यह प्रोटोकॉल डिजाइन करने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करता है और निष्क्रिय फ्यूजन प्रोटीन SID4X-dCas9-KRAB के साथ बढ़ाने के मल्टीप्लेक्स लक्ष्यीकरण प्रदर्शन, यह भी बढ़ाने हस्तक्षेप (बढ़ाने-मैं) के रूप में जाना जाता है । इस प्रोटोकॉल को बढ़ाने की पहचान है कि जीन अभिव्यक्ति को विनियमित और बढ़ाने के बीच संबंधों के विच्छेदन की सुविधा के लिए सक्षम बनाता है एक आम लक्ष्य जीन विनियमन ।
कई बढ़ाने अक्सर एक दिया जीन को विनियमित, अभी तक सबसे जीन के लिए, यह स्पष्ट नहीं रहता है जो बढ़ाने के जीन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक हैं, और कैसे इन बढ़ाने के लिए एक transcriptional प्रतिक्रिया का उत्पादन गठबंधन । बढ़ाने के लाखों लोगों की पहचान की गई है के रूप में, उच्च प्रवाह उपकरण एक जीनोम चौड़ा पैमाने पर बढ़ाने समारोह निर्धारित करने की जरूरत है । बढ़ाने के अध्ययन के लिए वर्तमान तरीकों समारोह आनुवंशिक विलोपन nuclease-कुशल Cas9 का उपयोग कर शामिल है, लेकिन यह कई लगातार क्लोनिंग सेल लाइनों के रूप में होना चाहिए इस तकनीक का उपयोग कर, एकाधिक बढ़ाने के मिश्रित प्रभाव का अध्ययन करने के लिए मुश्किल है उत्पन्न. यहाँ, हम बढ़ाने वर्तमान, एक CRISPR हस्तक्षेप आधारित विधि है कि कई बढ़ाने के कार्यात्मक पूछताछ के लिए एक साथ अपने अंतर्जात loci पर अनुमति देता है । बढ़ाने-मैं दो दमनात्मक डोमेन का उपयोग करता है nuclease की कमी Cas9, सिड और KRAB से जुड़े, लक्षित deacetylation पर हिस्टोन loci के माध्यम से बढ़ाने को प्राप्त करने के लिए सक्रियण । इस प्रोटोकॉल लक्षित क्षेत्रों की क्षणिक निष्क्रियता सक्षम करने के लिए गाइड RNAs के क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग करता है और ऊतक संस्कृति सेटिंग्स में उत्तेजनाओं के लिए inducible transcriptional प्रतिक्रियाओं को अवरुद्ध करने में विशेष रूप से प्रभावी है. बढ़ाने-मैं अपने जीनोमिक लक्ष्यीकरण और वैश्विक जीन अभिव्यक्ति पर अपने प्रभाव में अत्यधिक विशिष्ट है । इस प्रोटोकॉल से प्राप्त परिणामों को समझने में मदद कि क्या एक बढ़ाने जीन अभिव्यक्ति में योगदान दे रहा है, योगदान की भयावहता, और कैसे योगदान के अंय आसपास बढ़ाने से प्रभावित है ।
ऐसे सांकेतिक शब्दों में बदलना1, रोडमैप Epigenomics2, और FANTOM3 के रूप में बड़े पैमाने पर अनुक्रमण परियोजनाओं सेल प्रकार के सैकड़ों भर में मानव जीनोम के भीतर ख्यात बढ़ाने के लाखों लोगों की पहचान की है । यह अनुमान है कि ४.९ बढ़ाने और प्रत्येक बढ़ाने के एक औसत के साथ प्रत्येक प्रवर्तक सहयोगियों २.४ जीन की एक औसत3, सुझाव है कि जीन अभिव्यक्ति अक्सर कई वितरित विनियामक बातचीत के एकीकरण का परिणाम है । एक महत्वपूर्ण शेष चुनौती को परिभाषित करने के लिए न केवल कैसे व्यक्तिगत बढ़ाने जीन अभिव्यक्ति में योगदान है, लेकिन कैसे वे अभिव्यक्ति को प्रभावित गठबंधन । आनुवंशिक दृष्टिकोण आमतौर पर Drosophila4 से चूहों5के लिए मॉडल जीवों में बढ़ाने के बीच संबंधों को पहचानने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, इन प्रयोगों के कई जीन पर कई बढ़ाने के अध्ययन के लिए समय लेने वाली और कम प्रवाह कर रहे हैं ।
