Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Химическая Reversion обычных человеческих плюрипотентных стволовых клеток в наивно как состояние с более мультилинейного дифференциация потенции

Published: June 10, 2018 doi: 10.3791/57921
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Мы представляем протокол для эффективной, насыпных и быстрого химического reversion обычных линии загрунтовать человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) в epigenomically-stable наивно Предимплантационная Эпибласт как pluripotent состояние. Этот метод приводит к экспрессии генов снижение линии загрунтовать и заметное улучшение направленного дифференцирования мультилинейного через широкий репертуар обычных hPSC линий.

Abstract

Наивный человеческих плюрипотентных стволовых клеток (N-hPSC) с улучшенной функциональностью может иметь широкие последствия в регенеративной медицине. Цель настоящего Протокола заключается в эффективно восстановить родословную-контроль включён, обычных человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) поддерживается на фидер бесплатно или фидер зависимые условия для плюрипотентности наивно как с улучшенной функциональностью. Этот метод химического наивно реверсии использует классические лейкемии тормозящий фактор (LIF), GSK3β и Мек/ERK ингибирование коктейль (LIF-2i), дополнены только ингибитор tankyrase XAV939 (LIF-3i). LIF-3i будет восстановлено обычных hPSC состоянии стабильной плюрипотентных принятия биохимические, транскрипционный анализ и эпигенетических функций человека предимплантационной Эпибласт. Этот метод LIF-3i требует минимальной клетки культуры манипуляции и высокую воспроизводимость в широкий репертуар эмбриональных стволовых клеток человека (Госкомсанэпиднадзором) и линий трансген свободного человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC). LIF-3i метод не требует повторного грунтовки шаг до дифференциации; N-hPSC могут быть продифференцированы непосредственно с чрезвычайно высокой эффективности и поддерживать karyotypic и epigenomic графену (в том числе на тисненой локусов). Чтобы увеличить универсального метода, обычные hPSC впервые культивировали в коктейль LIF-3i, дополняют два дополнительных малых молекул, которые полифункциональное киназа протеина (форсколин) и Еж Соник (ТСС) (purmorphamine) сигнализации (LIF-5i). Этот краткий LIF-5i адаптации шаг значительно повышает первоначальный клоновых расширения обычных hPSC и позволяет им быть впоследствии наивно вернулась с LIF-3i только в больших количествах, таким образом устраняя необходимость комплектации/subcloning редких N-hPSC колонии позже. LIF-5i-стабилизированный hPSCs поддерживаются впоследствии в LIF-3i только без необходимости анти apoptotic молекул. Самое главное LIF-3i реверсии заметно улучшает функциональные плюрипотентности широкий репертуар обычных hPSC, уменьшив их экспрессии генов линии загрунтовать и стирание интерлайн изменчивость направленного дифференцирования обычно наблюдается среди независимых hPSC линии. Представитель характеристики LIF-3i-отменены N-hPSC условии и экспериментальных стратегий для функциональных сравнения isogenic hPSC в линии загрунтовать против. изложены наивно как государства.

Introduction

2i (Мек/ERK и GSK3β ингибитор) культуры система первоначально была разработана для уточнения гетерогенных мыши на основе сыворотки эмбриональных стволовых клеток (mESC) культуры в единой земли состояние плюрипотентности сродни мыши Предимплантационная Эпибласт1. Однако 2i не поддерживает стабильное поддержания человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) линии2. Различные сложные малые молекулы, фактор роста дополнение, трансгенных подходы недавно сообщалось и захватить предположительно аналогичные человеческих плюрипотентных наивно как молекулярные государств2. Однако многие из «наивно как» государства, созданные с помощью этих методов, также выставлены karyotypic нестабильности, epigenomic дефекты (например, глобальные потери родителей геномный импринтинг), или нарушение дифференцировки потенциал.

В контраст, коктейль тройной химическое ингибирование GSK3β, Эрк и tankyrase сигнализации и лейкемия ингибирующего фактора (LIF-3i) было достаточно для стабильной наивно как reversion широкий репертуар обычных hPSC линии3. LIF-3i-отменены наивно hPSC (N-hPSC) поддерживается нормальное получен и увеличение их выражения человека Предимплантационная Эпибласт наивно конкретных генов (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Стелла (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i реверсии также наделяет hPSC с массивом, молекулярной и биохимической характеристики, уникальные для плюрипотентности mESC как наивный, которая включала увеличилась фосфорилированных STAT3 сигнализации, уменьшилось Эрк фосфорилирование, глобальные 5-обнаружен CpG hypomethylation, геном общесистемной CpG деметилирования в эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)-конкретных генным стимуляторам и доминирующей дистальной OCT4 усилитель использования. Кроме того, по сравнению с других наивной реверсии методов, которые привели к необычно hypomethylated запечатлел геномной локусов, LIF-3i-отменены N-hPSC были лишены систематического потеря тисненой CpG шаблонов или ДНК метилтрансфераза выражения (например, DNMT3B DNMT1, DNMT3A,)3.

Прямого LIF-3i культуры широкий спектр обычных человеческих эмбриональных стволовых клеток (Госкомсанэпиднадзором) и человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) выросла на кормушки или E8 фидер свободных условиях добиться быстрого и сыпучих реверсии наивно Эпибласт как государства. Однако прямого LIF-3i наивно возврат может быть неэффективным в некоторых нестабильных обычных hPSC линии из-за присущего геномных и заливают линии изменчивости, вытекающих из стола генетически различных доноров.

Таким образом, чтобы расширить утилита метода LIF-3i, ступенчатой оптимизации был разработан и представлен здесь, что позволяет универсальный наивно реверсии с почти любой обычных Госкомсанэпиднадзором или hiPSC трансген бесплатная линия культивированный на кормушки. Этот метод возврата универсального наивно использует временные первоначальной культуры шаг в обычных hPSC, которая дополняет LIF-3i коктейль с два дополнительных малых молекул (LIF-5i) которые полифункциональное киназа протеина (форсколин) и Еж Соник (ТСС) ( purmorphamine) сигнализации. Один из первоначальных прохождение обычных hPSC в LIF-5i подстраивается под их последующих стабильных реверсии LIF-3i в больших количествах. Первоначальный LIF-5i адаптации значительно увеличивает первоначальный одноклеточного клоновых распространения обычных hPSC, выращенных на E8 или питатели (до их последующего стабильного, непрерывного прохода в одиночку LIF-3i). Обычные hPSC линии адаптированы сначала один проход в LIF-5i терпеть последующих массовых клоновых пассированый наивно отменены клеток в условиях LIF-3i, который устраняет необходимость комплектации и subcloning редких стабильной колоний или рутинное применение анти apoptotic молекул или Ро связанные белка ингибитора киназы (рок).

