Bu iletişim kuralını tasarlayın ve çoğaltılmış arttırıcılar deactivating füzyon protein SID4X-dCas9-KRAB, olarak da bilinen artırıcı girişim (Enhancer-i) ile hedefleme gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Bu iletişim kuralı gen ekspresyonu düzenleyen arttırıcılar tanımlaması sağlar ve ortak bir hedef geni düzenleyen arttırıcılar arasındaki ilişkileri diseksiyon kolaylaştırır.
Birden çok arttırıcılar, genellikle belirli bir gen düzenleyen henüz çoğu genler için bu hangi arttırıcılar gen ekspresyonu için gereklidir ve bu arttırıcılar transkripsiyon bir yanıt üretmek için birleştirmek nasıl belirsizdir. Arttırıcılar milyonlarca tanımlandığı gibi yüksek üretilen iş araçları bir genom geniş ölçekte artırıcı işlevini belirlemek için gereklidir. Nükleaz-usta Cas9 kullanarak genetik silme işlemlerini yapma artırıcı işlev eğitim için geçerli yöntemleri içerir, ancak birden çok ardışık klonal hücre satırı olmalıdır gibi bu tekniği kullanarak birden çok arttırıcılar Kombinatorik etkileri çalışma zordur oluşturulan. Burada, Enhancer-i, onların endojen loci, aynı anda birden fazla arttırıcılar fonksiyonel sorgulama için izin veren bir CRISPR parazit tabanlı yöntem mevcut. Artırıcı-i nükleaz eksikliği için erimiş iki baskıcı etki alanlarının Cas9, SID ve KRAB, artırıcı deaktivasyon histon deasetilasyonu hedeflenen loci, üzerinden elde etmek için kullanır. Bu iletişim kuralı Kılavuzu RNA’lar hedef bölgeleri geçici inactivation etkinleştirmek için geçici transfection kullanır ve doku kültürü ayarları uyaranların indüklenebilir transkripsiyon yanıtlarını engelleme özellikle etkilidir. Artırıcı-i genomik hedefleme ve küresel gen ekspresyonu üzerindeki etkileri hem de çok özel. Bu iletişim kuralı elde edilen sonuçlar bir artırıcı gen ekspresyonu, katkı büyüklüğü ve katkı tarafından yakındaki diğer arttırıcılar nasıl etkilenir katkıda olup olmadığını anlamak için yardımcı.
Büyük ölçekli projeler kodla1, yol haritası Epigenomics2ve FANTOM gibi sıralama3 belirledik insan genomu içinde sözde arttırıcılar milyonlarca hücre türleri yüzlerce arasında. Bu her organizatörü ortalama 4,9 arttırıcılar ile ilişkilendirir ve gen ekspresyonu kez birden çok dağıtılmış düzenleyici etkileşimleri bütünleştirilmesi sonucu olduğunu düşündüren her artırıcı ortalama 2.4 genler3, ilgili kişileri tahmin edilmektedir. Bir önemli kalan sadece tek tek nasıl arttırıcılar gen ekspresyonu için katkıda tanımlamak için mücadeledir ama nasıl ifade etkiler için birleştirir. Genetik yaklaşımlar arttırıcılar fareler5 Drosophila4 model organizmalarda arasındaki ilişkileri tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Ancak, bu deneyler zaman alıcı ve düşük-üretim için birden çok gen, birden çok arttırıcılar çalışma vardır.
Artırıcı işlevi büyük ölçüde çalışmak için bir yaklaşım kitlesel paralel muhabir deneyleri içerir. Bu deneyleri DNA dizileri için yeteneklerini ifade bir muhabir gen6sürücü için binlerce eşzamanlı tarama sağlar. Bu deneyleri DNA dizisi yalnız gen yönetmelik bilgileri7iletmek için yeterli olabilir göstermiştir, onlar yerel kromatin bağlam dışında gerçekleştirilen uyarılar ve kapaklı bir organizatörü ile gelmek. Buna ek olarak, DNA dizisi kitlesel paralel muhabir deneyleri içinde analiz ediliyor genellikle ilgili çevresindeki sıra hariç tutabilirsiniz az 200 basepairs boyutudur. Muhabir deneyleri sadece bir dizi etkinlik teker teker ölçmek. gibi önemlisi, onlar dikkate arttırıcılar arasında bulunabilir karmaşık ilişkiler yapmak değil almak. Kitlesel paralel muhabir deneyleri bir DNA dizisi içsel etkinlikler hakkında bilgilendirici olabilir, böylece, onlar mutlaka bize o DNA dizisi genom bağlamında işlev bilgi yok.
