulgt19,20,21. Med billed tilegnelse (fasekontrast og fluorescens, 200 ms erhvervelse tid i YFP kanal) hvert 20 min, celler voksede, opdelt og vises vækst selv ved 24 h (figur 4A). I starten af optagelserne dannet ParB-YFP to klynger i regionerne subpolar i størstedelen af celler (figur 4A). Kort før eller efter celledeling klynge af subpolar ParB-YFP på den gamle celle pol duplikeres. En af de to klynger forblev på den gamle celle pol mens den anden kopi omplantes til den nye celle pole, at nå den endelige subpolar position efter ca 40-60 min (figur 4A, B). Disse bemærkninger er i overensstemmelse med tidligere data genereret fra korte time-lapse optagelser ved hjælp af tynde agar puder19. Vi konkludere, at denne eksperimentelle set-up giver fluorescens time-lapse mikroskopi til at spore kromosom segregation over flere celle cyklusser i langsomt voksende M. xanthus celler, uden forstyrrende cellevækst eller kromosom segregation maskiner. I et lignende eksperiment søgte vi at følge markører for celledeling af time-lapse Fluorescens mikroskopi. Svarende til næsten alle andre bakterier, M. xanthus kræver FtsZ, en bakteriel tubulin-lignende GTPase, for celledeling16,17,18. FtsZ danner en ring-lignende struktur på midcell, den såkaldte Z-ring, der hjælper til at ansætte alle andre proteiner, der er nødvendige for celledelingen27,28. I M. xanthus, dannelsen af Z-ring og dets placering på midcell stimuleres af de tre PomXYZ proteiner16,17. Disse tre proteiner danner et kromosom-associerede kompleks, at overførsler på tværs af nucleoid fra webstedet af celledeling i cellen “mor” til midten af nucleoid i de to datterceller. I midten af nucleoid falder sammen med midcell, før kromosom segregation, og her PomXYZ komplekse rekrutter FtsZ og stimulerer Z-ring dannelse. Her fulgte vi først ikke-motile celler, der udtrykker ftsZ-normal god landbrugspraksis. Fordi FtsZ-NGL samlede viser en svagere fluorescens signal end ParB-YFP, vi øget eksponeringstid 5-fold til 1 s i normal god landbrugspraksis kanal. Som forventet, stærk ophobning af FtsZ-normal god landbrugspraksis konstateredes kun hos midcell og denne lokalisering dikteret placeringen af celledeling konstriktion (figur 5A). FtsZ-NGL dannet overvejende en klynge på midcell i længere celle. Det var også tydeligt, at denne klynge øget i intensitet over tid. Efter celledeling konstaterede vi, at FtsZ-NGL re akkumuleret på midcell i de to datter celler ca 2 timer senere (figur 5B). Dette er i overensstemmelse med den konstatering, at ca. 50% af celler i en population vise FtsZ lokalisering på midcell baseret på snap-shot analyse16,17. I et andet eksperiment fulgte vi ikke-motile ΔmglA celler i 24 timer at udtrykker mCherry-pomX. Som en del af PomXYZ systemet hjælper PomX guide Z-ring dannelse og positionering, dermed stimulere celledeling på midcell16. Fluorescens signalet fra mCherry-PomX er stærk og giver en eksponeringstid i fluorescens-kanal af 250 ms. vigtigere, alle celler voksede i størrelse og vises en celledeling begivenhed i løbet af eksperimentet, danner microcolonies efter 24 timer ( Figur 6A). Som tidligere rapporteret16indeholdt