LIF-3i метод успешно работали устойчиво расширять и поддерживать широкий репертуар > 30 независимых, генетически разнообразны обычных hPSC линии для > 10 – 30 проходов с использованием методов либо неферментативного или ферментативный диссоциации, и без доказательств индукцию хромосомных или epigenomic аномалии, включая аномалии на тисненой гена локусов. Кроме того, последовательное LIF-5i/LIF-3i культура является только наивный реверсии метод, который до настоящего времени было сообщено что улучшает функциональные плюрипотентности широкий репертуар обычных hPSC линий, уменьшив их экспрессии генов линии-контроль включён и значительное улучшение качества их Multipotent с дифференциация потенции. LIF-3i наивно реверсии метод стирает присущего интерлайн изменчивость дифференциации линии-контроль включён, обычных hPSC линий и будет иметь большой полезности применения в регенеративной медицине и клеточной терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные процедуры выполнялись в соответствии с ухода за животными руководящие принципы и протоколы, утвержденным Джонса Хопкинса Школа медицины институт ухода за животными и использования Комитет (IACUC).

1. Подготовка мыши эмбриональных фибробластов (MEF) для обычных фидер зависимые (Госкомсанэпиднадзором среднего/MEF) или наивно hPSC культура (LIF-3i среднего/MEF)

  1. Приобрести или подготовить внутренние поставки низкий проход MEF питатели CF1 или CF1 x DR4 гибрид E13.5 мыши эмбрионов после опубликованные протоколы4.
    1. Криоконсервировать низкий проход (Р1 Р2) MEF культур до (для долгосрочного хранения) или после (на срок до 6 месяцев) облучения и хранить в жидком азоте как описано4.
    2. Облучение (5000 rad) массовое расширение MEF под p5 с помощью γ - или X-рентген-облучателя и подготовить аликвоты на 1,5 х 106 клеток на флакон для кратковременного хранения (менее 6 месяцев) при температуре-80 ° C в ультра-низкой температуры морозильной камеры.
    3. Пластины между 1,2 х 106 (свеже облученных не замораживают) и 1,5 х 106 (облученных криоконсервированных) MEF в одну 6-ну gelatinized пластина для подготовки подачи культур, как описано ниже.
  2. Подготовьте желатин покрытием 6-ну стерильных пластин культуры ткани лечение путем добавления 1,5 мл стерильного раствора желатина 0,1% для каждой скважины в биологической безопасности кабинета.
  3. Инкубировать желатин покрытием пластин при 37 ° C для по крайней мере 1 час или ночь в инкубаторе Лаборатория CO2 .
  4. На следующий день, оттепель низкий проход (например, P2 для P4), замораживают ДМСО и облученного (5000 rad) MEF согласно шаги указанные ниже.
    Примечание: Необлученных MEF должны также быть оттаяла, расширен и облучены непосредственно перед использованием.
  5. Место криоконсервированных Алиготе MEF в ванну воды 37 ° C. После оттаивания, стерилизовать трубки с этанолом и сразу же разбавляют ДМСО криопротектора по крайней мере 10 раз с MEF среднего (Таблица 1) в пределах биобезопасности кабинета (например передачи 1 мл ДМСО-MEF Алиготе в среду MEF 9 мл стерильного 15 мл конические).
  6. Центрифуга разреженных MEF клетки на 200 x g 5 мин в стерильных 15 мл конические трубы.
  7. В области биобезопасности кабинета аспирационная удалить супернатант свободных клеток и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 – 2 мл свежего MEF среднего.
  8. Аккуратно отменить решение желатина и добавить 2 мл MEF, вновь приостановлено в MEF среднего для каждой скважины gelatinized пластины 6-Ну, как указано выше. MEF количество клеток и пластины 1.2 x 10-6 (свеже облученных не замораживают) или 1,5 х 106 (облученных криоконсервированных) MEF в одну 6-ну gelatinized плиту.
    Примечание: Все клетки культуры пластин, которые передаются от CO2 инкубатора биобезопасности кабинета можно аккуратно протереть бумагой, этанол распыляется но не должен быть распыляется непосредственно на 70% этанол раствором, чтобы избежать распространения этанола в скважинах.
  9. Инкубируйте MEF пластины при 37 ° C ночь в лаборатории CO2 инкубатора (5% CO2, влажная атмосфера) чтобы разрешить вложение, перед использованием.

2. Массовая стабилизации обычных hPSC культур для последующих наивно реверсии с шагом адаптации краткий LIF-5i