Son zamanlarda gelişmiş CRISPR/Cas9 Araçlar8 kolaylaştırdı gen düzenlemesi çalışmanın arttırıcılar endojen odağı, silme için izin kadar. Ancak, aynı anda birden fazla arttırıcılar silme için genomik istikrarsızlık neden olabilir ve zaman alan ardışık artırıcı silmeleri bir tek hücre satırı oluşturmak için. Buna ek olarak, yeni genomik sıra onarım takip silme sitesinde oluşturulur ve bu dizi düzenleyici fonksiyonu kazanç olabilir. Cas9 alternatif versiyonu özellikle gen ekspresyonu,9,10 etkinleştirme veya11,12 etki alanlarına Cas9 nükleaz eksikliği şeklinde bastırmak füzyon güvenerek oransal için geliştirilmiştir (dCas9). Bu füzyon proteinler onlar fiziksel olarak DNA dizisi alter, bunun yerine bir düzenleyici bölgesi sorgulamak için epigenetik modüle olarak ve aynı anda birden fazla loci eğitimi için idealdir. En çok kullanılan baskıcı KAP1 Co önleyici karmaşık acemi, baskı ilişkili histon H3 lizin 9 trimethylation (H3K9me3)13birikimi teşvik KRAB, birleşimidir. dCas9-KRAB, olarak da bilinen CRISPR girişim14, hedef ve ekran bireysel arttırıcılar gen ifade15,16katkılarından dolayı kullanılmıştır; Ancak, bu aynı anda birden çok bölge hedefleme için optimize edilmiş değil. Çok katmanlı CRISPR girişim arttırıcılar, mozaik-seq17, için bir sürüm tek hücre RNA-seq bir okuma kullanır ama bu teknoloji pahalı ve yalnızca tek hücre düşük duyarlılık nedeniyle son derece ifade genler incelenmesi uygundur RNA-devamı.
Kombinatorik artırıcı işlev bağlamında, östrojen transkripsiyon bir yanıt dissekan için girişim tabanlı bir CRISPR yöntem geliştirmek için çalıştı. Yaklaşık yarısı östrojen duyarlı genlerin birden çok arttırıcılar olabilir östrojen yanıt olarak katılan ve düzenleyici mantık gerektirecektir anlama olduğunu düşündüren östrojen reseptör Alfa (ER) tarafından18, bağlı 2 veya daha fazla artırıcılar içeren aynı anda birden fazla arttırıcılar hedefleme. İlk çalışmalar CRISPR girişim Organizatör kullanarak tüm rehberleri KRAB-aracılı baskı19‘ a eşit derecede duyarlı ettiği gibi dCas9 için ayrı baskıcı etki alanı eklenmesi, etkinliğini kolaylaştırabilir gerekçeli çeşitli arttırıcılar. Histon uyku21, işe alım açar gibi Sin3a etkileşim etki alanı, Mad1 (SID)20 hangi transkripsiyon aktivitesiyle ilişkili histon asetil grupları kaldırmak seçtik. Önemlisi, SID’si etki alanı dCas922 ve TALEs23erimiş zaman gen ekspresyonu azaltılmasını etkili oldu ve Sin3a artırıcı sıra bağlamlarda24çeşitli güçlü bir baskıcı ortak faktör gösterdi. Biz 10 farklı arttırıcılar ER tarafından bağlı hedeflemek için SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i) kullanılan ve östrojen transkripsiyon yanıt 4 genler18için gerekli olan ER bağlayıcı siteleri (ERBS) tanımlar. Biz de östrojen transkripsiyon yanıt üretimde işbirliği siteleri tanımlamak için arttırıcılar kombinasyonları hedefli. En fazla 50 siteler potansiyel olarak aynı anda tespit gen ifade değişikliklerle hedeflenebilir ki bulduk. ChIP-seq ve RNA-seq kullanarak, Enhancer-i aynı anda birden fazla arttırıcılar eğitim için çok özel bir teknik olduğunu gösterdi.
Bu protokol için Enhancer-i, bir doku kültürü ortamında aynı anda birden fazla arttırıcılar fonksiyonel çalışma sağlayan esnek bir teknik gerçekleştirme adımları açıklar. Artırıcı-i genetik silme işlemine son derece ilişkilidir ama histon uyku (HDACs) üzerinde bağlıdır geçici etkinliğini kaldırmayı sağlar. Kılavuzu RNA’ların aksine viral vektörler aracılığıyla kararlı tümleştirme geçici transfection üzerinden sunarak, bu iletişim kuralı ifade ve potansiyel H3K9me3 yayılmasını önler. Bu protokolü ayrıntılar kılavuzu RNA tasarım ve Gibson derleme yolu ile transfection, klonlama RNA’ların lipofection kullanma kılavuzu ve qPCR tarafından elde edilen gen ekspresyon Analizi değiştirir. Biz de Enhancer-i genom ve transcriptome düzeyinde hedefleme özgüllüğü değerlendirmek için yöntemler içerir. Bu teknik eğitim için geliştirilen gen düzenlemesi er arttırıcılar insan kanser hücre hatlarında bağlı, herhangi bir memeli artırıcı diseksiyon için geçerlidir.
