Denne protokol beskriver de nødvendige skridt for at designe og udføre multipleksede målretning af smagsforstærkere med deaktiverende fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, også kendt som forstærker interferens (forstærker-i). Denne protokol giver mulighed for identifikation af smagsforstærkere, der regulerer genekspression og letter dissektion af relationer mellem smagsforstærkere regulerer en fælles mål-genet.
Flere smagsforstærkere regulere ofte et bestemt gen, men for de fleste gener, det er uklart, hvilke smagsforstærkere er nødvendige for genekspression, og hvordan disse smagsforstærkere kombineres for at producere en transcriptional svar. Som millioner af smagsforstærkere er blevet identificeret, høj overførselshastighed værktøjer er nødvendige for at bestemme enhancer funktion på en genome-wide skala. Nuværende metoder til at studere enhancer funktion omfatter gøre genetiske sletninger bruger nukleasen-dygtige Cas9, men det er svært at studere kombinatorisk virkningerne af flere smagsforstærkere ved hjælp af denne teknik, da flere successive klonede cellelinjer skal være genereret. Vi præsenterer her, forstærker-i, en CRISPR indblanding-baserede metode, der giver mulighed for funktionel forhør af flere smagsforstærkere samtidig på deres endogene loci. Forstærker-jeg gør brug af to repressive domæner smeltet til nukleasen-mangelfuld Cas9, SID og KRAB, for at opnå enhancer deaktivering via Histon deacetylation på målrettede loci. Denne protokol udnytter forbigående Transfektion af guide RNA’er aktivere forbigående inaktivering af målrettede områder og er særlig effektiv til at blokere inducerbar transcriptional svar på stimuli i vævskultur indstillinger. Forstærker-jeg er meget specifikke, både i sin genomisk målretning og dens virkninger på globale genekspression. Resultaterne fra denne protokol hjælpe til at forstå, om en forstærker bidrager til Gen-ekspression, størrelsen af bidraget, og hvordan bidrag er påvirket af andre nærliggende smagsforstærkere.
Storstilet sekventering projekter såsom ENCODE1, køreplanen Epigenomics2og FANTOM3 har identificeret millioner af formodede smagsforstærkere inden for det menneskelige genom på tværs af hundredvis af celletyper. Det anslås at hver promotor associates med et gennemsnit på 4,9 smagsforstærkere og hver forstærker kontakter et gennemsnit på 2,4 gener3, tyder på, at Gen-ekspression er ofte et resultat af integrationen af flere distribuerede regulerende interaktioner. En betydelig resterende udfordring er at definere, ikke kun hvordan de enkelte smagsforstærkere bidrage til genekspression, men hvordan de kombineres for at påvirke udtryk. Genetiske metoder er almindeligt anvendt til at identificere relationer mellem smagsforstærkere i modelorganismer fra Drosophila4 til mus5. Men disse forsøg er tidskrævende og lav-overførselshastighed for studiet af flere smagsforstærkere på flere gener.
En metode til at studere enhancer funktion på en stor skala omfatter massivt parallel reporter assays. Disse assays muliggør samtidige screening af tusindvis af DNA-sekvenser for deres evne til at drive et udtryk for en reporter gen6. Mens disse analyser har vist, at DNA-sekvens alene kan være tilstrækkeligt til at formidle gen forordning information7, kommer de med forbehold af udføres uden for den indfødte kromatin sammenhæng og en heterolog promotor. Endvidere er størrelsen af DNA sekvens bliver analyseret i massivt parallel reporter assays normalt mindre end 200 basepairs, hvilket kan udelukke relevante omkringliggende sekvens. Vigtigere, som reporter assays kun måler aktiviteten af en sekvens på et tidspunkt, tager de ikke hensyn til de komplekse relationer, der kan eksistere mellem smagsforstærkere. Således, mens massivt parallel reporter assays kan være oplysende om den iboende aktivitet af en DNA-sekvens, de ikke nødvendigvis informerer os om funktionen af DNA sekvensen inden for rammerne af genomet.
For nylig smuglet udviklede CRISPR/Cas9 værktøjer8 studiet af genregulering da de tillader sletning af smagsforstærkere i den endogene locus. Dog slette flere smagsforstærkere samtidig kan føre til genomisk ustabilitet, og det er tidskrævende at generere successive enhancer sletninger i en enkelt cellelinje. Derudover nye genomisk sekvens er lavet i stedet for sletning efter reparation, og denne sekvens kan få lovgivningsmæssige funktion. En alternativ version af Cas9 er blevet udviklet specielt til modulerende genekspression, afhængige af fusioner af aktivering9,10 eller undertrykke11,12 domæner til formen nukleasen-mangel af Cas9 (dCas9). Disse fusion proteiner er ideelle til at studere flere loci samtidigt, idet de ikke fysisk ændre DNA-sekvens, og i stedet modulere Epigenetik for at afhøre en regulerende region. Den mest udbredte repressive fusion er KRAB, der rekrutterer KAP1 Co repressor kompleks, fremmer aflejring af undertrykkelse-associerede Histon H3 lysin 9 trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-KRAB, også kendt som CRISPR indblanding14, har været brugt til target og skærmen individuelle smagsforstærkere for deres bidrag til gen expression15,16; dog er det ikke blevet optimeret for at målrette flere regioner samtidig. En version af multiplex CRISPR indblanding for smagsforstærkere, mosaik-seq17, bruger enkelt celle RNA-seq som en udlæsning, men denne teknologi er dyre og kun velegnede til undersøgelse af stærkt udtrykte gener på grund af den lave følsomhed af enkelt celle RNA-FF.
Vi forsøgte at udvikle en CRISPR indblanding-baseret metode til dissekere kombinatorisk enhancer funktion inden for rammerne af en transcriptional svar til østrogen. Omkring halvdelen af østrogen-responderende gener indeholder 2 eller flere smagsforstærkere bundet af østrogen receptor alpha (ER) i nærheden18, tyder på, at flere smagsforstærkere kan deltage i østrogen reaktion og forståelse af den lovgivningsmæssige logik ville kræve målrette flere smagsforstærkere samtidigt. Som indledende undersøgelser ved hjælp af CRISPR indblanding på initiativtagere foreslog, at ikke alle projektledere er lige så lydhøre over for KRAB-medieret undertrykkelse19, begrundede vi, at tilføjelsen af en særskilt repressive domæne til dCas9 kan lette deaktivering af forskellige smagsforstærkere. Vi valgte Sin3a interagere domæne af Mad1 (SID)20 da det fører til ansættelse af Histon deacetyltransferase21, som fjerner acetylgrupper på histoner, der er forbundet med transcriptional aktivitet. Vigtigere, SID domænet var effektiv til at reducere genekspression når smeltet dCas922 og TALEs23, og Sin3a har vist sig at være en potent repressive co-faktor i en lang række enhancer sekvens sammenhænge24. Vi brugte SID4x-dCas9-KRAB (forstærker-i) for at målrette 10 forskellige smagsforstærkere bundet af Skadestuen, og identificere ER bindingssteder (ERBS), der er nødvendige for østrogen transcriptional svar på 4 gener18. Vi har også målrettet kombinationer af smagsforstærkere til at identificere de websteder, der samarbejder i produktionen af østrogen transcriptional svar. Vi fandt, at op til 50 websteder kan potentielt være målrettet samtidig med påviselig gen expression ændringer. Brug af ChIP-FF. og RNA-FF., viste vi at forstærker-jeg er en meget specifik teknik til at studere flere smagsforstærkere samtidigt.
I denne protokol beskriver vi de forskellige trin i udførelsen af forstærker-i, en fleksibel teknik, der giver funktionelle studier af flere smagsforstærkere samtidigt i vævskultur omgivelser. Forstærker-jeg er stærkt korreleret med genetiske sletning men giver forbigående deaktivering, der er afhængige af Histon deacetyltransferase (HDAC’er). Ved at levere guide RNA’er via forbigående Transfektion i modsætning til stabil integration via virale vektorer, undgår denne protokol deposition og potentielle spredning af H3K9me3. Denne protokol detaljer guide RNA design og kloning via Gibson forsamling, Transfektion af guide RNA’er ved hjælp af lipofection, og analysen af resulterende genekspression ændringer af qPCR. Vi også omfatte metoder til at vurdere specificiteten af forstærker-i målretning på niveauet af genom og transkriptom. Mens denne teknik blev udviklet for at studere genregulering is bundet smagsforstærkere i menneskelige cancer cellelinjer, gælder for dissektion af enhver pattedyr enhancer.
Denne protokol beskriver en enkel og fleksibel metode til dissekere enhancer funktion i den endogene genomisk locus uden fysisk at ændre DNA-sekvens. Mens samme koncept som tidligere udgivne CRISPR indblanding protokoller ved hjælp af dCas9-KRAB27, forstærker-i adskiller sig fra disse protokoller i 3 vigtigste måder. Først, forstærker-jeg udnytter SIN3A interagerende domæne MAD120 at opnå enhancer deaktivering. Forstærker inaktivering kan reddes ved hjælp af HDAC-hæmmere, tyder på, at den primære mekanisme af deaktivering er HDAC afhængige. I modsætning til CRISPR interferens med dCas9-KRAB fører forstærker-jeg ikke til aflejring af H3K9me3. Det er sandsynligt, at forstærker-jeg er afhængig af forbigående indførelsen af guide RNA’er, med celler høstet på 3 dage post Transfektion. I CRISPR indblanding, er en forøgelse af H3K9me3 observeret på 7 dage post transduktion12. Endelig, forstærker-i-protokollen giver en strategi for at målrette flere steder samtidigt og overvåge effektiviteten af målretning. I mosaik-seq17, dCas9-KRAB bruges til at målrette flere smagsforstærkere samtidigt, men denne teknik er baseret på én celle RNA sekvensering til at identificere udtryk ændringer, og mange gener (såsom østrogen-responderende gener) gå upåagtet hen på grund af lave følsomhed af encellede RNA-FF. Enhancer-jeg giver en pålidelig metode til at studere smagsforstærkere, individuelt og i kombination for enhver gene.
Det mest kritiske trin i Enhancer-jeg er Transfektion, som skulle være optimeret til cellelinie af interesse. Denne protokol er afhængig af puromycin behandling til at berige for transfekteret celler, men det er muligt at co transfecting guide RNA’er med en fluorescerende proteiner og sortering for fluorescerende celler ved hjælp af flowcytometri kan vise sig for at være en bedre berigelse metode for nogle celle typer. Vi anbefaler overvågning udtryk niveau af guide RNA’er og SID4x-dCas9-KRAB af qPCR til fejlfinding og bekræfte Transfektion. Hvis guide RNA er lavt (cyklus tærskel > 30), brugere kan også overveje alternative guide RNA produktion strategier såsom in vitro- transskription28. Det er også muligt, at trods høj gRNA niveauer, guide RNA målretning af SID4x-dCas9-KRAB protein er ineffektive, i hvilket tilfælde vælge forskellige guide RNA sekvenser kan være nødvendigt. Ved at udføre ChIP-seq på fusion protein med kromatin fra Enhancer-jeg behandlede celler, kan effektiviteten af målretning overvåges. Hvis der er højt signal af SID4x-dCas9-KRAB på det pågældende område, og ingen udtryk ændringer i dens formodede target genet er fundet, derefter bidrager regionen sandsynligvis ikke til udtryk af at gen betingelser studerede.
En potentielle begrænsning af forstærker-i er at off-target effekter kan akkumulere hvis for mange websteder er målrettet samtidigt. Alligevel har CRISPR indblanding strategier for knockdown færre off target effekter end RNAi29, især når en polyklonale cellelinje at udtrykke dCas9-KRAB bruges. Mens vi har set ud for målgruppen genomisk bindingen af SID4X-dCas9-KRAB, når målretning 10 lokaliteter samtidigt, har vi ikke identificeret genet udtryk ændringer som følge af disse bindende begivenheder. Som nogle smagsforstærkere kan kontakte flere initiativtagere og/eller andre smagsforstærkere, er det muligt, at mange gener kan ændre udtryk ved målretning af en enkelt enhancer, selvom det er uklart, om denne form for genregulering er fælles. For at bekræfte, at udtrykket ændringer observeret er rettet mod en specifik forstærker, og ikke ud-target effekter, kan brugerne foretage Enhancer-jeg med to forskellige sæt af ikke-overlappende guide RNA’er målretning samme region. Derudover kan den genetiske sletning af regionen ved hjælp af nukleasen-kompetente Cas9 yderligere bekræfte dens virkninger på genekspression.