  1. Проверка всех обычных hPSC линии для обладающих нормальный кариотип, G-диапазонов, до начала LIF-5i/LIF-3i реверсии.
    Примечание: LIF-3i реверсии линий высокого прохождение обычных hPSC (например., P > 40 – 50) следует избегать, так как эти культуры уже может гавани геномной аберрации, которые могут негативно сказаться стабильных, эффективных и насыпных LIF-3i reversion загрунтовать, convetional hPSC линии.
  2. Поддерживать и расширять обычных hPSC культур с проверенного нормальной получен в систему на основе MEF культуры (как говорится в разделе 1) или систему фидер свободной культуры (по словам следователя предпочтения).
    Примечание: Оба фидера зависимой hPSC/MEF cocultures (например, Госкомсанэпиднадзором средний (Таблица 1) дополняется bFGF 4 – 10 нг/мл) или фидер бесплатно (например., Е8 5 или mTSER 6 СМИ (в соответствии с инструкциями изготовителя по vitronectin покрытием пластин) методы совместимы с массовых наивно реверсии с использованием системы LIF-5i/LIF-3и/MEF (рис. 1). Non ферментативные методы являются предпочтительными для пассированый обычных hPSC до подготовки их для возврата. LIF-5i и LIF-3i СМИ формулировки не содержат антибиотики или противогрибковые агенты. Ожидается, что правила стандартные операции для кабинета стерильности по биобезопасности и поддержания строго соблюдаться чтобы избежать любых бактериальных или грибковых загрязнения.
  3. Для MEF-на основе системы культуры Подготовьте MEF кормушки в пластину gelatinized 6-Ну, как описано в разделе 1 по крайней мере за один день до пассированый LIF-5i-адаптированных обычных hPSC культур.
  4. После того, как обычные hPSC культуры достигли ~ 50% confluency (т.е., 3-5 дней после первоначального покрытия), замените Стандартный Госкомсанэпиднадзором питательной среды LIF-5i среднего (2 мл на хорошо; Таблица 1).
    Примечание: Выполните следующие действия в области биобезопасности кабинета.
  5. Культура и поддерживать обычными hPSC/MEF на срок до 2 дней в LIF-5i в инкубаторе CO2 (5% CO2, влажная атмосфера). Изменение среднего LIF-5i ежедневно адаптировать их для их последующего прохода и стабильное возвращение в LIF-3i.
  6. Кроме того для свободной подачи обычных культур (например, в E8), hPSC культуры в LIF-5i только ночь перед пассированый на следующее утро.
    Примечание: LIF-5i и LIF-3i культур можно оба поддерживаться с атмосферного (21% O2) или физиологические (5% O2) кислорода уровнях CO2 инкубатора (5% CO2, влажная атмосфера).
  7. До пассированый, поместите пластины для культуры в кабинете биобезопасности, мыть LIF-5i-адаптированных обычных hPSC раз с PBS и добавьте 1 mL реагента диссоциации клеток в каждой скважине. Инкубировать на 5 минут при 37 ° C в CO2 инкубатора и осторожно нарезанных с пипеткой в одну ячейку подвеска обратно в кабинете биобезопасности.
    Примечание: Неферментативного диссоциации буферов в качестве альтернативы может использоваться для подготовки единого клетки пассированый.
  8. Собирать суспензию клеток в среде (по крайней мере 2 раза разрежения) Госкомсанэпиднадзором в стерильных 15 мл конические трубы и осторожно нарезанных клетки, закупорить получить одну ячейку подвеска.
  9. Центрифуга на 300 x g 5 мин, аспирационная/удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 – 2 мл LIF-5i среды в кабинете биобезопасности. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева или счетчик автоматический клеток.
  10. Вымойте предварительно покрытием плиты MEF дважды с PBS (2 мл на скважину в 6-ну пластины) и распространять 1 – 2 х 106 клеток (в среде 2 мл LIF-5i) на 1 хорошо промывают PBS MEF пластины.
  11. Настроить и оптимизировать первоначальное покрытие плотности для каждой линии отдельных hPSC быть, наивно вернется, как replating эффективности может быть крайне непостоянны. Место пластину в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера).
    Примечание: Рутинное применение анти apoptotic реагенты не рекомендуется для большинства hPSC линии с помощью этого метода. LIF-5i системы уже значительно повышает первоначальный массовых клоновых повторное хромирование эффективность обычных hPSC линий. Однако одноразового использования ингибитора рок (5 – 10 мкм Y-27632) может улучшить первоначальный LIF-5i клоновых повторно plating эффективность обычных hPSC культур в первый проход для некоторых нестабильных линии загрунтовать hPSC линии с склонность к спонтанной дифференциация.
  12. Если начиная с свободной подачи культур (например, E8), непосредственно передачи одной скважиной диссоциированных обычных hPSC, адаптированы в LIF-5i в один облученных MEF-покрытием хорошо (то есть, проход 1:1).
  13. Следующий день, слегка взболтать пластину поднять все клетки не прилагается, аспирационная среднего (мыть PBS является обязательным) и заменить 2 мл LIF-5i среды. Выполните этот шаг в области биобезопасности, кабинет, ежедневно в течение 3-5 дней, или до тех пор, пока клетки являются 60 – 70% притока (рис. 1). Место пластину в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера).

3. долгосрочное техническое обслуживание и расширение N-hPSC в среде LIF-3i

  1. После первоначального LIF-5i адаптации прохождение последующих стабильных LIF-3i культур каждые 3 – 4 дня в биобезопасности кабинета, или когда культур стали 60 – 70% притока (рис. 1).
    Примечание: LIF-3i культур требуют строгого обслуживания и позволяя N-hPSC культур достичь плотность высокого confluency/клеток от продолжительной культуре (например., > 4 дня) уменьшает последующих клоновых эффективность повторного покрытия и способствует спонтанным дифференциация.
  2. В области биобезопасности кабинета, отказаться от питательной среды и мыть каждый хорошо культуры LIF-5i/LIF-3i, осторожно добавив 2 мл ФСБ. Отменить PBS и добавить 1 мл раствора отряд клеток. Инкубируйте 5 минут при 37 ° C в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера).
  3. Собирать суспензию клеток, добавить Госкомсанэпиднадзором среднего (без ингибиторы или факторы роста (Таблица 1); по крайней мере 2 раза разрежения) восстановить все hPSC и мягко нарезанных клетки, закупорить получить одну ячейку подвеска. Передать подвеска стерильные 15 мл Конические трубки.
  4. Центрифуга на 300 г за 5 мин и аспирата/удалить супернатант. Вновь приостановите Пелле клеток в среде LIF-3i. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева или счетчик автоматический клеток.
  5. Пластину ~ 2 x 105 клеток на хорошо на облученного MEF в пластину gelatinized 6-хорошо для рутинной пассированый LIF-3i культур. Для первоначального LIF-5i-адаптированных культур тарелка изначально более высокой плотности (4 x 105 клеток/хорошо) до первого прохода в LIF-3и/MEF.
  6. Повторно пластины и распространять LIF-5i-адаптированных hPSC на свежие PBS-промывают облученного MEF фидер пластин (подготовленные в предыдущий день, как указано выше) в среде LIF-3i. Замените средство LIF-3i ежедневно.
  7. N-hPSC проход для наименее 4 – 7 непрерывного массового проходы в LIF-3i средних предварительного использования N-hPSC в функциональных исследований или криоконсервирования. Записать количество проходов N-hPSC в любом обычных или LIF-3i СМИ.
    Примечание: LIF-3i реверсии высокой-прохода (например > p40) линии-контроль включён, обычных hPSC линий не рекомендуется. Следует приложить вернуться обычных hPSC линии на минимально возможных проход, что они доступны. Кроме того LIF-3i-вернулся hPSC, прошли более чем 10 LIF-3i проходы не рекомендуется использовать для функциональных исследований, поскольку такие культуры, N-hPSC может гавани karyotypically аномальные клонов из-за длительного клоновых клеточной культуры селекции. Свежий LIF-5i/LIF-3i возврата низкий проход обычных hPSC линий должны проводиться для функциональных исследований, если запасы N-hPSC с < 10 ходов в LIF-3i не доступны.