Bu iletişim kuralı fiziksel olarak DNA dizisi değiştirmeden artırıcı fonksiyon için endojen genomik locus dissekan için basit ve esnek bir yöntem açıklanır. Benzer olsa da kavram dCas9 KRAB27kullanarak daha önce yayımlanmış CRISPR girişim iletişim kuralları, Enhancer-i 3 ana şekilde bu iletişim kurallarından farklıdır. İlk olarak, Enhancer-i artırıcı devre dışı bırakma ulaşmak için MAD120 SIN3A etkileşen etki alanı kullanır. Artırıcı devre dışı bırakma HDAC inhibitörleri, devre dışı bırakma birincil mekanizma HDAC bağımlı olduğunu düşündüren kullanarak kurtarıldı. CRISPR dCas9-KRAB müdahale, Enhancer-i H3K9me3 birikimi yol açmaz. Gerçeğini Enhancer-i RNA’ların, transfection 3 gün hasat hücreleri ile göndermek Kılavuzu geçici giriş üzerinde dayanır nedeniyle muhtemeldir. CRISPR müdahale, 7 gün mesaj iletim12, H3K9me3 bir artış görülmektedir. Son olarak, birden çok siteyi aynı anda hedef ve hedefleme etkinliğini izlemek için bir strateji Enhancer-i Protokolü sağlar. Mozaik-seq17, dCas9-KRAB aynı anda birden fazla arttırıcılar hedeflemek için kullanılır ama bu tekniği ifade değişiklikleri tanımlamak için tek hücreli RNA sıralama dayanıyor ve (gibi östrojen duyarlı genler) birçok genler nedeniyle düşük undetected gitmek tek hücreli RNA-seq. Enhancer-i duyarlılığını ayrı ayrı ve birlikte herhangi bir gen arttırıcılar çalışmak için güvenilir bir yöntem sağlar.
En kritik artırıcı-i transfection, faiz hücre satırı için optimize edilmelidir adımdır. Puromisindir tedavi transfected hücreler için zenginleştirmek için bu protokolü kullanır ama bu ortak transfecting RNA’ların floresan bir protein ve Kılavuzu akış sitometresi kullanarak floresan hücreleri için sıralama bazı hücre için daha iyi bir zenginleştirme yöntemi olarak kanıtlamak Mayıs mümkündür türleri. İfade düzey kılavuzun RNA’ların ve SID4x-dCas9-KRAB gidermek ve transfection onaylamak için qPCR tarafından izlenmesi tavsiye ediyoruz. Kılavuzu RNA düzeyleri düşüktür (döngüsü eşik > 30), kullanıcılar ayrıca RNA üretim stratejileri vitro transkripsiyon28gibi alternatif Kılavuzu düşünün. Yüksek gRNA düzeyleri rağmen Kılavuzu RNA SID4x-dCas9-KRAB protein verimsiz hedefliyor, bu durumda farklı Seçme Kılavuzu RNA dizilerinin gerekli olabilir olanağı da sağlar. Füzyon proteini ile kromatin Enhancer-i tedavi hücrelerden üzerinde ChIP-seq gerçekleştirerek, hedefleme verimliliğini takip edilebilir. SID4x-dCas9-KRAB adlı bölge ilgi yüksek sinyal ve onun sözde hedef gen ifade değişiklik tespit edilir ise, o zaman büyük olasılıkla bölge okudu koşullar altında bu gen ifadesi için katkı sağlamamaktadır.
Bir potansiyel Enhancer-i çok fazla siteleri aynı anda hedeflenir Eğer hedef kapalı etkileri birikebilir kısıtlamasıdır. Yine de, özellikle dCas9 KRAB ifade poliklonal hücre satırı kullanıldığında CRISPR müdahale stratejileri nakavt için az daha RNAi29, hedef etkileri off olmasını. SID4X-dCas9-KRAB hedef kapalı genomik bağlama 10 site aynı anda hedeflerken gördün mü iken, biz gen ifade değişikliklerin sonucu olarak bağlama olayları belirlenememiştir. Bazı arttırıcılar birden çok organizatör ve/veya diğer arttırıcılar ile temasa geçebilirsiniz, gen düzenlemesi bu tür ortak ise belirsiz olmasına rağmen birçok gen ifade tek bir artırıcı hedefleme üzerine değişebilir mümkündür. İfade değişiklikleri belirli bir artırıcı hedefleme nedeniyle çoğu gözlenen onaylamak ve off-efektler hedef değil için Kullanıcı Kılavuzu aynı bölge hedefleme RNA’ların üst üste iki farklı kümesi ile Enhancer-i gerçekleştirebilirsiniz. Buna ek olarak, nükleaz yetkili Cas9 kullanarak bölge genetik silinmesi daha fazla gen ekspresyonu üzerindeki etkileri onaylayabilirsiniz.
Histon deasetilasyonu, aracılığıyla Enhancer-i işlevleri olarak devre dışı bırakma yetenekleri histon asetilasyon kayda değer düzeyine sahip arttırıcılar sınırlıdır mümkündür. Belirli arttırıcılar hedefleme daha etkili olabilir alternatif baskıcı füzyon çeşitli vardır. DNA metiltransferaz füzyon dCas9 için distal arttırıcılar30‘ a hedef zaman gen ekspresyonu azaltmak için kullanılabilir, ancak bu baskı genellikle geçici değildir. Başka bir baskıcı füzyon histon H3 lizin 27 trimethylation yol açar….. .şarap gen ekspresyonu dCas9-KRAB için benzer düzeyde hücre satırları ve rehberleri31çeşitli, GATA1 arkadaş (FOG1) etki alanı kullanır. İlginçtir, dCas9 için FOG1 daha fazla kopya ekleme rehberleri, SID’si etki alanı tek bir kopyasını şu anda Enhancer-i içinde kullanılan 4 kopya daha daha fazla artırıcı deaktivasyon sağlayabilir düşündüren, baskıcı potansiyel azalır. Bazı loci yukarıdaki dCas9 füzyon farklı kombinasyonları ikili hedefleme üzerinden yararlanabilir mümkündür. Örneğin, istikrarlı uzun vadeli baskı dCas9-DNMT3a ve dCas9-KRAB32eşzamanlı iletim tarafından elde edilebilir. Bu baskıcı füzyon çoğu sadece tek bir odağı bir anda hedef ve aynı anda birden fazla arttırıcılar manipüle en etkili olduğu belirsizdir.
Kullanıcı genler yüzlerce sözde arttırıcılar çalışma isterse enhancer-i, genler, bir avuç arttırıcılar kombinasyonları çalışmak için uygun bir yöntem ise biraz hala’nın üretimi sınırlı. Bu tekniğin gelecekteki uygulamalar aynı anda birden fazla örnekleri içinde birden çok gen ölçmek için görüntüleme tabanlı teknolojiler dahil edecektir. Önemlisi, bu teknolojilerin zaman alan RNA izolasyon ihtiyacını ortadan kaldırarak RNA molekülleri lysate, üzerinden doğrudan tespiti ile uyumlu. Bu uyarlamalar arttırıcılar büyük kümeleri sorgulama kolaylaştıracaktır.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser NIH/NHGRI R00 HG006922 ve NIH/NHGRI R01 HG008974 J.G. için ve avcı Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. J.B.C. genetik T32GM007464 NIH eğitim programında tarafından desteklenmiştir.
ZR 96-well Quick-RNA Kit | Zymo Research | R1053 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step | Applied Biosystems | 4389986 | |
AflII restriction enzyme | NEB | R0520S | |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531L | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | |
FuGENE HD | Promega | E2312 | |
DNA Clean & Concentrator Kit | Zymo Research | D4013 | |
Buffer RLT Plus | Qiagen | 1053393 | |
b-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | |
Human: Ishikawa cells | ECACC | 99040201 | |
H3K27ac rabbit polyclonal | Active Motif | 39133 | |
H3K9me3 rabbit polyclonal | Abcam | ab8898 | |
FLAG mouse monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
ER alpha rabbit polyclonal | Santa Cruz | sc-544 | |
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid | Addgene | 51133 | Shen et al., 2014 |
gRNA_cloningVector plasmid | Addgene | 41824 | Mali et al., 2013 |
AflII U6 puromycin plasmid | Addgene | 106404 | Carleton et al., 2017 |
SID4X-dCas9-KRAB plasmid | Addgene | 106399 | Carleton et al., 2017 |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads | Kapa Biosytems | KK8420 | |
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | ThermoFisher Scientific | A32959 | |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131035 | |
LB Broth | ThermoFisher Scientific | 10855001 | |
Quick-DNA Miniprep Kit | Zymo Research | D3020 | |
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder | NEB | N0050S |