Som forstærker-i funktioner gennem Histon deacetylation, det er muligt, at dens deaktivering evner er begrænset til smagsforstærkere, der har betydelige niveauer af Histon acetylation. Der er en bred vifte af alternative repressive fusioner, der kan være mere effektive til at målrette specifikke smagsforstærkere. DNA methyltransferase alternativ til dCas9 kan bruges til at reducere genekspression når målrettet til distale smagsforstærkere30, men denne undertrykkelse er ofte ikke forbigående. En anden repressive fusion bruger domænet ven af GATA1 (FOG1), hvilket fører til Histon H3 lysin 27 trimethylation og undertrykker genekspression på et niveau svarende til dCas9-KRAB på tværs af en bred vifte af celle linjer og initiativtagere31. Interessant, reduceret tilføjer flere kopier af FOG1 til dCas9 de repressive potentiale på initiativtagere, tyder på, at en enkelt kopi af domænet SID kan give mere enhancer deaktivering end de 4 eksemplarer i øjeblikket anvendes i forstærker-i. Det er muligt, at nogle loci kan drage fordel af dobbelt målretning af forskellige kombinationer af de ovennævnte dCas9 fusioner. For eksempel, kan stabil lang sigt undertrykkelse opnås ved samtidige transduktion af dCas9-DNMT3a og dCas9-KRAB32. De fleste af disse repressive fusioner har kun været målrettet mod et enkelt locus ad gangen, og det er fortsat uklart, der er mest effektiv til at manipulere med flere smagsforstærkere samtidigt.
Forstærker-i, mens en passende metode til at studere kombinationer af smagsforstærkere til en håndfuld af gener, er stadig noget begrænset i overførselshastighed, hvis brugeren ønsker at studere formodede smagsforstærkere til hundredvis af gener. Fremtidige ansøgninger af denne teknik vil indarbejde imaging-baserede teknologier for at kvantificere flere gener i flere prøver samtidigt. Vigtigere, er disse teknologier kompatibel med direkte påvisning af RNA molekyler fra lysate, eliminerer behovet for tidskrævende RNA isolering. Disse tilpasninger vil lette afhøring af større sæt af smagsforstærkere.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH/NHGRI R00 HG006922 og NIH/NHGRI R01 HG008974 til J.G. og jægeren Cancer Institute. JBC blev støttet af NIH træningsprogram i genetik T32GM007464.
ZR 96-well Quick-RNA Kit | Zymo Research | R1053 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step | Applied Biosystems | 4389986 | |
AflII restriction enzyme | NEB | R0520S | |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531L | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | |
FuGENE HD | Promega | E2312 | |
DNA Clean & Concentrator Kit | Zymo Research | D4013 | |
Buffer RLT Plus | Qiagen | 1053393 | |
b-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | |
Human: Ishikawa cells | ECACC | 99040201 | |
H3K27ac rabbit polyclonal | Active Motif | 39133 | |
H3K9me3 rabbit polyclonal | Abcam | ab8898 | |
FLAG mouse monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
ER alpha rabbit polyclonal | Santa Cruz | sc-544 | |
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid | Addgene | 51133 | Shen et al., 2014 |
gRNA_cloningVector plasmid | Addgene | 41824 | Mali et al., 2013 |
AflII U6 puromycin plasmid | Addgene | 106404 | Carleton et al., 2017 |
SID4X-dCas9-KRAB plasmid | Addgene | 106399 | Carleton et al., 2017 |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads | Kapa Biosytems | KK8420 | |
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | ThermoFisher Scientific | A32959 | |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131035 | |
LB Broth | ThermoFisher Scientific | 10855001 | |
Quick-DNA Miniprep Kit | Zymo Research | D3020 | |
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder | NEB | N0050S |