4. Замораживание и оттаивания LIF-3i-отменены N-hPSC

  1. Разверните узел вернулся N-hPSC для по крайней мере 5-7 проходы в LIF-3i, как указывалось выше, перед использованием в функциональных исследований или долгосрочный криоконсервирования. Запишите количество проходов в обычных условиях и в условиях LIF-3i на каждом криоконсервированных флакона.
    Примечание: Избыток LIF-3i-отменены N-hPSC не используется в функциональных анализов может быть криоконсервированных на каждый проход, но замораживание ниже пост возврат ходов (например., < p3) может привести к плохой, или очень переменной после оттепели восстановления эффективности.
  2. В области биобезопасности кабинета аспирационная питательной среды, вымыть клетки в PBS (2 мл на хорошо), аспирационная PBS и отделить hPSC колоний в отдельные ячейки, используя мобильный отряд решение (1 мл на хорошо). Поместите пластины для 5 минут при 37 ° C в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера). Разбавить раствор отряд ячейки с LIF-3i среднего (2 раза), собирать hPSC в стерильных 15 мл конические, центрифуга клетки на 200 x g 5 мин и Ресуспензируйте Пелле клеток в среде LIF-3i (1 – 2 мл на хорошо эквивалент). Подсчитать количество ячеек с помощью Горяева или счетчик автоматический клеток.
  3. Центрифуга N-hPSC в среде LIF-3i (200 x g 5 мин) и Ресуспензируйте клетки в кабинете биобезопасности в замораживания раствора (Таблица 2), на плотности по крайней мере 1 x 106 клеток/мл.
  4. Клетки перехода в долгосрочного хранения криогенных трубы и поместите в контейнер медленно замораживания. Разрешить образцы заморозить на ночь в холодильнике-80 ° С.
  5. Следующий день, передача криопробирки в морозильной камере жидкого азота для длительного хранения.
  6. Для размораживания, поместите замороженные флакона в ванну воды 37 ° C ~ 2 мин Стерилизируй-отпусти флакона (то есть, этанол спрей), передачи hPSC в стерильных 15 мл конические и медленно разбавлять средство десятикратного в Госкомсанэпиднадзором клетки (Таблица 1), дополнены 5 мкм из Ро связанные белка ингибитора киназы (рок) Y-27632 в стерильных биологической безопасности капот кабинета.
  7. Центрифуга на 200 x g за 5 мин. В биобезопасности кабинета отказаться от свободной ячейки супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в LIF-3i среднего (1 – 2 мл) дополнены 5 мкм рок ингибитор Y-27632.
    Примечание: Исключение Y-27632 приведет к бедным после оттаивания эффективность восстановления (рис. 2).
  8. Передача талой клетки высокомобильна в LIF-3и/рок ингибитор на PBS-промывают лунки MEF-покрытием. Криоконсервировать LIF-3i культур на плотности 1 х 106 клеток на флаконе. Каждый из этих флаконов на кормушки в одной скважине gelatinized пластины 6-ну оттепели.
  9. Следующий день, начало регулярного LIF-3i средних расширения без ингибитора киназы Ро.

5. фидер удаления для сбора образцов N-hPSC

  1. Для подготовки образцов из ЛИФА 3и/MEF (или Госкомсанэпиднадзором/MEF обычных) культур (т.е., для экспрессии генов (например, количественного RT-PCR, microarrays) или анализ белков (например, Западная помарка), разрушающим LIF-3i культур от MEF питателей с помощью Магнитные активирован ячейку Сортировка (ПДК) с антитела анти TRA-1-81 покрытием микрошарики согласно протоколу производителя.
  2. Можно также используйте следующий простой метод предварительного покрытия истощать культур кормушки, как описано ниже.
  3. В стерильные биологической безопасности капот кабинета удалить супернатант свободных клеток, помыть лепешка с PBS 2 мл стерильного за хорошо. Отсоедините адэрентных LIF-3и/MEF культур с использованием клеток отряд решение (1 мл/хорошо). Инкубируйте 5 мин в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера). Соберите hPSC в стерильных 15 мл конические. Мыть два раза в Госкомсанэпиднадзором средний, передачи клетки в стерильных 15 мл конические и центрифуги на 200 x g за 5 мин.
  4. В биобезопасности кабинета, вновь приостановить каждую лунку LIF-3и/MEF отделить клеток в 2 мл среды, LIF-3i и непосредственно перенести на новую скважину пластины 6-Ну что с 0,1% желатина свежезаваренным покрытием.
  5. Инкубируйте LIF-3и/MEF hPSC клетки за 1 ч при 37 ° C в инкубатор CO2 (5% CO2, влажная атмосфера). Сбор не сторонник клетки с пипеткой в новой Конические трубки. Аккуратно добавить 2 мл Госкомсанэпиднадзором среды в каждой скважине и вихрем собрать оставшиеся ячейки non сторонник.
    Примечание: Большинство из облученного MEF будет приложить к gelatinized пластины в 1 h, оставляя большинство hPSC в суспензии.
  6. Объединить и центрифуги клетки на 300 x g 5 мин мыть в PBS. Snap замораживание клеток Пелле в жидком азоте после центрифугирования, или же вновь приостановить окатышей в лизировать буфер, который совместим с течению анализ белков и нуклеиновых кислот (рис. 2B).
  7. Выполняйте характерные признаки LIF-3i hPSC линии с соответствующих обычных загрунтовать isogenic hPSC управления.
    Примечание: Из-за внутренней изменчивости между и внутри загрунтовать культур, в соответствующий timepoint в культуре или до наивно реверсии готовят соответствующие элементы управления. Подробные протоколы и материалы для вниз по течению immunofluorescent bioimaging, поток цитометрии, Западный blotting, экспрессии генов (ПЦР-анализов и microarrays), метилирование исследования (точка помаркой, microarray метилирования CpG), OCT4 проксимальном и дистальном enhancer 3других предоставляются преобладание репортер анализов и сигнализации ингибитор анализов.

6. должность наивно реверсии: Проверка целостности геномных и удержания родительских отпечатки LIF-3i-отменены N-hPSC до использования в функциональных анализов

  1. Экран начальной загрунтовать, обычных hPSC культур за владение нормальный кариотип (например, с Гимза полосный окрашивание анализ с использованием опубликованных методы 7) до начала реверсии LIF-5i/LIF-3i.
    Примечание: Это для ликвидации обычных hPSC населения, которые могут гавани аномальные геномных изменений, которые могут управлять преимущество артефакта селективного выживания в условиях клоновых LIF-3i.
  2. Для получения оптимальных результатов, свежезаваренным вернуться обычных hPSC культур в наивно как состояние с LIF-3i несколько недель до их использования в функциональных исследований или направленного дифференцирования.
    Примечание: Процедура затягивается «техническое обслуживание» культуры в условиях LIF-3i для более чем 10 отрывков, которые не рекомендуется использовать следующие наивно реверсии. Рутинной расширение и обслуживание линий Госкомсанэпиднадзором и hiPSC должны выполняться с использованием обычных культуры систем (например, в E8, или MEF/Госкомсанэпиднадзором средних с bFGF).
  3. Оценить после возвращенной строки N-hPSC для сохранения нормальной karyotypes 5 – 7 места после LIF-3i реверсии (например. с Гимза полосами, окрашивание анализ7, или любой другой метод выбора).
  4. Оценить все восстановлено N-hPSC линии для сохранения нормальных родительских геномной отпечатки путем анализа метилирования ДНК по выбору (например, протоколы, CpG ДНК анализ microarray родительских отпечатки в LIF-3i-отменены N-hPSC предоставляются в других местах3 ) после 5 – 10 ходов реверсии LIF-3i.

