Vi presenterar ett protokoll för effektiv, bulk och snabba kemiska återgång av konventionella härstamning-primade mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) in i en epigenomically-stabil naiva preimplantatorisk epiblast-liknande pluripotenta tillstånd. Denna metod resulterar i minskad härstamning-primade genuttryck och markant förbättring i riktad Multilinjärt differentiering över en bred repertoar av konventionella hPSC linjer.
Naiva mänskliga pluripotenta stamceller (N-hPSC) med förbättrad funktionalitet kan ha en bred inverkan inom regenerativ medicin. Målet med detta protokoll är att effektivt återställa härstamning-Primas, konventionella mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) underhålls på antingen feeder-fri eller feeder-beroende förhållanden till en naiv-liknande pluripotency med förbättrad funktionalitet. Denna kemiska naiva reversion metod sysselsätter den klassiska leukemi hämmande faktorn (LIF), GSK3β, och MEK/ERK hämning cocktail (LIF-2i), kompletterat med endast en tankyrase hämmare XAV939 (LIF-3i). LIF-3i återgår konventionella hPSC till en stabil pluripotenta staten att anta biokemiska, transkriptionell och epigenetiska funktioner i det mänskliga preimplantatorisk epiblast. LIF-3i metoden kräver minimal cell kultur manipulation och är mycket reproducerbara i en bred repertoar av mänskliga embryonala stamceller (hESC) och transgenens-fri mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) linjer. LIF-3i metoden kräver inte ett nytt priming steg före differentiering; N-hPSC kan göras åtskillnad mellan direkt med extremt hög effektivitet och upprätthålla karyotypic och epigenetisk stabiliteter (inklusive på imprinted loci). För att öka metoden universalitet, konventionella hPSC odlas först i LIF-3i cocktail kompletterat med två extra små molekyler som potentierar proteinkinas en (forskolin) och sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signalering (LIF-5i). Detta kort LIF-5i anpassning steg avsevärt förbättrar den ursprungliga klonal expansionen av konventionella hPSC och tillåter dem att vara därefter naiva-återgått med LIF-3i ensam i stora kvantiteter, därmed undanröja behovet av plockning/subkloning sällsynta N-hPSC kolonierna senare. LIF-5i-stabiliserad hPSCs underhålls därefter i LIF-3i ensam utan behov av anti-apoptotiska molekyler. Viktigast av allt, förbättrar LIF-3i reversion markant den funktionella pluripotency av en bred repertoar av konventionella hPSC genom att minska deras härstamning-primade genuttryck och radera interline variabilityen av riktad differentiering vanligen observerats bland oberoende hPSC linjer. Representativa karakteriseringar av LIF-3i-återgått N-hPSC är ges samt experimentella strategier för funktionella jämförelser av syngena hPSC härstamning-primade vs. naiv-liknande staterna beskrivs.
2i (MEK/ERK och GSK3β hämmare) kultur systemet utvecklades ursprungligen för att förfina heterogena serum-baserade mus embryonala stamceller (mESC) kulturer till en enhetlig grundtillståndet hos pluripotency besläktad med musen preimplantatorisk epiblast1. 2i stöder dock inte stabil upprätthållandet av mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) linjer2. De olika komplexa liten molekyl, tillväxtfaktor-kompletteras, och transgena metoder har nyligen rapporterats att fånga förment liknande mänskliga naiva-liknande pluripotenta molekylär påstår2. Dock många av de ”naiva-liknande” staterna skapade med dessa metoder också uppvisade karyotypic instabilitet, epigenetisk defekter (t.ex. global förlust av föräldrarnas genomisk prägling) eller nedsatt differentiering potentiella.