næsten alle celler en mCherry-PomX klynge. Fleste af disse er lokaliseret på midcell og klynger fra midcell omplantes til midcell i løbet af eksperimentet. Under celledelinger, var mCherry-PomX klynger delt, med hver datter celle modtager en klynge. I modsætning til FtsZ-normal god landbrugspraksis, mCherry-PomX lokaliseret på midcell 80-90% af cellecyklus og nået denne position hurtigt efter celledeling (fig. 6B). Figur 1 : Skematisk af den eksperimentelle set-up anvendes i hele denne undersøgelse. (A) A metal eller plastik ramme tjener som en støtte til prøven. Et coverslip er fastgjort til den metalramme med tape for at reducere bevægelse af prøven. (B) Side Se af eksperimentel prøve set-up. Celler er monteret på coverslip vist i (A). Agarosen puden, der leverer næringsstoffer og fugtighed til cellerne er anbragt oven på cellerne. Agarosen pad er omfattet af en yderligere coverslip at reducere fordampning. For høj kvalitetsbilleder bruges et 100 X fase kontrast oliebestandighedsobjektet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2 : Fase kontrast time-lapse mikroskopi af WT M. xanthus celler. Celler blev fulgt i 24 timer og billeder blev erhvervet hver 5 min. (A) repræsentative billeder af den samme synsfelt hvert 5 min er vist. Farvede pile angiver tekstretning bevægelighed for individuelle celler. Samme farve markerer cellen samme over tid. Tallene angiver tiden i minutter. Skalalinjen: 5 µm. (B) billeder af den samme synsfelt efter hver time er vist. Bemærk, at den samme synsfelt er vist men fordi celler bevæger sig, celler konstant indsejling i og udsejling af synsfeltet. Tallene angiver tid i timer. Skalalinjen: 5 µm. PH: fase kontrast. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3 : Fase kontrast time-lapse mikroskopi af ikke-motile M. xanthus celler. ΔmglA celler blev fulgt for 24 h. billeder blev erhvervet hvert 5 min og repræsentative billeder efter hver time er vist. Valgte celledeling forsnævringer er markeret med orange pile. Tallene angiver tid i timer. PH: fasekontrast. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4 : Fluorescens time-lapse mikroskopi af ParB-YFP i ikke-motile M. xanthus celler. Celler af en ΔmglA mutantudtrykker parB-yfp i nærværelse af indfødte parB (SA4749; ΔmglA; parB +/PnatparB-yfp) blev fulgt i 24 timer af fase kontrast og Fluorescens mikroskopi. (A) billeder blev erhvervet hvert 20 min og repræsentant billeder hver time indtil 10 h er vist, sammen med de samme celler efter 24 h. billeder er vist i fasekontrast (PH) og som overlejring af fasekontrast og YFP-signal. Valgte celledelinger er markeret med orange pile. Hvide og grønne pile angiver ParB-YFP klynge dobbeltarbejde begivenheder, med de grønne pile mærkning translocating klyngen. Tallene angiver tid i timer. Skalalinjen: 5 µm. (B) billeder blev erhvervet som i (A) men er vist ved højere tidsmæssige opløsning. Tallene angiver tiden i minutter. Pilene er som i (A). Skalalinjen: 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 5 : Fluorescens time-lapse mikroskopi af FtsZ-normal god landbrugspraksis i ikke-motile M. xanthus celler. Celler af en ΔmglA mutant udtrykker ftsZ-normal god landbrugspraksis i tilstedeværelse af indfødte ftsZ (SA8241; ΔmglA; ftsZ +/PnatftsZ-NGL) blev fulgt i 24 timer af fase kontrast og Fluorescens mikroskopi. (A) billeder blev erhvervet hvert 20 min og repræsentative billeder hver time indtil 10 h er vist, sammen med de samme celler efter 24 h. billeder vises i fasekontrast (PH) og som overlay fasekontrast og normal god landbrugspraksis signal. Valgte celledelinger er markeret med orange pile. Hvide pile angiver FtsZ-NGL klynger på midcell. Tallene angiver tid i timer. Skalalinjen: 5 µm. (B) billeder blev erhvervet som i (A) men er vist ved højere tidsmæssige opløsning. Tallene angiver tiden i minutter. Grønne og hvide pile mark FtsZ-NGL klynger i de venstre og højre celler, henholdsvis. Orange pile angiver celledelinger. Skalalinjen: 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 6 : Fluorescens time-lapse mikroskopi af mCherry-PomX i ikke-motile M. xanthus celler. Non-motile ΔpomX celler akkumulere mCherry-PomX (SA4797, ΔmglA, ΔpomX/PpomZ mCherry-pomX) blev fulgt i 24 timer ved fase kontrast og Fluorescens mikroskopi hvert 20 min. (A) repræsentative billeder hver time indtil 10 h er vist, sammen med de samme celler efter 24 h. billeder vises i fasekontrast (PH) og som overlay fasekontrast og mCherry signal. Valgte celledelinger er markeret med orange pile. Hvide og grønne pile angiver mCherry-PomX klynger før og efter opdeling begivenheder, henholdsvis. Tallene angiver tid i timer. Skalalinjen: 5 µm. (B) billeder blev erhvervet som i (A) og er vist på højere tidsmæssige opløsning. Pilene er som i (A). Skalalinjen: 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal. Bakteriel stamme Relevante genotype1 Reference DK1622 Vildtype 23 SA4420 ΔmglA 24 SA4749 ΔmglA; parB+/attB:: PnatparB-yfp (pAH7) Denne undersøgelse SA4797 ΔmglA; ΔpomX / attB::PpomZ mCherry-pomX (pAH53) 16 SA8241 ΔmglA; ftsZ+/ mxan18-19::PnatftsZ-normal god landbrugspraksis (pDS150) Denne undersøgelse Plasmider i parentes indeholder angivne gen fusioner og var intergated på de angivne steder på genomet.Plasmider integreret på webstedet attB eller mxan18-19 intergenic regionen blev udtrykt fraderes indfødte promoter (Pnat) eller den oprindelige initiativtager til pomZ (PpomZ). Tabel 1: Liste over bakteriestammer, der anvendes i denne undersøgelse. Plasmider Relevante egenskaber Reference pAH7 PnatparB-yfp; Mx8 juliebaasch; TetRasmussen 19 pAH53 PpomZ mCherry-pomX; Mx8 juliebaasch ; KmRasmussen 16 pDS150 1 PnatftsZ-normal god landbrugspraksis ; mxan18-19 ; TetRasmussen Denne undersøgelse pMR3691 Plasmid for vanillate inducerbar genekspression 18 pKA51 PnatftsZ-normal god landbrugspraksis ; Mx8 juliebaasch; TetRasmussen 17 1 pDS150: pDS150 er en afledning af pKA51, hvor webstedet Mx8 juliebaasch blev erstattet med mxan18-19 intergenic region.Til dette blev mxan18-19 intergenic regionen forstærket fra pMR3691 med primere Mxan18-19 fwd BsdRI(GCGATCATTGCGCGCCAGACGATAACAGGC) og Mxan18-19 rev BlpI(GCGGCTGAGCCCGCGCCGACAACCGCAACC) og klonede ind i pKA51. Tabel 2: Liste over plasmider anvendes i denne undersøgelse.

Discussion

Fluorescens live-celle imaging er blevet et stærkt værktøj til at undersøge bakterieceller spatiotemporelle dynamik. Time-lapse Fluorescens mikroskopi af motile og langsomt voksende bakterier såsom M. xanthus, dog har været udfordrende og blev kun foretaget for kort tid varighed. Vi præsenterer her, en let-til-brug og robust metode til live-celle billeddannelse af M. xanthus af time-lapse Fluorescens mikroskopi. Denne metode tillader brugeren at følge celler og fluorescently mærket proteiner for flere runder af cellecyklus med enkelt celle opløsning.

Der er flere forudsætninger, der påvirker succesen af live-celle billeddannelse af langsomt voksende M. xanthus celler, herunder: 1) en fast overflade for celle attachment; 2) udbuddet af næringsstoffer og ilt; 3) konstant fugtighed og temperatur; og 4) optimering af eksperimentelle betingelser såsom eksponering tid og image erhvervelse frekvens.

I vores eksperimentelle set-up bruger vi tyk Agarosen puder suppleret med næringsstoffer. Ved hjælp af tyk Agarosen puder i modsætning til mikrofluid enheder til at følge enkelt celler har nogle grundlæggende fordele, men også nogle ulemper. Først, Agarosen puden ikke kun giver en overflade til M. xanthus celle vedhæftet fil og bevægelighed, men også tilstrækkelig næringsstoffer for vækst i mindst 24 timer. For det andet snap shot analyser almindeligvis anvendes til at studere intracellulære lokalisering af fluorescently mærket proteiner var tidligere udført på den samme type af Agarosen puder^16,17,29. Derfor, data fra snap shot analyser kan sammenlignes direkte med data opnået med metoden beskrevet her. For det tredje Agarosen pads kan nemt ændres og suppleres med antibiotika eller andre kosttilskud såsom CuSO₄ og vanillate, der almindeligvis anvendes til gen expression induktion^18,30. Endelig fordi celler er tilladt til form microcolonies i løbet af et eksperiment, dette set-up giver også mulighed for at studere effekten af direkte celle-celle interaktioner på en bestemt parameter ved at blive analyseret. Dette aspekt er særlig vigtigt i tilfælde af M. xanthus fordi denne bakterie viser flere kontakt-afhængige interaktioner. Den største ulempe ved denne metode er, at de eksperimentelle betingelser der er opsat for varigheden af et eksperiment. Derimod tillade mikrofluid enheder generelt skiftende de eksperimentelle betingelser i løbet af et eksperiment ved at tilføje for eksempel antibiotika³¹.

Gratis softwarepakker (f.eks.MicrobeJ, Oufti) er tilgængelige til automatisk analysere væksten af enkelt celler og proteiner lokalisering inden for individuelle celler. Men disse software er kun velegnet til analyse af enkelt celler eller små grupper af celler. Det er således fortsat en udfordring til automatisk analysere de data, der er genereret for 24-timers optagelser beskrevet her.

I sammendrag, vi beskrevet en let at bruge og reproducerbar protokol for at udføre live-celle imaging med langsomt voksende M. xanthus bakterier. Vi viser, at simple næringsstof-suppleret Agarosen pads er tilstrækkelig til at opretholde væksten i mindst 24 timer og give mulighed for observere og analysere protein lokalisering og vækst med enkelt celle opløsning over flere generationer.

Materials

DMI6000B with AFC	Leica microsystems	11888945	Automated inverted widefield fluorescence microscope with adaptive focus control
Universal mounting frame	Leica microsystems	11532338	Stage holder for different sample sizes
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 oil PH3	Leica microsystems	11506197	Phase contrast objective
Orca Flash 4.0 camera	Hamamatsu	11532952	4.0 megapixel sCMOS camera for picture aquisition
Filter set TXR ET, k	Leica microsystems	11504170	Fluorescence filter set, Ex: 560/40 Em: 645/75
Filter set L5 ET, k	Leica microsystems	11504166	Fluorescence filter set, Ex: 480/40 Em: 527/30
Filter set YFP ET, k	Leica microsystems	11504165	Fluorescence filter set, Ex: 500/20 Em: 535/30
ProScan III	Prior	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Microscope automation controller with interactive control center
EL 6000 light source	Leica microsystems	11504115	External fluorescence light source
Incubator BLX Black	Pecon	11532830	Black incubation chamber surrounding the microscope
Tempcontrol 37-2 digital	Leica microsystems	11521719	Automated temperature control for incubation chamber
Gentmycin sulphate	Carl Roth	0233.4	Gentamycin
Oxytetracylin dihydrate	Sigma Aldrich	201-212-8	Oxytetracyclin
Kanamycin sulphate	Carl Roth	T832.3	Kanamycin
Filtropur BT25 0.2 bottle top filter	Sarstedt	831,822,101	Bottle top filter for sterilization of buffers
Deckgläser	VWR	630-1592	Glass cover slip (60 x 22 mm, thickness: 0.7 mm)
Seakem LE agarose	Lonza	50004	Agarose for microscopy slides
Leica Metamorph AF	Leica microsystems	11640901	Microscope control software and software for picture analysis
Tetraspeck Microsperes, 0.5 µm	ThermoFisher	T7281	Fluorescent microspheres
petri dish	Greiner Bio-one	688102	120 mm x 120 mm x 17 mm squared petri dish for agarose pads
BD Bacto Casitone	Becton Dickinson	225930	Casitone
Parafilm M	VWR	291-1213	Parafilm
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Carl Roth	AE15.2	Tris
Magnesium sulphate heptahydrate	Carl Roth	P027.2	Magnesium sulphate
Potassium dihydrogen phosphate p.a.	Carl Roth	3904.1	Potassium dihydrogen phosphate
1% CTT medium: 1 % (w/v) BD Bacto™ casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4			Cultivation medium for M.xanthus
TPM buffer: 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO4			Buffer for preparation of microscopy slides for M.xanthus