7. пост наивно реверсии: Экспериментальный дизайн руководящие принципы для анализов количественных направленного дифференцирования, используя LIF-3i-отменены N-hPSC

  1. Непосредственно используйте LIF-3i N-hPSC в установленных направленного дифференцирования протоколы без дополнительных клетки культуры манипуляции.
    Примечание: Повторная грунтовки (т.е. преобразование N-hPSC обратно в обычных загрунтовать условий до их использования в направленного дифференцирования анализов) не является необходимым с методом LIF-3i и не рекомендуется.
  2. Для контроля для воздействия пробирного и интерлайн изменчивости в функциональное тестирование отдельных hPSC линий, перекрестной проверки линии конкретных дифференциация потенции, используя протоколы независимых дифференциации с по крайней мере три hPSC линий, полученных от независимых генетических стола (то есть, несколько доноров производные hiPSC и Госкомсанэпиднадзором).
  3. Для сравнения функциональных установите родственных культур, в число эквивалентных проход и от той же линии (isogenic) hPSC параллельно с обычными загрунтовать линии и LIF-3i-вернулся hPSC культур. Поддерживать загрунтовать/наивные брат isogenic hPSC культур в их соответствующих средствах массовой информации (например., Е8 против. LIF-3i) и одновременно дифференцировать с использованием идентичных дифференциация протоколы и материалы, чтобы устранить любой экспериментальной смещения (рис. 4).
  4. Для isogenic заливают против наивно hPSC сравнения, настроить и оптимизировать первоначальное покрытие плотности для каждого индивидуального дифференциация assay.
    Примечание: Подробные протоколы для нейронных прародителя, окончательное энтодермы и онко эндотелиальная направленного дифференцирования LIF-3i-отменены N-hPSC предоставляются в другом месте 3. LIF-3i-отменены N-hPSC имеют более мощного потенциала пролиферативных и дифференциация в направленного дифференцирования анализов, чем обычные hPSC. N-hPSC обычно требует более низкой концентрации первоначального покрытия, чем обычные hPSC, и в отличие от их обычных загрунтовать hPSC коллегами, не требуется использование анти apoptotic реагенты для повышения их клоновых выживание после ферментативные пищеварение в дифференциации анализов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол оптимизирует эффективный возврат наивно как с LIF-3i в обеих культурах фидер зависимых и фидер независимые линии загрунтовать обычных hPSC (рис. 1). Подробный протокол, описанные здесь, контуры последовательная адаптация к LIF-3i, начиная от либо hPSC фидер зависимые или свободной подачи обычных условий (например E8 средний).

Представитель результаты для LIF-3i возврат нескольких обычных Госкомсанэпиднадзором и бесплатно трансген hiPSC линии представлены в рисунки 1-3. Эти типичные результаты могут быть проверены с линии коммерчески доступных Госкомсанэпиднадзором H9, или с коммерчески доступных свободных трансген, пуповинной крови производные episomal hiPSC линия (6.2) получены в лаборатории ЗАМВИДИС8,9. Введение в качестве первого шага адаптации LIF-5i позволяет высоко эффективных последующих, массовая клоновых распространения обычных hPSC культур в LIF-3i и не требует анти apoptotic агентов или рок ингибиторы10 (рис. 1A, B ). Несколько пластин наивно как hPSC, который может быть быстро пробы для вниз по течению анализов или multilineage направлены дифференциация только после 5-7 проходы в LIF-3i. Кроме того LIF-3i культур может быть криоконсервированных для будущих приложений. После отогрева клетки восстановления может быть улучшена (рис. 2) посредством включения ингибитора рок криоконсервирования и после оттепели media11.

Детерминанты молекулярных и функциональных плюрипотентности, оба в пробирке и в эмбрион были недавно рассмотрены2. Эти факторы включают в себя генетический фон, связанные культуры приобретение мутаций для развития ключевых генов и различия в Госкомсанэпиднадзором и культуры методологий и hiPSC наследования. Представлена ниже приводится краткое изложение стандартных анализов, которые могут быть использованы для квалификации и проверки фенотипические, молекулярной и функциональных pluripotencies LIF-3i-отменены hPSC.

Колонии морфология
Переход между системами загрунтовать, обычных и LIF-3i-отменены культуры сопровождается отдельных физических изменений в hPSC колонии морфологии (рис. 1Б). Обычные hPSC клетки размножаются как плоский, широкий монослоя колоний, которые быстро расширяться от маленькой камере сгустки (на MEF или фидер свободных условий), но плохо, как отдельные клетки. Воздействие обычных hPSC линий LIF-3i способствует росту и расширению и меньше, плотно упакованы, куполообразной формы колоний, которые возникают клонально от одной клетки. Эти морфологические изменения полностью обратимы, а LIF-3i-отменены куполообразной формы колоний могут спонтанно перехода обратно в обычных монослоя морфология если сняты LIF-3i и клетки повторно культивировали в стандартных обычных Госкомсанэпиднадзором среднего дополнены bFGF. Кроме того расширение LIF-3i-отменены клеток на высоких плотностях вырожденная (или продолжительной культуре не частой пассированый) приводит к спонтанной уменьшаем плоские, обычных морфология с сокращением клоновых эффективности; подчеркивая необходимость добросовестного обслуживания и ухода за ними LIF-3i-вернулся hPSC (например., < слияния 40 – 60%).

Живут иммунофлюоресценции окрашивание и гранулярных анализ поверхности плюрипотентности маркеров потока
Оценка плюрипотентности маркеров во время перехода от обычного к наивно как состояние, в котором следующие непрерывной LIF-3i культура может быть проконтролированы неинвазивно живой антитело пятная без обнаружения любого негативного воздействия на расширение (LIF-3и/MEF например., жить окрашивание флюрохром конъюгированных антител против TRA-1-81, TRA-1-60 и SSEA4).

Удержание плюрипотентности во время LIF-3i реверсии может также регулярно контролироваться анализа потока гранулярных плюрипотентности связанные поверхности маркер выражения TRA-1 и SSEA антигены во время одной ячейки пассированый (рис. 1C) или иммунофлюоресценции по нетронутым, фиксированной колоний в situ (рис. 3). Хотя эти маркеры не делают различий между обычными и LIF-3i государства, их уровни обратно коррелирует с частота спонтанного дифференциации, которая может возникнуть в hPSC при переходе от обычного hPSC к условиям LIF-3i. Дополнительные поверхности антигены, которые могут более конкретно Марк человека наивно как государства в пробирке2,12,13 также могут быть использованы для выявления эффективных реверсии hPSC LIF-3i.

Проверка молекулярных плюрипотентности N-hPSC
Потому что генетический фон hPSC линий было охарактеризовано как сильный вклад интерлайн изменчивости, важно тщательно оценить isogenic культур на соответствие культуры timepoints при сравнении систем культуры hPSC (рис. 4). Поскольку некоторые из этих систем уже были показаны для создания hPSC населения с аномальным геномных и эпигеномные конфигурации2, любой метод реверсии наивно следует assayed с числом N-hPSC независимых генетических особенностей, в духе Это достаточно для проверки биологических воспроизводимость и исключить-развивающих соответствующих «псевдо плюрипотентных» государств (т.е., с очевидной клейма молекулярной плюрипотентности, но не хватает способности функциональной дифференциации). Циммерлин и др. дальнейшее расширение проверки системы культуры LIF-3i включить опробование молекулярных и функциональной pluripotencies восстановлено N-hiPSC, полученных от различных методов перепрограммирования, который вносит еще один известный предполагаемого функционального изменчивости между плюрипотентных государств2.

Соответственно, большинство исследований систем культуры человека наивными были сосредоточены на опробование молекулярной плюрипотентности N-hPSC в 1) эпигеномные уровень (например, гистонов знаки чип последовательности или чип-PCR, глобальные метилирования дна путем иммуноблотов или всех genomic Гидросульфит последовательности, microarrays метилирования CpG Аллел Специфически, OCT4 усилитель преобладающее использование систем репортер, глобальной активности на нормативных элементов DNAse я Гиперчувствительность и повторить элемент профилирования РНК последовательности), 2) транскриптомики уровень (РНК последовательности, выражение microarrays и количественного RT-PCR), анализ выражения протеина (например., FACS, immunofluorescent микроскопии и Западный blotting) и 3) через метаболических исследованиях (например, гликолиза, смазывание фосфорилирование и никотинамид метаболизма). Показательные примеры иммунофлюоресценции пятен и Западная помарка обнаружения выражения для ключевых маркеров молекулярных плюрипотентности показаны (рис. 3B, C). Например показано на рисунке 3B являются Активированный фосфорилированных (фосфо) и общая изоформ STAT3 и ERK1/2, которые являются ключевой молекулярный клейма мыши ESC-как наивный плюрипотентности. Они были обнаружены с помощью первичных антител анти STAT3 и анти ERK1/2. Кроме того функциональные плюрипотентности в тератома дифференциация анализов проявляется в обычных vs. LIF-3i-вернулся hPSC тератома тканей расчлененный 10 недель после инъекции и исправлена в 4% формальдегида и парафин встроенных (рис. 3D).

Подготовка LIF-3и/MEF или Госкомсанэпиднадзором/MEF/bFGF образцов для вниз по течению молекулярный анализ должен включать MEF истощения. Два подхода описаны выше для MEF истощения, которые успешно применялись в нашей лаборатории. Предварительное покрытие MEF является простой, надежный, и экономически эффективным методом для устранения кормушки из N-hPSC образцы для молекулярных исследований и является предпочтительной альтернативой СУИМ или MACS разделения (т.е., анти TRA-1-81 или анти TRA-1-60 на основе антител разделения ). Кроме того спонтанно дифференцируя TRA-1-отрицательных адэрентных клеток в LIF-5i/LIF-3i культур могут быть быстро устранены LIF-5i/LIF-3i N-hPSC культур до последующих LIF-3i проход на свежие MEF, предварительное покрытие ферментативно переваривается отдельные ячейки для 1 h на тарелках, предварительно покрытием с 0,1% желатина (рис. 2).

Оценка функционального плюрипотентности N-hPSC
Самые строгие пробирного функциональных плюрипотентности PSC является бластоциста пробирного инъекции химера, который ограничен в тестировании N-hPSC линии по этическим соображениям. Кроме того несколько групп, которые сообщили о поколения N-hPSC с различными другими методами пытались создавать межвидовой химер. Однако эти попытки привели к крайне низкий или неудачной вклад дифференцированной N-hPSC линий для мышиных или свиных эмбрионов, по сравнению с химеры мощностей стандартной мыши ESC2.

Дополнительные функциональные исследования исследовали направлено в vitro дифференциация предполагаемого N-hPSC, полученных с помощью различных методов, но показали предвзятым, неисправный или уменьшилась мультилинейного дифференциация емкости, с сопутствующими укрывательство эпигеномные аномалии2,13. Аналогичные epigenomic аберраций, особенно на тисненой локусов, были обнаружены в мыши ESC после увеличиваемой подвержения к LIF-2i коктейль14. Интересно, что некоторые системы культуры реверсии сообщили глобальные улучшения конкретных атрибутов функциональной плюрипотентности PSC например расширение возможностей для вклада в vivo трофоэктодерму2,15 .

С помощью обширной коллекции независимо вывел LIF-3i-вернулся hPSC, Циммерлин et al. занято мультилинейного дифференциация анализов, чтобы показать, что система LIF-3i значительно улучшает функциональные плюрипотентности обычных hPSC линии 3. Это позволяет систематический анализ обычных против LIF-3i hPSC линии isogenic парами для устранения отклонений, интерлайн зависимые (рис. 4). LIF-3i-вернулся hPSC линий не требуется повторно грунтовки шаг до дифференциации EB. Однако LIF-3i hPSC размножаются значительно более высокими темпами клоновых чем isogenic клетки в E8, и таким образом, первоначальные нижней плотности покрытия требуют регулировки позволяют каждой культуры до впадения в аналогичных timepoint.

Следователи должны регулярно использовать несколько анализов продемонстрировать повышение функциональности LIF-3i-вернулся hPSC, который включает в себя не только в естественных условиях тератома анализов, но и в пробирке направлены дифференциация анализов для нервных, окончательное энтодермы и hematovascular линий3 с использованием нескольких анализов (например, 2D Апель3,16 и17,18 систем 3D embryoid тела). Для управления для зависящих от пробирного воспроизводимости, по крайней мере два различных дифференциация методы должны выполняться в репликации для каждой пары isogenic заливают/LIF-3i hPSC культур (например, Рисунок 4, Апель, embryoid тела дифференциация протоколы). Экспериментальный дизайн должен включать ряд надежных (например, > 3 – 5) заливают/LIF-3i isogenic пар hPSC линии из нескольких независимых доноров генетических стола (рис. 4).