I kontrast, cocktailen av triple kemiska hämning av GSK3β, ERK och tankyrase signalering och leukemi hämmande faktor (LIF-3i) var tillräckligt för den stabila naiva-liknande återgången av en bred repertoar av konventionella hPSC rader3. LIF-3i-återgått naiva hPSC (N-hPSC) underhålls normalt karyotypes och ökade deras uttryck av naiva-specifika mänskliga preimplantatorisk epiblast gener (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i återgång också hPSC med en rad molekylära och biokemiska egenskaper som är unika för mESC-liknande naiva pluripotency som inkluderade ökad fosforyleras STAT3 signalering, minskade ERK fosforylering, globala 5-metylcytosin CpG hypometylering, genome-wide CpG demetylering på embryonala stamceller (ESC)-specifik gen promotorer och dominerande distala OCT4 enhancer användning. Dessutom, i jämförelse med andra naiva reversion metoder som resulterade i aberrantly hypometylering präglade genomisk loci, LIF-3i-återgått N-hPSC var saknar systematisk förlust av präglade CpG mönster eller förlust av DNA methyltransferase uttryck (t.ex. DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
En direkt LIF-3i kultur av ett brett utbud av konventionella mänskliga embryonala stamceller (hESC) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) odlas på antingen matare eller E8 feeder-fria villkor uppnås snabba och bulk återgång till en naiv epiblast-liknande tillstånd. Direkta LIF-3i naiva återgång kan dock ineffektiv i vissa instabila konventionella hPSC linjer på grund av de inneboende genomisk och härstamning-primas variabilitet som härrör från den genetiskt olika givare bakgrunden.
Således, för att bredda nyttan av metoden LIF-3i, en stegvis optimering utvecklades och presenteras häri, som tillåter universell naiva återgång med nästan alla konventionella hESC eller transgenens-fri hiPSC linje odlade på matare. Denna universalized naiv reversion metod sysselsätter ett övergående initiala kultur steg i konventionella hPSC som kompletterar den LIF-3i cocktailen med två ytterligare små molekyler (LIF-5i) som potentierar proteinkinas en (forskolin) och sonic hedgehog (sHH) ( purmorphamine) signalering. En första passage av konventionella hPSC i LIF-5i anpassar dem till efterföljande stabil LIF-3i återgång i stora kvantiteter. Första LIF-5i anpassning avsevärt förstärker den inledande enda cell klonala spridningen av konventionella hPSC odlas på E8 eller matare (före deras efterföljande stabil, kontinuerlig passage i LIF-3i ensam). Konventionella hPSC linjer anpassas först tolerera till en passage i LIF-5i efterföljande bulk klonal passaging av naiva-återgått celler i LIF-3i villkor, vilket undanröjer behovet av plockning och subkloning av sällsynt stabil kolonierna, eller rutinmässig användning av anti-apoptotiska molekyler eller Rho-associerade (ROCK) proteinkinashämmare.
Metoden LIF-3i har lyckat använts att stabilt expandera och underhålla en bred repertoar av > 30 oberoende, genetiskt-diverse konventionella hPSC linjer för > 10 – 30 passager med antingen icke-enzymatiska eller enzymatisk dissociation metoder, och utan tecken på induktion av kromosomala eller epigenetisk avvikelser, inklusive avvikelser på imprinted gen loci. Dessutom sekventiell LIF-5i/LIF-3i kultur är bara naiv reversion metod som hittills har rapporterats som förbättrar den funktionella pluripotency av en bred repertoar av konventionella hPSC linjer genom att minska deras härstamning-primade genuttryck och dramatiskt förbättra sin multipotenta differentiering potens. LIF-3i naiva reversion metod raderar de inneboende interline variabilitet differentiering av härstamning-Primas, konventionella hPSC linjer, och kommer att ha en stor nytta av ansökan inom regenerativ medicin och cellulära behandlingar.
LIF-3i systemet gäller en modifierad version av den klassiska murina 2i naiva reversion cocktail1 mänskliga pluripotenta stamceller. Self-förnyelse av hPSC (som inte kan expandera i 2i ensam) stabiliseras i LIF-2i genom att komplettera denna cocktail med tankyrase-hämmaren XAV939. LIF-3i kultur kan bulk och effektiv återgång av den konventionella hPSC till pluripotenta tillstånd som liknar den mänskliga preimplantatorisk epiblast3. …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag från NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award och The Moseley Foundation.
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
CF1 mouse | Charles river | 023 | |
CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |