이 프로토콜 설계 및 다중화 비활성화 융해 단백질 SID4X-dCas9-리아로 알려진 또한 증강 간섭 (증강 인자-i)와 강화의 대상으로 수행 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜 유전자 발현을 조절 하는 강화의 식별을 가능 하 게 일반적인 대상 유전자 규제 강화 간의 관계의 해 부를 촉진 한다.
여러 강화 종종 주어진된 유전자 조절 아직 대부분 유전자에 대 한 그것은 불분명 남아 있는 강화 유전자 발현에 대 한 필요 하 고 어떻게 이러한 강화 결합 transcriptional 응답. 강화의 수백만 확인 되었습니다로 높은 처리량 도구 게놈 넓은 규모로 증강 기능 확인 필요 합니다. 증강 기능 공부에 대 한 현재 방법은 유전자 삭제 nuclease 실력 Cas9를 사용 하 여 만드는 포함 하지만 여러 연속 클론 셀 라인으로이 기술을 사용 하 여 여러 강화의 조합 효과 공부 하기 어려운 생성. 여기, 선물이 증강-i, 그들의 생 loci에서 동시에 여러 강화의 기능 심문 수 CRISPR 간섭 기반 방법. 증강 인자-i 타겟된 loci에서 히스톤 deacetylation 통해 증강 비활성화 달성 하기 위해 융합 nuclease 불충분 한 두 억압 도메인의 Cas9, SID와 리아, 사용 만든다. 이 프로토콜 가이드 대상된 지역의 일시적인 비활성화 수 있도록 RNAs의 과도 transfection를 활용 하 고 특히 조직 문화 설정에서 자극을 유도할 수 있는 transcriptional 응답을 차단에 효과적 이다. 증강 인자-i은 모두 그것의 게놈을 대상으로 글로벌 유전자 발현에 미치는 영향에 매우 구체적인. 이 프로토콜에서 얻은 결과 증강 유전자 발현, 기여, 규모와 어떻게 기여는 영향을 받는 다른 인근 강화에 기여 하 고 있는지 이해 하는 데 도움이.
시퀀싱 프로젝트 인코딩1, 로드맵 Epigenomics2, FANTOM 등 대규모3 확인 했습니다 인간 게놈 내 상 상속 강화의 수백만 수백 종류의 세포에서. 각 발기인 4.9 강화의 평균 연결 하 고 각 증강 연락처 2.4 유전자3의 평균 유전자 발현은 종종 여러 분산된 규정 상호 작용의 통합의 결과 제안 추정 된다. 중요 한 나머지 과제 정의 개별 강화 뿐만 아니라 유전자 발현에 기여 하는 하지만 어떻게 그들이 결합 하 여 식에 영향을 미칠. 유전 접근 일반적으로 쥐5 초파리4 에서 모형 유기 체에 강화 간의 관계를 식별 하는 데 사용 됩니다. 그러나,이 실험은 어렵고 여러 유전자에서 여러 강화의 연구에 대 한 낮은 처리량.
큰 규모로 증강 기능을 공부 하는 한 가지 방법은 대규모 병렬 기자 분석 실험을 포함 한다. 이 분석 실험 기자 유전자6식 드라이브를 그들의 능력에 대 한 DNA 시퀀스의 수천의 동시 상영에 대 한 수 있습니다. 이 분석 실험 DNA 순서 혼자 유전자 규칙 정보7전달 하기 충분할 수 나타났습니다, 그들은 온 네이티브 chromatin 컨텍스트 외부에서 수행 되 고의 주의 분리의 발기인. 또한, 대규모 병렬 기자 분석에 분석 되 고 DNA 시퀀스의 크기는 일반적으로 관련 주변 시퀀스를 제외 시킬 수 있습니다 미만 200 basepairs. 중요 한 것은, 기자가 분석만 한 번에 하나의 시퀀스의 활동 측정, 그들은 할 하지 고려 강화 사이 존재할 수 있는 복잡 한 관계. 따라서, 대규모 병렬 기자 분석 DNA 시퀀스의 본질적인 활동에 대 한 정보를 제공 될 수 있습니다, 그들은 할 하지 반드시 우리에 게는 게놈의 맥락에서 그 DNA 시퀀스의 기능.
최근 개발 된 CRISPR/Cas9 도구8 있다 그들은 내 생 로커 스에서 강화의 삭제에 대 한 허용 유전자 규칙의 연구를 촉진 했다. 그러나, genomic 불안정성으로 이어질 수 있습니다 여러 강화를 동시에 삭제 하 고 그것은 단일 셀 라인에서 연속 증강 삭제를 생성 하는 시간이 소요. 또한, 새로운 게놈 시퀀스 삭제 복구, 다음의 사이트에서 생성 되 고이 시퀀스 규제 기능을 얻을 수 있습니다. Cas9의 대체 버전9,10 활성화 또는 nuclease 불충분 한 형태의 Cas911,12 도메인을 억압의 융해에 의존 하는 유전자 발현을 변조를 위해 특별히 개발 되었습니다. (dCas9)입니다. 이 융해 단백질 그들은 육체적으로 DNA 순서를 변경 하 고 대신 epigenetics 규제 영역을 심문 하기 위해 변조로 여러 loci를 동시에 공부에 이상적입니다. 가장 널리 사용 되는 억압 적인 퓨전 리아, KAP1 공동 진압 복잡 한 신병이 억압 관련 히스톤 H3 리 진 9 trimethylation (H3K9me3)13의 증 착을 홍보입니다. dCas9-리아, 일컬어 CRISPR 간섭14,16; 유전자의 식15,그들의 공헌에 대 한 대상과 화면 개별 강화를 사용 되었습니다. 그러나, 그것은 하지 최적화 되었습니다 여러 영역을 동시에 대상에 대 한. 강화, 모자이크-seq17, 다중 CRISPR 간섭의 한 버전 사용 단일 셀 RNA-seq는 판독 하지만이 기술은 단일 셀의 낮은 감도 때문에 높게 표현한 유전자의 연구에만 적합 하 고 비싼 RNA-이
우리가 스 트로 겐에 transcriptional 응답의 컨텍스트 내에서 조합 증강 기능 해 부에 대 한 CRISPR 간섭을 기반 방법을 개발 하고자 했다. 스 트로 겐-응답 유전자의 약 절반 2 이상의 강화 근처의18, 에스트로겐 수용 체 알파 (응급실)을 준수할 여러 강화 에스트로겐 응답에 참여 하 고 규제 논리 필요 이해 수 있습니다 제안 포함 동시에 여러 명의 강화를 목표로. 초기 연구에서 발기인 CRISPR 방해를 사용 하 여 모든 발기인은 동등 하 게 리아 중재 억압19응답 제안, 우리 dCas9 별개의 억압 적인 도메인 추가의 비활성화를 촉진 수 있습니다 권유 다양 한 강화입니다. 우리 선택 Sin3a 상호 작용 도메인의 Mad1 (SID)20 히스톤 deacetylases21의 채용에 리드에 transcriptional 활동에 연관 된 히스톤 아 세 틸 그룹을 제거 하는. 중요 한 것은, SID 도메인 dCas922 와 이야기23, 융합 하는 때 유전자 발현을 감소에 효과적 이었고 Sin3a 다양 한 증강 시퀀스 컨텍스트24에 강력한 억압 적인 공동 요인이 될 표시 되었습니다. 우리 응급실, 준수할의 다른 강화 10 개를 대상으로 SID4x-dCas9-리아 (증강 인자-i)를 사용 하 고 응급실 바인딩 사이트 (ERBS) 4 유전자18에 스 트로 겐 transcriptional 응답에 필요한 식별 합니다. 우리는 또한 에스트로겐 transcriptional 응답의 생산에 협력 하는 사이트를 식별 하는 증강의 조합 대상. 우리는 50 개 사이트까지 잠재적으로 타겟팅 할 수 있습니다 동시에 감지 유전자 식 변화 발견. 칩 seq와 RNA-seq 사용 하 여, 우리는 증강-i은 여러 강화를 동시에 공부에 대 한 매우 구체적인 기술 시연 했다.
이 프로토콜에서 우리는 증강-i, 조직 문화 설정에 동시에 여러 강화의 기능 연구를 가능 하 게 하는 유연한 기술 수행에 관련 된 단계를 설명 합니다. 증강 인자-i 유전자 삭제와 상관 매우 하지만 히스톤 deacetylases (HDACs)에 따라 달라 집니다 일시적인 비활성화를 제공 합니다. 바이러스 성 벡터를 통해 안정적인 통합 반대 과도 transfection을 통해 가이드 RNAs를 제공,이 프로토콜 증 착 및 H3K9me3의 잠재적인 확산 방지 합니다. 이 프로토콜 세부 정보 가이드 RNA 디자인 및 깁슨 어셈블리의 transfection 통해 복제 RNAs lipofection를 사용 하 여 가이드와 결과 유전자 발현의 분석 정량 하 여 변경. 우리는 또한 게놈 transcriptome 수준에 증강-i 대상의 특이성을 평가 하기 위한 메서드가 포함 됩니다. 이 기술을 연구 개발 하는 동안 어 유전자 규정 강화 인간 암 세포 라인에서 어떤 포유류 증강의 해 부에 적용 됩니다.
이 프로토콜 증강 기능 생 genomic 소재 시에 DNA 순서를 실제로 변경 하지 않고 해 부에 대 한 간단 하 고 유연한 방법을 설명 합니다. 반면 비슷한 개념 dCas9 리아27을 사용 하 여 이전에 게시 CRISPR 간섭 프로토콜, 증강 인자-i는 3 가지 주요 방법으로 이러한 프로토콜에서 다릅니다. 첫째, 증강 인자-i MAD120 증강 비활성화 달성 하기의 SIN3A 상호 작용 도메인을 활용 합니다. 증강 비활성화 HDAC 저 해제, 비활성화 하는 기본 메커니즘 HDAC 의존 하자를 사용 하 여 구출 될 수 있다. CRISPR dCas9-리아와 간섭, 달리 증강-i H3K9me3의 증 착에 연결 되지 않습니다. 사실은 RNAs, 3 일에 수확 되 고 세포 transfection 게시 가이드의 변이 도입에 의존 하는 증강 인자-i이 높습니다. CRISPR 간섭, H3K9me3 증가 7 일 게시물 변환12에서 관찰 됩니다. 마지막으로, 증강 인자-i 프로토콜 여러 사이트를 동시에 대상 및 대상의 효율성을 모니터링할 수 있는 전략을 제공 합니다. 모자이크-seq17, dCas9-리아는 여러 강화를 동시에, 대상 하는 데 사용 됩니다 하지만이 기술은 식 변화를 식별 하는 단일 셀 RNA 시퀀싱에 의존 하 고 (스 트로 겐-응답 유전자) 등 많은 유전자가 들 키 지 않고는 난청 단일 셀 RNA이 증강 인자-i의 감도 개별적으로 강화 연구 조합 어떤 유전자에 대 한 신뢰할 수 있는 방법을 제공 합니다.
증강 인자-i의 가장 중요 한 단계가 이다 transfection, 관심의 셀 라인에 대 한 최적화 되어야 합니다. 이 프로토콜 transfected 세포에 대 한 풍부 하 게 puromycin 치료에 의존 하지만 그 공동 transfecting 가이드 RNAs 형광 단백질 및 형광 셀 cytometry 사용 하 여 정렬 일부 셀에 대 한 더 나은 농축 방법으로 증명할 수 있습니다. 유형입니다. 문제 해결 및 확인 transfection 정량 식 가이드 RNAs의 수준과 SID4x-dCas9-리아 모니터링 하는 것이 좋습니다. 가이드 RNA 레벨은 낮은 경우 (사이클 임계값 > 30), 사용자가 고려할 수 있습니다 또한 대체 가이드 녹음 방송 생체 외에서 28등 RNA 생산 전략. 그것은 또한 가능한 높은 gRNA 수준에도 불구 하 고 가이드 RNA는 SID4x-dCas9-리아 단백질의 대상으로 하는 것은 비효율적, 어떤 경우에 다른 선택 가이드 RNA 시퀀스 할 수 있습니다. 증강 인자-i 치료 세포에서 chromatin와 융합 단백질에 칩 seq를 수행 하 여 대상으로의 효율성을 모니터링할 수 있습니다. SID4x-dCas9-리아, 관심 영역에서의 높은 신호는 그것의 상 상속 대상 유전자 식 변경 감지 하는 경우 다음 가능성이 지역 공부 하는 조건 하에서 그 유전자의 표정에 공헌 하지 않는다.
증강 인자-i의 한 가지 잠재적인 한계는 오프 대상 효과 너무 많은 사이트는 동시에 표적으로 하는 경우 누적 될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 최저 CRISPR 방해 전략 있다 대상 효과 RNAi29, 보다 적은 특히 dCas9 리아 표현 polyclonal 셀 라인을 사용할 때. 우리가 본 SID4X-dCas9-리아의 게놈 바인딩 대상에서 동시에 10 개의 사이트를 대상으로 하는 동안 우리가 하지 그 바인딩 이벤트의 결과로 유전자 식 변경 확인 했습니다. 일부 강화 여러 발기인 또는 다른 강화 연락처 수 있습니다, 비록 유전자 규칙의이 형태는 일반적인 경우에 명확 하지 않다 많은 유전자 단일 증강의 대상으로 시 식에 변경 될 수 있음을 가능 하다. 식 변화는 특정 증강을 대상으로 관찰을 확인 하 고 오프-목표는 아니지만 효과, 사용자가 수행할 수 증강-i 겹치지 가이드 같은 지역 타겟팅 하는 RNAs의 두 가지 세트와 함께. 또한, nuclease 유능한 Cas9를 사용 하 여 영역의 유전자 삭제 추가 유전자 발현에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다.
히스톤 deacetylation 통해 증강-i 기능으로 그것은 그것의 비활성화 능력 histone acetylation 감지할 수준을 강화 제한 가능. 타겟팅 특정 강화에 더 효과적일 수 있습니다 대체 억압 융해의 다양 한이 있다. DCas9 DNA methyltransferase 융해 유전자 발현 원심 강화30, 대상으로 하는 경우를 줄이기 위해 사용할 수 있습니다 하지만이 억압은 자주 과도. 또 다른 억압 적인 퓨전 히스톤 H3 리 27 trimethylation 리드 하 고 다양 한 세포 선 및 발기인31dCas9-리아와 비슷한 수준에서 유전자 발현을 누르는 GATA1 친구 (FOG1) 도메인을 사용 합니다. 흥미롭게도, 발기인, SID 도메인의 단일 복사본 증강-i에서 현재 사용 하는 4 복사본 보다 더 증강 비활성화를 제공할 수 있습니다 제안에 억압 적인 잠재력을 감소 dCas9 FOG1의 더 많은 복사본을 추가 합니다. 그것은 일부 loci 위의 dCas9 융해의 다른 조합에 의해 듀얼 타겟팅에서 이점을 얻을 수 있습니다. 예를 들어 안정적인 장기 억압 dCas9 DNMT3a 및 dCas9-리아32동시 변환에 의해 얻을 수 있습니다. 이러한 억압 적인 융해의 대부분만 타깃이 되어 단일 장소에 한 번에, 그리고 그것은 불분명 남아 있는 여러 강화를 동시에 조작에 가장 효과적 이다.
증강 인자-i, 유전자의 소수에 대 한 강화의 조합을 공부에 대 한 적합 한 방법 동안 사용자 putative 강화 유전자의 수백을 공부 하고자 하는 경우 처리량에 여전히 다소 제한 됩니다. 이 기술의 미래 응용 프로그램 이미징 기반 기술을 여러 샘플에서 여러 유전자를 동시에 계량을 통합할 예정 이다. 중요 한 것은, 이러한 기술은 시간이 걸리는 RNA 격리에 대 한 필요성을 제거, lysate에서 RNA 분자의 직접적인 탐지와 호환 됩니다. 이러한 적응 강화의 더 큰 세트의 심문을 촉진 한다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH/NHGRI R00 HG006922 및 J.G.에 NIH/NHGRI R01 HG008974 그리고 사냥꾼 Cancer 학회에 의해 지원 되었다. J.B.C.는 유전자 T32GM007464에 NIH 연수 프로그램에 의해 지원 되었다.
ZR 96-well Quick-RNA Kit | Zymo Research | R1053 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step | Applied Biosystems | 4389986 | |
AflII restriction enzyme | NEB | R0520S | |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531L | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | |
FuGENE HD | Promega | E2312 | |
DNA Clean & Concentrator Kit | Zymo Research | D4013 | |
Buffer RLT Plus | Qiagen | 1053393 | |
b-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | |
Human: Ishikawa cells | ECACC | 99040201 | |
H3K27ac rabbit polyclonal | Active Motif | 39133 | |
H3K9me3 rabbit polyclonal | Abcam | ab8898 | |
FLAG mouse monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
ER alpha rabbit polyclonal | Santa Cruz | sc-544 | |
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid | Addgene | 51133 | Shen et al., 2014 |
gRNA_cloningVector plasmid | Addgene | 41824 | Mali et al., 2013 |
AflII U6 puromycin plasmid | Addgene | 106404 | Carleton et al., 2017 |
SID4X-dCas9-KRAB plasmid | Addgene | 106399 | Carleton et al., 2017 |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads | Kapa Biosytems | KK8420 | |
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | ThermoFisher Scientific | A32959 | |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131035 | |
LB Broth | ThermoFisher Scientific | 10855001 | |
Quick-DNA Miniprep Kit | Zymo Research | D3020 | |
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder | NEB | N0050S |