Figure 1
Рисунок 1: Поэтапный переход обычных, линии загрунтовать hPSC культур к условиям наивно как с помощью метода LIF-3i. (A) схему протоколов для поэтапного реверсии LIF-3i. (Верхняя схема) Общий метод для перехода загрунтовать, обычных hPSC LIF-3i культур. (Схема внизу) Две сводные стратегии LIF-3i наивно reversion обычных (заливают) hPSC, культивируемых на фидер (т.е., LIF-3и/MEF/MEF, ПРИМЕД), либо фидер свободных условий (т.е., ПРИМЕД/E8 в LIF-3и/MEF). (B) человека PSC морфологии. Изображены представитель микрофотографиями hPSC во время возврата LIF-3i, использование коммерчески доступных человека episomal iPSC линии (6.2). Показано переходы наблюдается между первоначальной обычных плоских монослоя колоний, и последующего куполообразная колониеобразования колоний, которые возникают после прохода в промежуточных LIF-5i и стабильных условий культуры LIF-3i. Масштаб баров = 200 µm. (C) представитель потока гранулярных анализ плюрипотентности поверхностных маркеров. Показаны являются TRA-1-81 и SSEA-4 поверхности выражения в обычных hPSC линии 6.2 (p40) расширил E8, первоначальный проход в LIF-5i/MEF и следующие отрывки 1 до 9 (P1-P9) в условиях LIF-3i. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Криоконсервирования N-hPSC и подготовка проб путем предварительного покрытия MEF. (A) пример цикла замораживания/оттаивания LIF-3и/MEF культур. Обычными шнур крови производные, неинтегрированных, бесплатно трансген человека iPSC линии E5C3 был производным и расширена на кормушки MEF в среде Госкомсанэпиднадзором дополнена bFGF 4ng/мл для 18 ходов. Обычные, линии загрунтовать E5C3 были адаптированы в LIF-5i (слева) и перешли в LIF-3i среднего для 3 проходов (центр). Клетки E5C3 LIF-3i, показаны на панели центра были криоконсервированных с помощью на основе ДМСО криопротектора среднего (Таблица 2; 1 х 106 клеток на флаконе) и сохраняющихся в жидком азоте). Один флакон был разморожен спустя месяц и E5C3 клетки были переведены в фидер покрытием хорошо из 6-ну плиты (справа). Восстановление клеток может быть увеличена путем дополнения LIF-3i средних с 5 мкм Y-27632 на только один день после оттепели. Масштаб баров = 200 мкм. Ликвидация MEF (B) (а также адэрентных клеток TRA-отрицательных продифференцировано) в LIF-3и/MEF hPSC культур методом предварительного покрытия. Изображены потока гранулярных анализ до и после предварительной плакировка конъюгированных PE анти TRA-1-81 и тра-1-60 антител, конъюгированных APC SSEA-4 антител и SSEA-1/CD15 антител, демонстрируя истощение TRA-1 антигена негативные и MEF клеток с использованием один час перед обшивкой метод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Характеристика плюрипотентности LIF-3и/MEF N-hPSC культур. (A) плюрипотентности поверхности и ядерных маркеров. Выражение плюрипотентности фактор NANOG в же (isogenic) тра-1-81+SSEA4+ обычных, заливают пуповинной крови производные hiPSC линии E5C3 (p39) расширил в загрунтовать (E8), либо наивные LIF-3i (+ p8 в LIF-3и/MEF) условий. Immunofluorescent пятна представитель hPSC культур на слайдах камеры показали равномерное, ядерной выражение основных фактора плюрипотентности NANOG в SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC культивировали в загрунтовать, обычные (E8 средний) или LIF-3и/MEF условий. Шкалы бар = 100 µm. (B) Западный анализ помаркой. STAT3 (слева), Эрк (в центре) и контроля бета МИОЗИНА белков для представителя hPSC (линия Госкомсанэпиднадзором H9) в обычных (E8 средний) или LIF-3и/MEF условий (3i). (C) выражение наивного связанные плюрипотентности транскрипционных факторов. Изображены Стелла/DPPA3, NR5A2 и TFCP2L1, иммунофлюоресценции в представительных культуре LIF-3и/MEF (пуповинной крови производные hiPSC линии E5C3 p33 (Госкомсанэпиднадзором/MEF) + p8 (LIF-3и/MEF). Шкалы бар = 100 µm. (D) тератома анализов обычных и LIF-3i-отменены hPSC. Проверка функциональных плюрипотентности в isogenic представитель hiPSC линии (пуповинной крови производные E32C6) культивировали в любом E8 (p9) или LIF-3и/MEF (+ p12) путем анализа тератома. 10 х 106 клеток isogenic параллель культивированный обычных, загрунтованных против LIF-3i-вернулся hPSC были вводят подкожно в конечностях иммунодефицитных ГЯП мышей. Гематоксилином и эозином пятна тератома шлифов показал надежную дифференциация во всех трех зародышевых с хорошо структурированный эктодермы (нейронных розетка: NR, сетчатки пигментированной epitheliam: НПП), мезодермы (chondroblasts: Ch) и эндодермы (железистый ткани: GI) линий. Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Сравнения функциональных плюрипотентности между isogenic государствами загрунтовать и наивными. (A) схема стратегии для оценки функциональных плюрипотентности от плюрипотентных отдельных государств в isogenic обычных vs. hPSC LIF-3i культивировали в независимых дифференциация протоколы. Изображены две онко сосудистой прародитель дифференциации систем (Апель монослоя и 3D embryoid тело (EB) систем) которые ранее использовались для оценки дифференциации потенции обычных против LIF-3i-вернулась в одной и той же линии (isogenic) hPSC культивируемых в параллельные должности реверсии LIF-3i с одинаковыми номерами проход. LIF-3i-вернулся hPSC линий не требуют повторного грунтовки шаг до EB дифференциации и подвергаются дифференциации протокола непосредственно. (B) EB сосудистой Прародителя (VP) дифференциации системы. Система 3D дифференциации EB, используемая для этого исследования был ранее описанных17,18. Изображены представитель результаты на 10 день EB дифференциации (левой панели) для isogenic культур же пуповинной крови (CB)-производных E5C3 hPSC линии9, культивируемых в либо обычных Госкомсанэпиднадзором/MEF (ПРИМЕД / MEF) условий или наивно LIF-3и/MEF условий. Анализ потока цитометрии этих клеток EB показывают резкое увеличение CD31+CD146+ VP населения после LIF-3i реверсии линии E5C3 до дифференциации. Гистограмма отображает среднее болезни CD31+CD146+ VP ячейки проценты, восстановлены на 10 день в этой системе EB, используя три isogenic пар независимых hPSC линии (т.е. два CB-hiPSC и один взрослый фибробластов производные hiPSC, пунктирные линии соединяют isogenic пары). Результаты демонстрируют значительное улучшение эффективности VP дифференциации в системе EB через генетические стола несколько hPSC линий. (C) Апель монослоя сосудистой прародитель дифференциации системы. Обычные (загрунтовать E8) и LIF-3i-вернулся hPSC может быть непосредственно дифференцированное использование же культуры условия, факторы роста, цитокинов и малых молекул ступенчатой Апель эндотелиальной дифференцировки протокол 3, 16. показано являются независимыми Апель дифференциация эксперименты с использованием E5C3 пуповинной крови производные hiPSC линии и процент CD31+CD146+ сосудистого прародитель населения на 7 день Апель дифференциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LIF-3i система применяет модифицированную версию классической мышиных 2i наивно реверсии коктейль1 до человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Самообновлению hPSC (который не может расширить в одиночку 2i) стабилизируется в LIF-2i, дополняя этот коктейль с tankyrase ингибитор XAV939. LIF-3i культура позволяет навалом и эффективного reversion обычных hPSC плюрипотентных состояние, напоминающее человека Предимплантационная Эпибласт3. Хотя механизмы действия XAV939 в hPSC скорее всего комплекса и синергизма с 2i, они скорее всего включают в себя как минимум, важным стабилизации и увеличения hPSC самообновления через WNT, сигнальные пути3.