एक बड़े पैमाने पर बढ़ाने समारोह का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण बड़े पैमाने पर समानांतर रिपोर्टर परख शामिल है । इन परख उनकी क्षमता एक रिपोर्टर जीन6की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए डीएनए दृश्यों के हजारों की एक साथ स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देते हैं । जबकि इन परख पता चला है कि डीएनए अनुक्रम अकेले जीन विनियमन जानकारी7व्यक्त करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, वे देशी क्रोमेटिन संदर्भ के बाहर प्रदर्शन किया जा रहा है और एक heterologous प्रमोटर के साथ के निरंतर के साथ आते हैं । इसके अलावा, डीएनए अनुक्रम का आकार व्यापक रूप से समानांतर रिपोर्टर परख में विश्लेषण किया जा रहा है आमतौर पर कम से २०० basepairs है, जो प्रासंगिक आसपास के अनुक्रम को बाहर कर सकते हैं । महत्वपूर्ण बात, के रूप में रिपोर्टर परख केवल एक समय में एक अनुक्रम की गतिविधि को मापने, वे खाते में जटिल रिश्तों कि बढ़ाने के बीच मौजूद कर सकते है नहीं ले । इस प्रकार, जबकि बड़े पैमाने पर समानांतर रिपोर्टर परख एक डीएनए अनुक्रम के आंतरिक गतिविधि के बारे में जानकारीपूर्ण जा सकता है, वे जरूरी नहीं कि हम जीनोम के संदर्भ में है कि डीएनए अनुक्रम के समारोह की सूचना ।
हाल ही में विकसित CRISPR/Cas9 उपकरण8 जीन विनियमन के अध्ययन की सुविधा के रूप में वे अंतर्जात लोकस में बढ़ाने के विलोपन के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, कई बढ़ाने को एक साथ हटाने से जीनोमिक अस्थिरता पैदा हो सकती है, और यह एक एकल कोशिका लाइन में क्रमिक बढ़ाने वाले विलोपन को उत्पन्न करने के लिए समय लेने वाली है । इसके अलावा, नया जीनोमिक अनुक्रम हटाने के बाद सुधार की साइट पर बनाया जाता है, और यह अनुक्रम विनियामक फ़ंक्शन प्राप्त कर सकते हैं । Cas9 का एक वैकल्पिक संस्करण विशेष रूप से जीन अभिव्यक्ति संग्राहक के लिए विकसित किया गया है,9,10 या दमन11,12 डोमेन Cas9 के nuclease कमी के रूप में सक्रिय करने के संलयन पर निर्भर (dCas9) । ये फ्यूजन प्रोटीन एक साथ कई loci का अध्ययन करने के लिए आदर्श होते हैं क्योंकि वे शारीरिक रूप से डीएनए अनुक्रम में परिवर्तन नहीं करते हैं, और इसके बजाय एक विनियामक क्षेत्र से पूछताछ करने के लिए epigenetics का नियमन करते हैं । सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दमन संलयन KRAB है, जो KAP1 सह दमन परिसर में भर्ती है, दमन के जमाव को बढ़ावा देने के-एसोसिएटेड हिस्टोन H3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3)13। dCas9-KRAB, भी CRISPR हस्तक्षेप14के रूप में जाना जाता है, को लक्ष्य और स्क्रीन जीन अभिव्यक्ति के लिए उनके योगदान के लिए व्यक्तिगत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया है15,16; हालांकि, यह एक साथ एकाधिक क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए ऑप्टिमाइज़ नहीं किया गया है । बढ़ाने के लिए मल्टीप्लेक्स CRISPR हस्तक्षेप का एक संस्करण, मोज़ेक-seq17, एक readout के रूप में एकल सेल आरएनए-seq का उपयोग करता है, लेकिन इस प्रौद्योगिकी महंगा है और केवल अत्यधिक व्यक्त जीन के अध्ययन के लिए उपयुक्त एक सेल की कम संवेदनशीलता के कारण आरएनए-seq.
हम एस्ट्रोजन के लिए एक transcriptional प्रतिक्रिया के संदर्भ में मिश्रित बढ़ाने समारोह विदारक के लिए एक CRISPR हस्तक्षेप आधारित विधि विकसित करने की मांग की । के बारे में एस्ट्रोजन का आधा-उत्तरदायी जीन 2 या अधिक एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (एर) पास के18से बंधे बढ़ाने, सुझाव है कि कई बढ़ाने एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया में भाग लेने जा सकता है, और नियामक तर्क को समझने की आवश्यकता होगी एक साथ कई बढ़ाने लक्ष्यीकरण । के रूप में प्रारंभिक प्रमोटरों पर CRISPR हस्तक्षेप का उपयोग अध्ययन का सुझाव दिया है कि नहीं सभी प्रवर्तक समान रूप से KRAB के लिए उत्तरदाई है-मध्यस्थता दमन19, हम कारण है कि एक अलग दमन डोमेन के अलावा dCas9 को निष्क्रियता की सुविधा हो सकती है विविध बढ़ाने । हमने Mad1 (SID)20 के Sin3a इंटरैक्टिंग डोमेन को चुना है, क्योंकि यह हिस्टोन deacetylases21की भर्ती की ओर जाता है, जो एसिटाइल समूहों histones गतिविधि के साथ संबद्ध है जो transcriptional पर निकालते हैं । महत्वपूर्ण बात, सिड डोमेन जीन अभिव्यक्ति को कम करने में प्रभावी था जब dCas922 और दास्तां23से जुड़े, और Sin3a को बढ़ाने के अनुक्रम की एक किस्म में एक शक्तिशाली दमन सह कारक हो दिखाया गया है24। हम SID4x-dCas9-KRAB (बढ़ाने-i) का इस्तेमाल किया 10 अलग एर द्वारा बंधे बढ़ाने के लक्ष्य, और एर बाध्यकारी साइटों (ERBS) की पहचान है कि 4 जीन18में एस्ट्रोजन transcriptional प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं । हम भी बढ़ाने के संयोजन के लक्षित साइटों है कि एस्ट्रोजन transcriptional प्रतिक्रिया के उत्पादन में सहयोग की पहचान करने के लिए । हमने पाया है कि अप करने के लिए ५० साइटों संभवतः एक साथ जासूसी जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के साथ लक्षित किया जा सकता है । चिप seq और आरएनए-seq का उपयोग कर, हम है कि बढ़ाने का प्रदर्शन किया-मैं एक साथ कई बढ़ाने का अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक विशिष्ट तकनीक है ।
इस प्रोटोकॉल में, हम बढ़ाने-i, एक लचीला तकनीक है कि एक ऊतक संस्कृति की स्थापना में एक साथ कई बढ़ाने के कार्यात्मक अध्ययन में सक्षम बनाता है प्रदर्शन में शामिल कदम का वर्णन । बढ़ाने-मैं अत्यधिक आनुवंशिक विलोपन के साथ संबंधित है, लेकिन क्षणिक निष्क्रियता प्रदान करता है कि हिस्टोन deacetylases (HDACs) पर निर्भर है । वायरल वैक्टर के माध्यम से स्थिर एकीकरण का विरोध के रूप में क्षणिक अभिकर्मक के माध्यम से गाइड RNAs देने के द्वारा, इस प्रोटोकॉल जमाव और H3K9me3 के संभावित प्रसार से बचा जाता है । इस प्रोटोकॉल विवरण गाइड आरएनए डिजाइन और गिब्सन विधानसभा के माध्यम क्लोनिंग, गाइड RNAs lipofection का उपयोग कर के अभिकर्मक, और qPCR द्वारा जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के परिणामस्वरूप के विश्लेषण । हम भी बढ़ाने की विशिष्टता के मूल्यांकन के लिए तरीकों में शामिल है-मैं जीनोम और transcriptome के स्तर पर लक्ष्यीकरण । इस तकनीक को मानव कैंसर कोशिका लाइनों में ईआर बाध्य बढ़ाने के द्वारा जीन विनियमन अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, यह किसी भी स्तनधारी बढ़ाने के विच्छेदन के लिए लागू है.
इस प्रोटोकॉल शारीरिक रूप से डीएनए अनुक्रम बदलने के बिना अंतर्जात जीनोमिक लोकस में विदारक बढ़ाने समारोह के लिए एक सरल और लचीली विधि का वर्णन करता है । जबकि अवधारणा में इसी तरह से पहले प्रकाशित CRISPR हस्तक्षेप dCas9 का उपयोग कर प्रोटोकॉल-KRAB27, बढ़ाने-मैं 3 मुख्य तरीके में इन प्रोटोकॉल से अलग है । सबसे पहले, बढ़ाने-मैं MAD120 के SIN3A बातचीत डोमेन का उपयोग करने बढ़ाने के लिए निष्क्रियता को प्राप्त करने. बढ़ाने निष्क्रियण HDAC अवरोधकों का उपयोग कर बचाया जा सकता है, सुझाव है कि निष्क्रियता के प्राथमिक तंत्र निर्भर HDAC है । dCas9 के साथ CRISPR हस्तक्षेप के विपरीत-KRAB, बढ़ाने-मैं H3K9me3 के जमाव के लिए नेतृत्व नहीं करता है । इस तथ्य यह है कि बढ़ाने के कारण की संभावना है-मैं गाइड RNAs के क्षणिक परिचय पर निर्भर करता है, कोशिकाओं के साथ 3 दिनों के बाद अभिकर्मक में काटा जा रहा है । CRISPR व्यवधान में, H3K9me3 में वृद्धि 7 दिनों के बाद transduction12में मनाया जाता है । अंत में, बढ़ाने-मैं प्रोटोकॉल एक साथ कई साइटों को लक्षित और लक्ष्यीकरण की दक्षता की निगरानी करने के लिए एक रणनीति प्रदान करता है । मोज़ेक में-seq17, dCas9-KRAB एक साथ कई बढ़ाने को लक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन इस तकनीक अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान करने के लिए एकल सेल आरएनए अनुक्रमण पर निर्भर करता है, और कई जीन (जैसे एस्ट्रोजन प्रतिक्रियाशील जीन के रूप में) जाने के कारण पता चला कम एकल-सेल आरएनए-seq. बढ़ाने की संवेदनशीलता-मैं व्यक्तिगत रूप से और किसी भी जीन के लिए संयोजन में बढ़ाने का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करता है ।
बढ़ाने का सबसे महत्वपूर्ण कदम-मैं अभिकर्मक है, जो ब्याज की सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल puromycin उपचार पर निर्भर करता है transfected कोशिकाओं के लिए समृद्ध है, लेकिन यह संभव है कि सह transfecting गाइड एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ RNAs और फ्लोरोसेंट प्रवाह cytometry का उपयोग कर कोशिकाओं के लिए छंटाई के लिए एक बेहतर संवर्धन विधि साबित हो सकता है कुछ सेल के लिए प्रकार. हम qPCR के निवारण और पुष्टि करने के लिए अभिकर्मक द्वारा मार्गदर्शिका RNAs और SID4x-dCas9-KRAB के व्यंजक स्तर की निगरानी करने का सुझाव देते हैं । अगर गाइड आरएनए स्तर कम कर रहे हैं (चक्र दहलीज > 30), उपयोगकर्ताओं को भी वैकल्पिक गाइड आरएनए उत्पादन रणनीतियों पर विचार कर सकते हैं जैसे इन विट्रो प्रतिलेखन28. यह भी संभव है कि उच्च gRNA स्तर के बावजूद, गाइड आरएनए लक्ष्यीकरण SID4x-dCas9-KRAB प्रोटीन अक्षम है, जो मामले में अलग गाइड आरएनए अनुक्रम का चयन आवश्यक हो सकता है. चिप-seq बढ़ाने से क्रोमेटिन के साथ फ्यूजन प्रोटीन पर प्रदर्शन करके-मैं कोशिकाओं का इलाज, लक्ष्यीकरण की क्षमता पर नजर रखी जा सकता है. यदि ब्याज के क्षेत्र में SID4x-dCas9-KRAB का उच्च संकेत है, और इसके ख्यात लक्ष्य जीन में कोई अभिव्यक्ति परिवर्तन का पता चला रहे हैं, तो इस क्षेत्र की संभावना का अध्ययन शर्तों के तहत है कि जीन की अभिव्यक्ति के लिए योगदान नहीं है ।
बढ़ाने की एक संभावित सीमा-मैं है कि बंद लक्ष्य प्रभाव भी कई साइटों को एक साथ लक्षित कर रहे है जमा कर सकते हैं । बहरहाल, पछाड़ना के लिए CRISPR हस्तक्षेप रणनीतियों से कम है RNAi29से लक्ष्य प्रभाव, विशेष रूप से जब एक polyclonal सेल लाइन व्यक्त dCas9-KRAB का प्रयोग किया जाता है । जब तक हम SID4X-dCas9-KRAB के लक्ष्य जीनोमिक बाध्यकारी देखा है जब एक साथ 10 साइटों को लक्षित, हम उन बाध्यकारी घटनाओं का एक परिणाम के रूप में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान नहीं है । के रूप में कुछ बढ़ाने कई प्रमोटरों और/या अंय बढ़ाने से संपर्क कर सकते हैं, यह संभव है कि कई जीन एक बढ़ाने के लक्ष्यीकरण पर अभिव्यक्ति बदल सकते हैं, हालांकि यह स्पष्ट नहीं है अगर जीन विनियमन के इस फार्म का आम है । यह पुष्टि करने के लिए कि अभिव्यक्ति परिवर्तन स्वीकार्य एक विशिष्ट बढ़ाने को लक्षित करने के कारण हैं, और नहीं बंद-लक्ष्य प्रभाव, उपयोगकर्ताओं को बढ़ाने कर सकते है-मैं एक ही क्षेत्र को लक्षित RNAs गैर अतिव्यापी गाइड के दो विशिष्ट सेट के साथ । इसके अलावा, nuclease का उपयोग कर क्षेत्र के आनुवंशिक विलोपन-सक्षम Cas9 आगे जीन अभिव्यक्ति पर इसके प्रभाव की पुष्टि कर सकते हैं ।
बढ़ाने के रूप में-मैं हिस्टोन deacetylation के माध्यम से कार्य करता है, यह संभव है कि अपनी निष्क्रियता क्षमता बढ़ाने के लिए सीमित कर रहे है कि हिस्टोन acetylation के प्रशंसनीय स्तर है । वहां वैकल्पिक दमन संलयन है कि विशिष्ट बढ़ाने को लक्षित करने में अधिक प्रभावी हो सकता है की एक किस्म है । डीएनए methyltransferase फ्यूजन dCas9 करने के लिए जीन अभिव्यक्ति को कम जब बाहर बढ़ाने के लिए लक्षित30इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस दमन अक्सर क्षणिक नहीं है । एक अंय दमनकारी संलयन GATA1 (FOG1) डोमेन है, जो हिस्टोन H3 lysine 27 trimethylation और dCas9 के समान स्तर पर जीन अभिव्यक्ति की ओर जाता है के दोस्त का उपयोग करता है सेल लाइनों और प्रमोटरों की एक किस्म में31। दिलचस्प है, FOG1 की अधिक प्रतियां जोड़ने के लिए dCas9 प्रवर्तकों में दमित क्षमता कम, सुझाव है कि सिड डोमेन की एक प्रतिलिपि वर्तमान में बढ़ाने में इस्तेमाल 4 प्रतियां से अधिक बढ़ाने निष्क्रियता प्रदान कर सकता है-i । यह संभव है कि कुछ loci ऊपर dCas9 संलयन के विभिंन संयोजनों द्वारा दोहरी लक्ष्यीकरण से लाभ हो सकता है । उदाहरण के लिए, स्थिर दीर्घकालिक दमन dCas9-DNMT3a और dCas9-KRAB३२के एक साथ transduction द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । इन दमनात्मक संलयन के अधिकांश केवल एक समय में एक एकल लोकस करने के लिए लक्षित किया गया है, और यह एक साथ कई बढ़ाने से जोड़ तोड़ में सबसे प्रभावी है जो स्पष्ट नहीं रहता है.
बढ़ाने-मैं, जबकि जीन की एक मुट्ठी भर के लिए बढ़ाने के संयोजन के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त तरीका है, अभी भी कुछ हद तक प्रवाह में सीमित अगर उपयोगकर्ता के लिए जीन के सैकड़ों के लिए ख्यात बढ़ाने का अध्ययन करना चाहता है । इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों के एक साथ कई नमूनों में एकाधिक जीन यों तो इमेजिंग आधारित प्रौद्योगिकियों को शामिल करेंगे । महत्वपूर्ण बात, इन प्रौद्योगिकियों lysate से आरएनए अणुओं का प्रत्यक्ष पता लगाने के साथ संगत कर रहे हैं, समय लेने वाली आरएनए अलगाव की जरूरत को दूर करने. इन रूपांतरों को बढ़ाने के बड़े सेट के पूछताछ की सुविधा होगी ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम NIH/NHGRI R00 HG006922 और NIH/NHGRI R01 HG008974 को J.G., और व्याध कैंसर इंस्टिट्यूट द्वारा समर्थित किया गया । J.B.C. जेनेटिक्स T32GM007464 में NIH प्रशिक्षण कार्यक्रम का समर्थन किया था ।
ZR 96-well Quick-RNA Kit | Zymo Research | R1053 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step | Applied Biosystems | 4389986 | |
AflII restriction enzyme | NEB | R0520S | |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531L | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | |
FuGENE HD | Promega | E2312 | |
DNA Clean & Concentrator Kit | Zymo Research | D4013 | |
Buffer RLT Plus | Qiagen | 1053393 | |
b-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | |
Human: Ishikawa cells | ECACC | 99040201 | |
H3K27ac rabbit polyclonal | Active Motif | 39133 | |
H3K9me3 rabbit polyclonal | Abcam | ab8898 | |
FLAG mouse monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
ER alpha rabbit polyclonal | Santa Cruz | sc-544 | |
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid | Addgene | 51133 | Shen et al., 2014 |
gRNA_cloningVector plasmid | Addgene | 41824 | Mali et al., 2013 |
AflII U6 puromycin plasmid | Addgene | 106404 | Carleton et al., 2017 |
SID4X-dCas9-KRAB plasmid | Addgene | 106399 | Carleton et al., 2017 |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads | Kapa Biosytems | KK8420 | |
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | ThermoFisher Scientific | A32959 | |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131035 | |
LB Broth | ThermoFisher Scientific | 10855001 | |
Quick-DNA Miniprep Kit | Zymo Research | D3020 | |
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder | NEB | N0050S |