Обычные hPSC культур обычно принять спектра плюрипотентных государств с высоко вариабельные линии загрунтовать гена выражений и Эмбриональная Эпибласт эпигенетических меток, которые может привести к несогласованной или снижение функциональных плюрипотентности2 . Это неотъемлемое линии грунтование обычных hPSC культур может также столкнуться с успешным LIF-3i reversion некоторых hPSC линии2. Однако включение первого шага адаптации LIF-5i (Таблица 1) в методе LIF-3i универсально расширяет эффективности LIF-3i реверсии среди множества линий hPSC и способствует массовая наивно реверсии обычных hPSC линий в духе Это обходит утомительно комплектации и subcloning редких наивно отменены колоний, или необходимости использования рутинной анти apoptotic молекул для стабилизации их жизнеспособность.

Метод реверсии наивно LIF-5i/LIF-3i воспроизводимые в широкий спектр линий Госкомсанэпиднадзором и hiPSC. Она требует минимального обучения с мастерством культуры основных клеток. Циммерлин et al. успешно применяется эта последовательная стратегия вернуться > 30 независимых Госкомсанэпиднадзором и свободных трансген hiPSC линии от широкого круга доноров 3. Один проход в LIF-5i (рис. 1) является достаточным для большинства hPSC линий пройти эффективные наивно реверсии в массовых hPSC культур, и дальнейшего продвижения их последующего стабильное ведение и расширение в одиночку LIF-3i.

Кроме того, LIF-3и/MEF система поддерживает надежные массовых клоновых расширения эффективности на протяжении всех шагов между линии загрунтовать обычных hPSC культуры вплоть до реверсии завершенных наивно как hPSC (т.е., адаптация, перехода и расширения для 7 – 10 ходов в LIF-3и/MEF только). Хотя нынешняя формулировка этой культуры системы требует поддержки фидер, простой и доступный способ разрушающим питатели методом предварительного покрытия для анализа LIF-3i культур представлен (рис. 2).

Несколько другие культуры, которую систем сообщается также содействовать обычных hPSC для аналогичных наивно как pluripotent государств2. Хотя эти системы культуры hPSC также полагались на использование классической мыши наивно 2i условий, в большинстве случаев эти методы passaging одноклеточных также требуются дополнительные химические модуляции для стабилизации нестабильным / метастабильные наивного человека состояние. Важно отметить, что большинство из этих методов продемонстрировали нарушение функционального плюрипотентности после дифференциации и/или приобретенных ненормальных epigenomic отпечатки или получен2. Хотя появление аномальных получен в рамках обычных загрунтовать hPSC культур уже хорошо документально19, продлен, ферментативные одноклеточных пассированый методы, которые обычно используются в большинстве наивно реверсии методов. Это также было показано, потенцирует поколения аномальных хромосом конфигураций20,21; более чувствительные методы (например, копии номер вариации, полиморфизм) может выявить дополнительные изменения22,23.

В отличие от этого, широкий репертуар LIF-3i-вернулся hPSC линии были подтверждены обладают нормальных получен при низкой средней отрывки (например, p5-p15), а также на высокий проход цифры (например., > p30) после LIF-3i культуры3. Кроме того epigenomic отпечатки в LIF-3i-вернулся hPSC были найдены можно воспроизвести нормальной и нетронутыми на 5 – 10 отрывков пост LIF-3i реверсии2. Используя платформу массив чувствительных Аллел Специфически коммерческих метилирования, он был ранее продемонстрировал что знаки метилирования CpG на тисненой локусов широкий репертуар LIF-3i-вернулся hPSC линии (следующие 4 – 7 проходы в LIF-3i) были найдены быть грубо нормальные структуры1. Так как ненормальные геномной отпечатки и получен в конечном счете могут ухудшить функциональные возможности hPSC, предварительные руководящие принципы были изложены в настоящем Протоколе, который призывает исследователей для проверки hPSC культур до и после реверсии наивными, используя это метод, а также другие.

Усовершенствован метод LIF-3i функциональных плюрипотентности через зародышевых в большой репертуар Госкомсанэпиднадзором и hiPSC не трансгенных линий (рис. 3). В отличие от других наивной реверсии протоколов, метод LIF-3i не не требуют повторного грунтовки шаг для последующей дифференциации N-hPSC (т.е. преобразование N-hPSC обратно в обычных загрунтовать условий до их использования в направленных дифференциация анализов). LIF-3i-отменены N-hPSC отображения значительно эффективнее дифференциации возможностей чем их коллеги isogenic обычных hPSC в обоих тератома анализов (рис. 3D) и направлены дифференциация протоколы линий всех три зародышевых2. Вследствие анализа зависимых и интерлайн вариации в функциональное тестирование обычных hPSC, зависящие от линии разграничения должны оцениваться с использованием независимых направленного дифференцирования протоколы и hPSC, полученных от нескольких генетических стола. С помощью тщательного экспериментальный дизайн, широкий спектр hPSC линии можно ожидать значительно улучшить их эффективность мультилинейного дифференциации по сравнению с их isogenic обычных после 4 – 10 ходов в условиях LIF-3i.

В целом, этот метод быстро и клонально расширяет количество человека PSC, повышает эффективность их вниз по течению дифференциации, увеличение числа клеток линии, совершенные прародителю, после дифференциации, и уменьшает интерлайн изменчивость среди обычных, линии загрунтовать hPSC линии. Эти N-hPSC с улучшенной функциональностью далее могут иметь широкие последствия для их потенциальный вклад функциональных тканей для развивающегося эмбриона. Например стабильной N-Госкомсанэпиднадзором могут быть использованы для разработки человеческих органов, которые спасаютжизньпритрансплантации и взрослых стволовых клеток в развитии животного химер, или для создания гуманизированные целевых генов животных моделей болезни. Дальнейшей оптимизации этого tankyrase ингибитор использование метода LIF-3i в определенных фидер свободный GMP-совместимый культуры условия будут способствовать эффективной клинически полезным поколения широкий спектр типов функциональных и engraftable клеток для терапевтического использования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

В лицензионном соглашении между технологиями жизни и Джонс университета Хопкинса (УДХ) д-р ЗАМВИДИС имеет право на долю роялти, полученные в университете для лицензирования стволовых клеток. Условия этого соглашения находятся в ведении УДХ в соответствии со своей политикой конфликта интересов. Это не меняет приверженность авторов журнала политики по обмену данными и материалами.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантов от NIH/НЭЙ (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), ОБН Штайн Innovation Award, Фонд исследований стволовых клеток Мэриленд (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Ново Нордиск науки Форум награду и Мосли фонд.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203 (2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838 (2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

Tags

Биология развития выпуск 136 наивно плюрипотентности человеческих плюрипотентных стволовых клеток дифференциация ингибитирование tankyrase малые молекулы Эпибласт
Химическая Reversion обычных человеческих плюрипотентных стволовых клеток в наивно как состояние с более мультилинейного дифференциация потенции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, T. S., Zimmerlin, L.,… More

Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter